BRE-AS啟動子負調控區(qū)變異與啟動子活性、母豬繁殖力的關系

王楊,王苗苗,單保森,吳望軍,杜星,李齊發(fā)

(南京農業(yè)大學動物科技學院,江蘇 南京 210095)

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)作為一類轉錄本長度超過200個核苷酸(nt)的功能性RNA分子,通常被認為不具備編碼蛋白的能力,而是以RNA的形式在轉錄和轉錄后水平上調控基因的表達［1-3］。依據基因組上與鄰近蛋白編碼基因的位置關系,可將lncRNA分為同義lncRNA(SS-lncRNA)、反義lncRNA(AS-lncRNA)、雙向型lncRNA(BD-lncRNA)、基因間lncRNA(LincRNA)和內含子lncRNA(IT-lncRNA)等［1］。隨著高通量測序技術的應用,哺乳動物中越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn),其功能也被注釋,lncRNA在哺乳動物許多生理和病理過程中的重要調控作用也逐漸引起人們的關注［4］。在雌性生殖系統(tǒng)中,lncRNA在多種相關組織(如下丘腦、垂體、卵巢和子宮等)中分布,通過多種機制參與卵泡發(fā)育、卵母細胞成熟、排卵、妊娠和胚胎發(fā)育等多個生殖過程的調控［5］。例如,在人卵巢顆粒細胞(granulosa cell,GC)中高表達的HLA復合群26(lncRNAHCG26)表達水平與卵泡數有關,敲減HCG26可抑制GC增殖和細胞周期進程,同時影響芳香化酶基因的表達和雌二醇的生成［6］;小鼠卵中l(wèi)ncRNA類固醇受體RNA激活劑(SRA)能夠刺激GC的生長,增加雌激素和孕激素水平［7］;在豬閉鎖卵泡中高度表達的lncRNANORHA能夠通過miR-183簇/FoxO1軸誘導GC凋亡［8］。此外,lncRNA H19印記母源表達轉錄本(H19)被證實是影響胚胎發(fā)育的主要調節(jié)因子,可通過調節(jié)miR-675的加工來抑制胎盤發(fā)育［9］,其失調會引起孕酮生成異常［10］,引起胎兒生長［11］以及妊娠［12］中相關疾病的發(fā)生;Mira通過將Mll1募集到染色質來激活小鼠胚胎干細胞中同源框A6(Hoxa6)和同源框A7(Hoxa7)的轉錄,對胚胎早期發(fā)育至關重要［13］;小鼠卵母細胞特異性表達lncRNA(Rose)在卵母細胞胞質分裂和早期胚胎發(fā)育的母源-合子轉換(maternal-zygotic transition,MZT)中具有重要的調節(jié)作用［14］。這些結果均表明 lncRNA在卵泡發(fā)育和雌性生殖中具有重要作用。

不斷改善和提高家畜的生產性能是家畜育種的根本目標,而篩選與家畜生產性能有關的重要經濟性狀的候選基因和遺傳標記對于加快實現(xiàn)育種目標具有重要意義。雖然目前鑒定的影響家畜重要經濟性狀的候選基因基本都是蛋白編碼基因,但研究證實lncRNA在家畜重要經濟性狀相關的細胞功能中也發(fā)揮與蛋白編碼基因相似的功能,如lncRNA肌肉生長促進因子(lncMGPF)與豬產肉性狀候選基因Ⅰ類肌球蛋白(MyoD)(前者是后者的靶標)均可誘導肌細胞的肌源性分化［15］,與卵泡閉鎖相關lncRNA(NORFA)和母豬繁殖性狀候選基因轉化生長因子β受體2(TGFBR2)(后者是前者的靶標)均可抑制GC凋亡［16］,因此可以看出lncRNA也可以作為家畜重要經濟性狀的潛在候選基因。Lv等［15］以lncMGPF為潛在候選基因,在美系大白豬lncMGPF基因中發(fā)現(xiàn)10個單核苷酸多態(tài)性(SNP),這些SNP均與產肉性狀(背膘厚和眼肌面積)顯著關聯(lián),證實lncMGPF是影響豬產肉性狀的關鍵lncRNA基因。Du等［16］以NORFA為潛在候選基因,利用DNA混池測序法在豬NORFA基因中發(fā)現(xiàn)6個變異位點,其中啟動子19 bp序列拷貝變異表現(xiàn)出品種特異性,在高繁殖力豬種(二花臉豬)中為雙拷貝,在國外引進豬種大白豬和長白豬中為單拷貝,認為NORFA是影響高繁殖力性狀的候選lncRNA基因。但目前發(fā)現(xiàn)的影響家畜重要經濟性狀的候選lncRNA基因較少。本課題組前期研究證實lncRNABRE-AS是豬卵泡閉鎖和GC凋亡的重要調節(jié)因子［17］,且位于母豬繁殖性狀的QTL(quantitative trait locus)內。因此,本試驗擬以BRE-AS為潛在候選基因,采用DNA測序法分離其啟動子負調控區(qū)(PNRR)序列、篩選SNP,采用一般線性模型(GLM)分析SNP與大白豬繁殖性狀之間的關系,采用熒光素酶報告系統(tǒng)分析其機制,評估BRE-AS作為母豬繁殖性狀候選lncRNA基因的可行性,以期為母豬繁殖性狀的分子育種提供遺傳標記。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

