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    HPLC法測(cè)定地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷的含量*

    2023-11-28 13:08:54鄭雪媚蔣順進(jìn)劉宗新
    廣州化工 2023年13期
    關(guān)鍵詞:孢霉項(xiàng)下腺苷

    鄭雪媚,蔣順進(jìn),林 昊,劉宗新

    (1 廣東容大生物股份有限公司,廣東 清遠(yuǎn) 511500;2 清遠(yuǎn)一生自然生物研究院有限公司,廣東 清遠(yuǎn) 511500)

    地頂孢霉培養(yǎng)物是從野生蟲(chóng)草中分離得到的地頂孢霉菌株,通過(guò)人工發(fā)酵的方式生產(chǎn)出的一種新型綠色的飼料添加劑,富含腺苷、蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草多糖、蟲(chóng)草酸、甾醇等多種活性成分,被譽(yù)為動(dòng)物可以食用的“冬蟲(chóng)夏草”[1-2]。腺苷是一種嘌呤核苷,對(duì)動(dòng)物的心肌具有保護(hù)作用,其含量被用作蟲(chóng)草類(lèi)產(chǎn)品的質(zhì)控指標(biāo),因此建立完善準(zhǔn)確的質(zhì)量檢測(cè)方法是很有必要的[3]。本研究利用高效液相色譜法測(cè)定地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷的含量,旨在為地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷含量的測(cè)定及蟲(chóng)草類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控提供技術(shù)支撐。

    參照蟲(chóng)草制品中蟲(chóng)草素和腺苷的測(cè)定高效液相色譜法[4],根據(jù)腺苷的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),建立測(cè)定地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷含量的HPLC法。該方法具有定量檢測(cè)準(zhǔn)確度高、線(xiàn)性范圍廣、重現(xiàn)性好、分析時(shí)間短、樣品處理簡(jiǎn)單等特點(diǎn),為地頂孢霉培養(yǎng)物的質(zhì)量控制提供可靠的依據(jù)。

    1 實(shí) 驗(yàn)

    1.1 儀器和材料

    G7111AAgilent液相色譜儀;CTO-20AC柱溫箱;UPR-5T超純水儀;KQ-500DE超聲波清洗器;METTLER MS105DU天平;腺苷標(biāo)準(zhǔn)品(來(lái)源:中國(guó)食品藥品檢定研究院(含量99.4%));地頂孢霉培養(yǎng)物(來(lái)源:廣東容大生物股份有限公司提供),水為超純水(來(lái)源:廣東容大生物股份有限公司提供),乙腈(來(lái)源:科魯?shù)禄す煞萦邢薰?。

    1.2 色譜條件

    流動(dòng)相:乙腈-水(5∶95)為流動(dòng)相;

    色譜柱:菲羅門(mén) C185 μm,4.6 mm×250 mm;

    檢測(cè)波長(zhǎng):260 nm;

    流速:1.0 mL/min;

    柱溫:35 ℃;

    進(jìn)樣量:10 μL。

    1.3 溶液的配制

    1.3.1 對(duì)照品溶液的制備

    精密稱(chēng)取20 mg腺苷對(duì)照品,置200 mL容量瓶,加超純水至刻度,搖勻,精密移取上述溶液5 mL,置于100 mL容量瓶,加超純水至刻度,搖勻,過(guò)濾,即得。

    1.3.2 供試品溶液的制備

    精密稱(chēng)取1 g地頂孢霉培養(yǎng)樣品,置100 mL容量瓶,加適量超純水,超聲30 min后定容至刻度,搖勻,過(guò)濾,即得。

    1.4 陰性干擾測(cè)定

    以相同的處方比例,按照地頂孢霉培養(yǎng)物的制備工藝,制得地頂孢霉培養(yǎng)物的陰性制劑。取地頂孢霉培養(yǎng)物的陰性顆粒適量,按1.3.2項(xiàng)下制成地頂孢霉培養(yǎng)物陰性溶液。進(jìn)樣測(cè)試,結(jié)果陰性溶液無(wú)干擾。證明本方法用于腺苷的含量測(cè)定具有專(zhuān)屬性。

    圖1 腺苷對(duì)照品Fig.1 Adenosine reference

    圖2 地頂孢霉培養(yǎng)物陰性樣品Fig.2 Acremonium terricola culture negative sample

    圖3 地頂孢霉培養(yǎng)物樣品Fig.3 Sample of acremonium terricola culture

    1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

    表1 腺苷對(duì)照品溶液濃度及峰面積Table 1 Adenosine reference solution concentration and peak area

