不同綿羊品種發(fā)情期卵巢組織lncRNA和mRNA的差異表達(dá)分析

楊帆,姚曉磊,李康,李曉丹,唐輪,尤佩華,蔡慶賢,王鋒*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.廣西大化瑤族自治縣畜牧管理站,廣西 大化 530800;3.江蘇波杜農(nóng)牧股份有限公司,江蘇 南京 211800)

綿羊作為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,能夠提供肉、奶、纖維等優(yōu)質(zhì)的農(nóng)畜產(chǎn)品［1］。雖然我國(guó)綿羊品種資源豐富,但絕大部分表現(xiàn)為產(chǎn)羔率低、季節(jié)性發(fā)情,規(guī)模化舍飼的快速發(fā)展對(duì)種羊繁殖性能提出了更高的要求。因此,選育優(yōu)良品種,提高綿羊繁殖力,一直是綿羊育種的關(guān)鍵。湖羊和小尾寒羊是我國(guó)優(yōu)良的多胎綿羊品種,湖羊更是以性早熟、全年發(fā)情以及高繁殖力而聞名［2-3］。蒙古羊和陶賽特羊作為地方性品種,具有適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)肉性能高等特點(diǎn),但其繁殖力較低［4］。因此,開(kāi)展綿羊不同品種間繁殖力差異的研究顯得尤為重要。

綿羊的多胎性或高繁殖力現(xiàn)象早就引起科學(xué)界的高度重視,并已經(jīng)成功鑒定出多個(gè)綿羊繁殖力相關(guān)基因BMPR1B［5］(骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1B)、GDF9［6］(生長(zhǎng)分化因子9)、BMP15［7］(骨形態(tài)發(fā)生蛋白15)和B4GALNT2［8］(β-1,4-N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶2)等,但數(shù)量還較為有限。湖羊和小尾寒羊是我國(guó)少有攜帶多胎主效基因FecB(fecundity booroola)的綿羊品種。但在實(shí)際生產(chǎn)中,攜帶純合FecB基因的湖羊也存在產(chǎn)單羔現(xiàn)象,這種差異表明FecB與多胎性之間可能存在其他調(diào)控機(jī)制。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)作為一種新的表觀遺傳調(diào)控分子,在家畜繁殖中直接或間接參與基因調(diào)控過(guò)程。為揭示lncRNA對(duì)哺乳動(dòng)物繁殖力的調(diào)控機(jī)制,研究者圍繞不同繁殖力母羊的下丘腦-垂體-卵巢-子宮軸開(kāi)展了相關(guān)研究［9-13］。鄭健等［14］對(duì)單多羔湖羊下丘腦進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,發(fā)現(xiàn)下丘腦中神經(jīng)信號(hào)傳遞通路和γ-氨基丁酸信號(hào)通路可能間接調(diào)控卵泡發(fā)育及排卵過(guò)程。從高、低繁綿羊垂體的lncRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中篩選到SMAD2(SMAD家庭成員2)、NMB(神經(jīng)介素B)和EFNB3(肝配蛋白B3)等與繁殖相關(guān)的基因［15］。此外,在不同繁殖力湖羊卵巢的研究中,卵泡發(fā)育相關(guān)lncRNA FDNCR,可吸附顆粒細(xì)胞中的miR-543-3p,并阻止miR-543-3p與核心蛋白聚糖(DCN)基因的3′UTR區(qū)域結(jié)合,導(dǎo)致湖羊DCN基因轉(zhuǎn)錄激活和TGF-β通路抑制［16］。同時(shí),研究者以發(fā)情期不同繁殖力的寒泊羊［17］、小尾寒羊與陶賽特［18-19］、安徽白山羊［20］卵巢為對(duì)象,通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)后均獲得一定數(shù)量與繁殖相關(guān)的差異lncRNA。也有研究者發(fā)現(xiàn)lncRNA還參與綿羊卵巢［21］、睪丸［22］發(fā)育及初情期啟動(dòng)［11］等過(guò)程。以上研究表明,lncRNA在調(diào)控肉羊繁殖性能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而,上述研究大多數(shù)側(cè)重于篩選同一品種不同繁殖力綿羊之間的差異lncRNA,而關(guān)于不同綿羊品種之間的研究相對(duì)較少。

本研究選取地方特色綿羊品種湖羊(HBB)和蒙古羊(Mon)為研究對(duì)象,在發(fā)情期采集卵巢組織進(jìn)行RNA-seq,再結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的小尾寒羊(HanBB)和陶賽特羊(Dorset)發(fā)情期卵巢數(shù)據(jù),比較分析不同綿羊品種發(fā)情期卵巢中差異表達(dá)的lncRNA和mRNA,構(gòu)建mRNA-mRNA和lncRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),篩選關(guān)鍵基因并探究其表達(dá)規(guī)律,為綿羊繁殖調(diào)控及育種分子標(biāo)記提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)于江蘇省泰州市姜堰某羊場(chǎng)進(jìn)行,根據(jù)生產(chǎn)記錄選擇2～3歲體況相近、生殖生理狀態(tài)相似的空懷湖羊［(49.99±1.40)kg］4只。同時(shí),選擇相同條件的空懷蒙古羊［(45.30±4.83)kg］4只。試驗(yàn)羊只每天08:00、18:00飼喂全混合(TMR)日糧,自由飲水。