用于基因組DNA提取、基因分型及與繁殖性狀關聯(lián)分析的315份大白母豬耳組織樣來自常州康樂農牧有限公司種豬場,詳細記錄每頭母豬的繁殖性能?；蚪M DNA的提取采用常規(guī)的酚/氯仿抽提法。

1.2 引物設計、PCR擴增、測序和生物信息學分析

根據本課題組前期分離的豬BRE-AS基因5′調控區(qū)序列和鑒定的PNRR［17］,利用Primer Premier 5.0軟件設計擴增大白豬BRE-AS基因PNRR序列的引物P1和P2(表1)。PCR反應體系和反應程序見文獻［18］。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后委托生工生物工程(上海)公司測序。從GenBank數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)獲取杜洛克豬基因組中的目標序列。利用JASPAR(http://jaspar.genereg.net/)預測潛在的轉錄因子結合位點,利用miRDB((http://mirdb.org/)預測序列中潛在的miRNA結合位點。

表1 豬BRE-AS基因啟動子擴增的引物序列Table 1 Sequences of the primers for amplification of the promoter of the porcine BRE-AS gene

1.3 SNP的篩選、分型與關聯(lián)分析

將16頭大白豬基因組 DNA 等量混勻,構建 DNA 池。以池 DNA 為模板,利用表1中的引物進行PCR擴增。擴增產物經檢測合格后委托生工生物工程(上海)公司測序,篩選SNP。利用DNA測序法對每頭母豬進行分型。根據文獻［19］中的方法計算基因型頻率等參數,進行哈代-溫伯格平衡檢驗和關聯(lián)分析。

1.4 載體的構建、細胞培養(yǎng)與轉染

不同單倍體型PNRR熒光素酶報告載體由南京擎科生物科技有限公司合成。將液氮罐中儲存的人GC系(KGN)取出,放入水浴鍋中,37 ℃復蘇55 min,再置于15 mL滅菌的離心管中,常溫下1 000 r·min-1離心5 min,然后接種于含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)的T25瓶內,置于5% CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)中培養(yǎng)。待細胞長至鋪滿瓶壁約90%時,用胰蛋白酶消化2 min,加入等量1640培養(yǎng)基并終止消化,轉移至15 mL離心管,離心后棄上清液,再用1640培養(yǎng)基重懸,均勻接種12孔細胞培養(yǎng)板。待細胞量長滿約90%時,用Highgene試劑(ABclonal公司)轉染報告載體。

1.5 熒光素酶活性分析

細胞轉染24 h后,使用100 μL Passive Lysis Buffer裂解液(Vazyme公司)裂解細胞。在避光條件下,用酶標儀(Bio-Tek公司)測量每個樣品的螢火蟲熒光和海腎熒光并計算兩者的比值。

1.6 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 大白豬BRE-AS基因PNRR擴增與序列分析

大白豬BRE-AS基因PNRR序列長度為792 bp,與參考基因組(杜洛克豬)相應序列的一致性為100%(圖1-A、B)。大白豬BRE-AS基因PNRR序列由31.4%的堿基A、26.1%的堿基T、22.2%的堿基G和20.3%的堿基C組成。用JASPAR在線網站預測發(fā)現(xiàn)豬BRE-AS基因PNRR含有多個潛在的轉錄因子(如OTX2、ASCL1、LIN54和MXI1等)結合元件,用miRDB在線工具預測到多個潛在的miRNA(如miR-466、miR-4533和miR-6165等)結合元件(圖1-B)。

圖1 豬BRE-AS基因PNRR序列Fig.1 Sequence of the porcine BRE-AS PNRR A. 豬BRE-AS基因PNRR結構示意圖Schematic diagram of the porcine BRE-AS PNRR;B. 豬BRE-AS基因PNRR序列Sequence of the porcine BRE-AS PNRR. 加粗堿基為順式作用元件The bold bases indicate cis-acting elements.