    精密稱(chēng)取腺苷對(duì)照品100.4 mg,置1 000 mL容量瓶中,加純化水至刻度使溶解,搖勻,作為對(duì)照品貯備液;分別移取對(duì)照品貯備液0.5、1、2、5、20、100 mL置100 mL容量瓶中,加純化水至刻度,搖勻,作為對(duì)照品溶液。對(duì)以上6種對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定。記錄色譜圖,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

    圖4 腺苷的線(xiàn)性關(guān)系圖Fig.4 Linear plot of adenosine

    以腺苷濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),見(jiàn)圖4。結(jié)果表明,在0.499 0~99.797 6 μg/mL范圍內(nèi),腺苷濃度與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系,其回歸方程為y=26.144x-1.811 9,R2=1。

    1.6 精密度試驗(yàn)

    精密稱(chēng)取腺苷對(duì)照品20.11 mg,按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含4.997 3 μg腺苷對(duì)照品溶液。連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖。結(jié)果見(jiàn)表2。

    表2 腺苷精密度試驗(yàn)Table 2 Adenosine precision test

    結(jié)果表明,腺苷峰面積RSD為0.3%,證明本方法的精密度良好。

    1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

    1.7.1 對(duì)照品溶液的制備

    精密稱(chēng)定腺苷對(duì)照品20.43 mg,按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含5.076 9 μg腺苷對(duì)照品溶液。

    1.7.2 供試品溶液的制備

    精密稱(chēng)定地頂孢霉培養(yǎng),按1.3.2項(xiàng)下制備供試品溶液,平行處理6份,進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表3。

    表3 腺苷含量測(cè)定重復(fù)性試驗(yàn)Table 3 Repeatability test for determination of adenosine content

    結(jié)果表明,腺苷含量RSD為0.2%,證明本測(cè)試方法重復(fù)性良好。

    1.8 回收率試驗(yàn)

    1.8.1 對(duì)照品母液的制備

    精密稱(chēng)取腺苷對(duì)照品20.17 mg,置200 mL棕色容量瓶中,加純化水至刻度使溶解,作為腺苷對(duì)照品母液。

    1.8.2 對(duì)照品溶液的制備

    取對(duì)照品母液5 mL,置100 mL容量瓶中,加純化水至刻度,搖勻,過(guò)濾,即得。

    精密稱(chēng)取已知含量的同一批地頂孢霉培養(yǎng)樣品約0.5 g(共9份)置于100 mL容量瓶中,分別加入上述對(duì)照品母液1.5 mL、2.5 mL、3.5 mL,加適量超純水,超聲30 min后定容至刻度,過(guò)濾,進(jìn)樣測(cè)定。進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖,結(jié)果見(jiàn)表4。

    表4 腺苷回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 4 Adenosine recovery test data

    結(jié)果顯示,腺苷回收率的平均值為98.70%,RSD值為0.8%,表明本方法回收率較好。

    1.9 腺苷測(cè)定方法的耐用性研究

    本試驗(yàn)考察色譜柱溫度、流速、波長(zhǎng)、不同品牌色譜柱及流動(dòng)相比例對(duì)地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷含量測(cè)定的影響。

    1.9.1 不同的色譜柱溫度

    對(duì)照品溶液的制備:精密稱(chēng)定腺苷對(duì)照品20.18 mg,按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含5.014 7 μg腺苷對(duì)照品溶液。

    供試品溶液的制備:取地頂孢霉培養(yǎng)物,按1.3.2項(xiàng)下制備地頂孢霉培養(yǎng)物供試品溶液。

    在其它色譜條件不變的情況下,色譜柱溫度分別設(shè)定為30、35、40 ℃,對(duì)同一樣品進(jìn)行含量測(cè)定,記錄峰面積,計(jì)算腺苷含量,結(jié)果見(jiàn)表5。

    表5 不同色譜柱溫度對(duì)腺苷含量測(cè)定的影響Table 5 Effects of different chromatographic column temperatures on the determination of adenosine content

    結(jié)果表明,色譜柱溫度的微小變化對(duì)腺苷含量測(cè)定無(wú)明顯影響。

    1.9.2 不同的流速

    (1)對(duì)照品溶液的制備

    精密稱(chēng)定腺苷對(duì)照品20.20 mg,按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含5.019 7 μg腺苷對(duì)照品溶液。

    (2)供試品溶液的制備

    取地頂孢霉培養(yǎng)物,按1.3.2項(xiàng)下制備地頂孢霉培養(yǎng)物供試品溶液。

    在其它色譜條件不變的情況下,流動(dòng)相流速分別設(shè)定為0.8、1.0、1.2 mL/min,對(duì)同一樣品進(jìn)行含量測(cè)定,記錄峰面積,計(jì)算腺苷含量,結(jié)果見(jiàn)表6。