2.2 大白豬BRE-AS基因PNRR上SNP篩選與多態(tài)性分析

2.2.1 SNP篩選利用DNA混池(n=16)測序法篩選大白豬BRE-AS基因PNRR上的SNP,結果發(fā)現(xiàn)共有2個SNP,分別是位于-794 nt處的T>G單堿基突變和位于-756 nt處的A>C單堿基突變。根據規(guī)則將這2個SNP分別命名為g.-794T>G位點和g.-756A>C位點。

2.2.2 g.-794T>G位點多態(tài)性分析利用DNA測序法對大白豬群體(n=315)g.-794T>G位點進行了基因分型,結果發(fā)現(xiàn)3種基因型,分別為TT、TG和GG型,其中TT型為優(yōu)勢基因型,基因型頻率為0.752(圖2-A、B)。等位基因頻率計算結果顯示,T為優(yōu)勢等位基因,等位基因頻率為0.863(圖2-C)?？ǚ綑z驗顯示大白豬群體g.-794T>G位點的基因型分布符合哈代-溫伯格平衡定律(P>0.05)。

圖2 大白豬BRE-AS基因PNRR上SNP多態(tài)性分析Fig.2 Polymorphism analysis of SNP in BRE-AS PNRR of Yorkshire pigs A—C. g.-794T>G位點不同基因型峰圖(A)、基因型頻率(B)和等位基因頻率(C)Peaks(A),genotype frequency(B)and allele frequency(C)of different genotypes for SNP g.-794T>G;D—F. g.-756A>C位點不同基因型峰圖(D)、基因型頻率(E)和等位基因頻率(F)Peaks(D),genotype frequency(E)and allele frequency(F)of different genotypes for SNP g.-756A>C.

2.2.3 g.-756A>C位點多態(tài)性分析在大白豬群體(n=315)中g.-756A>C位點也存在3種基因型,即AA、AC和CC型,其中AA型為優(yōu)勢基因型,基因型頻率為0.759(圖2-D、E);A為優(yōu)勢等位基因,等位基因頻率為0.868(圖2-F)。大白豬群體g.-756A>C位點的基因型分布也符合哈代-溫伯格平衡定律(P>0.05)。

2.3 大白豬BRE-AS基因PNRR上SNP多態(tài)性與母豬繁殖性狀關聯(lián)分析

2.3.1 g.-794T>G位點多態(tài)性與母豬繁殖性狀關聯(lián)分析為了研究BRE-AS基因g.-794T>G位點變異與母豬繁殖性狀的關系,利用GLM模型分別對g.-794T>G位點多態(tài)性與大白豬群體6個繁殖性狀等進行了關聯(lián)分析。如圖3-A所示:g.-794T>G位點多態(tài)性與大白豬總產仔數(TNB)、產活仔數(NBA)和健仔數(NSP)等性狀顯著關聯(lián)(P<0.05),其中TT型母豬TNB、NBA和NSP均顯著高于GG型母豬(P<0.05)。其他性狀各基因型間無顯著差異(P>0.05)。這些結果說明BRE-AS是大白豬TNB、NBA和NSP等繁殖性狀的候選基因。

圖3 BRE-AS基因PNRR上g.-794T>G突變(A)和g.-756A>C突變(B)與大白豬繁殖性狀關聯(lián)分析Fig.3 Association analysis of the g.-794T>G mutation(A)and g.-756A>C mutations(B) in BRE-AS PNRR with Yorkshire pigs TNB:總產仔數Total number of piglets born;NBA:產活仔數Number of piglets born alive;NSP:健仔數Number of strong pigs;NWP:弱仔數Number of weak pigs;NSB:死胎數Number of stillborn;LW:出生窩重Litter weight.不同大小寫字母分別表示差異極顯著(P<0.01)和差異顯著(P<0.05)。下同。Significant differences among the groups are indicated by different uppercase letters(P<0.01)or lowercase letters (P<0.05). The same below.

2.3.2 g.-756A>C位點多態(tài)性與母豬繁殖性狀關聯(lián)分析BRE-AS基因g.-756A>C位點多態(tài)性與大白豬群體6個繁殖性狀關聯(lián)分析結果如圖3-B所示。BRE-AS基因g.-756A>C位點多態(tài)性與大白豬TNB、NBA和NSP這3個繁殖性狀間極顯著關聯(lián)(P<0.01),其中AA型母豬的TNB、NBA和NSP極顯著高于CC型母豬(P<0.01),AC型母豬的TNB極顯著高于CC型母豬(P<0.01),NBA和NSP顯著高于CC型母豬(P<0.05)。其他性狀各基因型間無顯著差異(P>0.05)。這些結果進一步說明BRE-AS是大白豬TNB、NBA和NSP等繁殖性狀的候選基因。

2.4 大白豬BRE-AS基因PNRR上SNP合并基因型與母豬繁殖性狀的關聯(lián)分析

2.4.1 SNP位點單倍型分析對BRE-AS基因PNRR上SNP(g.-794T>G和g.-756A>C)進行聯(lián)合分析,結果在大白豬群體中發(fā)現(xiàn)3種合并基因型(TT/AA、TG/AC和GG/CC型),其中TT/AA型為優(yōu)勢合并基因型,合并基因型頻率為0.760(圖4-A)。此外,在大白豬群體中共發(fā)現(xiàn)2種單倍型,T-A型和G-C型,其中T-A型是優(yōu)勢單倍型,單倍體型頻率為0.869(圖4-B)。

圖4 大白豬BRE-AS基因PNRR上SNP合并基因型與大白豬繁殖性狀的關聯(lián)分析Fig.4 Association analysis between combined genotype for SNP in BRE-AS PNRR and reproductive traits in Yorkshire pigs A.合并基因型頻率Frequency of combined genotypes;B.單倍型頻率Haplotype frequency;C.合并基因型與繁殖性狀的關聯(lián)分析Association analysis between the combined genotypes and reproductive traits.

2.4.2 合并基因型與母豬繁殖性狀關聯(lián)分析關聯(lián)分析結果如圖4-C所示:BRE-AS基因PNRR上2個SNP合并基因型與大白豬TNB、NBA和NSP等繁殖性狀顯著或極顯著關聯(lián),其中TT/AA型和GT/CA型母豬的TNB極顯著高于GG/CC型母豬(P<0.01);TT/AA型母豬的NBA極顯著高于GG/CC型母豬(P<0.01),GT/CA型母豬的NBA顯著高于GG/CC型母豬(P<0.05);TT/AA型母豬的NSP顯著高于GG/CC型母豬(P<0.05);其他性狀間無顯著差異(P>0.05)。

2.5 PNRR上SNP對BRE-AS啟動子活性的影響

為了分析豬BRE-AS基因PNRR上SNP是否通過調控啟動子活性來影響大白豬繁殖性能,本試驗構建了BRE-AS基因SNP(g.-794T>G和g.-756A>C位點)的2種單倍體型PNRR熒光素酶報告載體pGL3-T-A和pGL3-G-C(圖5-A)。將空載 pGL3-basic 和 pGL3-T-A、pGL3-G-C分別與pRL-TK共轉KGN細胞。結果(圖5-B)發(fā)現(xiàn),pGL3-G-C的熒光素酶活性極顯著高于pGL3-T-A(P<0.01),說明BRE-AS基因PNRR上SNP影響豬GC中促凋亡因子BRE-AS的轉錄活性。

圖5 PNRR上SNP對BRE-AS啟動子活性的影響Fig.5 The effect of SNP in PNRR on BRE-AS promoter activity A.2個單倍型PNRR報告載體示意圖Schematic diagram of reporter vectors of PNRR with different haplotypes;B.熒光素酶活性Luciferase activity.**P<0.01.