    表6 不同流動(dòng)相速度對(duì)腺苷含量測(cè)定的影響Table 6 Effect of the velocity of different mobile phases on the determination of adenosine content

    結(jié)果表明,流動(dòng)相速度的微小變化對(duì)腺苷含量測(cè)定無(wú)明顯影響。

    1.9.3 不同的色譜柱

    (1)對(duì)照品溶液的制備

    精密稱(chēng)定腺苷對(duì)照品20.41 mg,按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含5.071 9 μg腺苷對(duì)照品溶液。

    (2)供試品溶液的制備:

    取地頂孢霉培養(yǎng)物,按1.3.2項(xiàng)下制備地頂孢霉培養(yǎng)物供試品溶液。

    在其它色譜條件不變的情況下,使用不同的色譜柱,對(duì)同一樣品進(jìn)行含量測(cè)定,記錄峰面積,計(jì)算腺苷含量,結(jié)果見(jiàn)表7。

    表7 不同品牌色譜柱對(duì)腺苷含量測(cè)定的影響Table 7 Effect of different brands of chromatographic columns on the determination of adenosine content

    結(jié)果證實(shí),不同品牌色譜柱對(duì)腺苷的含量測(cè)定無(wú)明顯影響。

    1.9.4 不同的測(cè)定波長(zhǎng)

    (1)對(duì)照品溶液的制備

    精密稱(chēng)定腺苷對(duì)照品20.25 mg,按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含5.032 1 μg腺苷對(duì)照品溶液。

    (2)供試品溶液的制備:

    取地頂孢霉培養(yǎng)物,按1.3.2項(xiàng)下制備地頂孢霉培養(yǎng)物供試品溶液。

    在其它色譜條件不變的情況下,測(cè)定波長(zhǎng)分別設(shè)定為257、258、259、260、261、262、263 nm,對(duì)同一樣品進(jìn)行含量測(cè)定,記錄峰面積,計(jì)算腺苷含量,結(jié)果見(jiàn)表8。

    表8 不同測(cè)定波長(zhǎng)對(duì)腺苷含量測(cè)定的影響Table 8 Effect of different determination wavelengths on the determination of adenosine content

    結(jié)果表明,測(cè)定波長(zhǎng)的微小變化對(duì)腺苷含量測(cè)定無(wú)明顯影響。

    1.9.5 不同的流動(dòng)相比例

    (1)對(duì)照品溶液的制備

    精密稱(chēng)定腺苷對(duì)照品20.63 mg,按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含5.126 6 μg腺苷對(duì)照品溶液。

    (2)供試品溶液的制備

    表9 不同流動(dòng)相比例對(duì)腺苷含量測(cè)定的影響Table 9 Effect of the proportions of different mobile phases on the determination of adenosine content

    取地頂孢霉培養(yǎng)物,按1.3.2項(xiàng)下制備地頂孢霉培養(yǎng)物供試品溶液。

    在其他色譜條件不變的情況下,流動(dòng)相乙腈-水比例分別設(shè)定為2.5∶97.5、5∶95、7.5∶92.5,對(duì)同一樣品進(jìn)行含量測(cè)定,記錄峰面積,計(jì)算腺苷含量,結(jié)果見(jiàn)表9。

    結(jié)果表明,流動(dòng)相比例的微小變化對(duì)腺苷含量測(cè)定無(wú)明顯影響。

    小結(jié):采用本方法能準(zhǔn)確測(cè)定地頂孢霉培養(yǎng)物中的腺苷的含量,方法的耐用性較好。

    2 結(jié) 論

    徐娟娟等[5]建立了測(cè)定地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷含量的高效液相色譜法,該方法對(duì)地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷含量檢測(cè)方法的波長(zhǎng)、線(xiàn)性、精密度、回收率等進(jìn)行了研究,在此基礎(chǔ)上,本方法增加了專(zhuān)屬性、耐用性(色譜柱溫度、流速、波長(zhǎng)、不同品牌色譜柱及流動(dòng)相比例對(duì)地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷含量測(cè)定的影響)等的研究。劉書(shū)余等[6]建立了同時(shí)測(cè)定地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷、蟲(chóng)草素和麥角甾醇含量的高效液相色譜法,但該方法采用梯度洗脫,分析時(shí)間較長(zhǎng)。本研究建立了HPLC法測(cè)地頂孢霉培養(yǎng)物中腺苷的含量,測(cè)定色譜條件為:以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動(dòng)相為乙腈-水(5∶95);檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。本方法定量檢測(cè)準(zhǔn)確度高、線(xiàn)性范圍廣、重現(xiàn)性好、分析時(shí)間短、樣品處理簡(jiǎn)單,為地頂孢霉培養(yǎng)物質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

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