3 討論

SNP主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性,與基因表達、功能、表型和疾病等有關［20］。在畜牧領域,許多重要功能基因上的SNP被證實與畜禽重要經濟性狀有關,成為畜禽重要經濟性狀分子育種(如標記輔助選擇育種、基因組選擇育種和基因編輯育種等)的遺傳標記。例如,美利奴羊胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)基因第3外顯子c.654G>A位點多態(tài)性與生長、體型、屠宰和肉質性狀顯著關聯(lián)［21］;蘇淮豬骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(BMP7)基因3′-UTR上c.*273A>G位點多態(tài)性與母豬產仔數性狀顯著關聯(lián)［22-23］;揚州鵝泛素羧基末端水解酶L1(UCHL1)基因啟動子c.-652C>T位點多態(tài)性與生長性狀顯著關聯(lián)［24］。但目前鑒定的與畜禽重要經濟性狀顯著關聯(lián)的SNP絕大多數都位于蛋白編碼基因上,而非編碼基因上的極少。本文在本實驗室前期證實BRE-AS為豬卵泡閉鎖和GC凋亡的重要功能AS-lncRNA的基礎上,在其PNRR上鑒定2個與母豬繁殖性狀(包括TNB、NBA和NSP)顯著關聯(lián)的SNP(g.-794T>G和g.-756A>C),進一步證實BRE-AS是母豬繁殖性狀的候選基因。此前鑒定的影響母豬繁殖力的候選lncRNA只有NORFA［16］。另外,在其他畜禽lncRNA上還發(fā)現(xiàn)了一些與重要經濟性狀關聯(lián)的SNP,如Yu等［25］發(fā)現(xiàn)lncRNA母系表達基因3(MEG3)基因4個SNP與豬肉質性狀顯著關聯(lián);Mi等［26］發(fā)現(xiàn)lncRNA祖細胞更新相關非編碼RNA(PRANCR)上的1個A>G突變與奶牛金黃色葡萄球菌乳腺炎抗性性狀顯著關聯(lián);Mei等［27］發(fā)現(xiàn)lncRNApouBW1基因啟動子n.830G>A與雞的生長性狀顯著關聯(lián);Li等［28］發(fā)現(xiàn)lncRNA肝臟甘油三酯合成調節(jié)因子(LTR)上c.242G>A與雞生長和胴體性狀顯著相關?？傊?占基因組序列98%以上的非編碼區(qū)正在逐漸成為畜禽重要經濟性狀遺傳標記挖掘的熱點目標區(qū)域。

畜禽重要經濟性狀相關的關鍵功能基因5′-調控區(qū)上的SNP往往通過調節(jié)基因的轉錄活性來發(fā)揮作用［29］。Wang等［24］發(fā)現(xiàn)與鵝生長性狀顯著關聯(lián)的c.-652C>T突變增強UCHL1基因的啟動子活性。骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1B(BMPR1B)基因第1內含子中與母豬繁殖性狀顯著關聯(lián)的4個SNP組成的單倍型中,二花臉豬特異的單倍型調控區(qū)活性顯著高于杜洛克豬特異的單倍型［30］。5′調控區(qū)SNP影響基因轉錄活性,一般通過改變轉錄因子與其結合位點的結合親和力來實現(xiàn)［31-32］。Du等［16］在二花臉豬lncRNANORFA啟動子中檢測到的雙拷貝19 bp序列,主要通過募集更多轉錄因子核因子I X(NFIX)來增強GC中NORFA的轉錄活性;Zheng等［33］利用GWAS方法鑒定了奶牛乳脂性狀的一個重要的候選基因核糖體蛋白L8(RPL8),發(fā)現(xiàn)啟動子g.-931G>T突變通過影響轉錄因子Pax6和RPL8啟動子上結合位點的互作來改變RPL8基因的轉錄活性。本研究發(fā)現(xiàn),PNRR上g.-794T>G和g.-756A>C變異可引起GC中l(wèi)ncRNABRE-AS基因轉錄活性的改變,其中T-A單倍型啟動子活性低于G-C單倍型,這與TT/AA基因型母豬繁殖力高于GG/CC母豬型母豬,以及本實驗室前期證實lncRNABRE-AS是母豬繁殖力限制因子［14］等結果是一致的。但本文并未檢測到BRE-AS基因PNRR上SNP可引起雌性生殖相關的轉錄因子結合位點的改變,因此關于SNP影響B(tài)RE-AS啟動子活性的機制還有待于進一步研究。

總之,本試驗獲得了大白豬lncRNABRE-AS基因PNRR序列,發(fā)現(xiàn)了2個與母豬繁殖性狀(如TNB、NBA和NSP等)顯著關聯(lián)的SNP g.-794T>G和g.-756A>C,初步闡明了2個SNP影響母豬繁殖力的分子機制(增強母豬繁殖力抑制因子BRE-AS的轉錄活性)。結合前期功能研究結果［17］,證實BRE-AS是第2個被發(fā)現(xiàn)的影響母豬繁殖性狀的功能lncRNA,而鑒定出的2個SNP(g.-794T>G和g.-756A>C)均可作為母豬繁殖性狀分子育種的潛在遺傳標記。