1.2 試驗(yàn)材料

綿羊促卵泡激素(FSH)和促黃體生成素(LH)ELISA試劑盒(DRE-S0622c,DRE-S5741c)均購(gòu)自上?？ㄟ~舒生物科技有限公司;Trizol試劑盒購(gòu)自Invitrogen;反轉(zhuǎn)錄試劑盒(R323-01)和熒光定量試劑盒(Q711-02)均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司;即用型免疫組化試劑盒(abs957)購(gòu)自上海愛(ài)必信生物科技有限公司;基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)抗體(WL03224)購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

蒙古羊和湖羊各4 只,于11月份采用單欄方式飼養(yǎng),于第1天18:00放拴處理,11 d后撤拴并注射氯前列烯醇,每只0.2 mg。次日用公羊試情,接受公羊爬跨視為發(fā)情。到下一次自然發(fā)情時(shí),頸靜脈密集連續(xù)采血,每12 min 1次,連續(xù)采集3 h,分離血清后置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。采血后隨機(jī)挑選蒙古羊和湖羊各3 只進(jìn)行屠宰,分別采集下丘腦、垂體、卵巢、子宮、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等組織樣,單側(cè)發(fā)育較好的卵巢放入液氮用于后續(xù)RNA-seq,另一側(cè)卵巢以及垂體和子宮組織用布氏固定液固定,用于后續(xù)免疫組化檢測(cè)。其余組織樣經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 生殖激素的測(cè)定對(duì)上述置于-20 ℃的血清進(jìn)行FSH和LH含量測(cè)定,試驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照FSH和LH ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.2 總RNA提取及建庫(kù)利用Trizol法對(duì)蒙古羊和湖羊全身組織提取總RNA。卵巢RNA的質(zhì)量測(cè)定、文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序交由北京百邁客生物科技有限公司采用Illumina HiSeqTM2500 系統(tǒng)進(jìn)行。同時(shí),小尾寒羊(GSM2883548、GSM2883549、GSM2883550)和陶賽特羊(GSM2883554、GSM2883555、GSM2883556)的測(cè)序原始數(shù)據(jù)下載于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.4.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析對(duì)測(cè)序的原始數(shù)據(jù)(raw reads)進(jìn)行過(guò)濾,使用HISAT2軟件將質(zhì)控后序列(clean reads)與綿羊基因組(oar_v4.0)進(jìn)行序列比對(duì),獲得clean reads在綿羊基因組上的位置信息(mapped reads)以及湖羊卵巢組織特有序列信息;使用StringTie軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄本和基因表達(dá)量進(jìn)行分析;同時(shí)利用StringTie軟件將mapped reads進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本拼接,以此對(duì)lncRNA進(jìn)行鑒定。鑒定lncRNA包括篩選和潛在編碼能力分析,選擇長(zhǎng)度 ≥ 200 bp,exon數(shù) ≥ 2,FPKM(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)≥ 0.1的轉(zhuǎn)錄本和利用CPC、CNCI、CPAT和PFAM等4種編碼潛能的分析方法評(píng)估lncRNA;使用順式作用(lncRNA鄰近100 kb)和反式作用(LncTar軟件)2種方法預(yù)測(cè)lncRNA靶基因;使用DESeq2方法對(duì)基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量進(jìn)行差異分析,獲得差異lncRNA和mRNA。差異分組:DorsetvsHBB、HanBBvsHBB、MonvsDorset、MonvsHBB、MonvsHanBB,前者為對(duì)照組,限定條件:差異倍數(shù)(fold change,FC)≥ 2,錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)<0.01。使用GO seq R語(yǔ)言包中Wallenius對(duì)差異lncRNA的靶基因和mRNA在GO功能數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行富集分析;使用KOBAS軟件進(jìn)行KEGG通路顯著富集分析;使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org/)預(yù)測(cè)并繪制mRNA-mRNA的蛋白互作(protein-protein interactions,PPI)網(wǎng)絡(luò),利用Cytoscape軟件繪制lncRNA-mRNA互作圖。

1.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)為驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性,從測(cè)序結(jié)果中隨機(jī)挑選5個(gè)lncRNA和mRNA進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)GenBank公布的綿羊基因序列以及測(cè)序拼接后獲得的lncRNA序列,采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,以GAPDH為內(nèi)參基因,引物由南京擎科生物有限公司合成(表1)。RT-qPCR按照諾唯贊公司試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行,反應(yīng)體系為20 μL,采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequences information used for this study

1.4.5 免疫組化檢測(cè)湖羊垂體、卵巢和子宮組織采用布氏固定液固定48 h后進(jìn)行石蠟包埋和組織切片,切片厚度7 μm,37 ℃烤片24 h,免疫組化檢測(cè)步驟參考本實(shí)驗(yàn)室的前期研究［23］。一抗為MMP2兔多克隆抗體,以1∶200進(jìn)行稀釋;二抗HRP酶標(biāo)抗小鼠和兔二聚物為試劑盒即用試劑;對(duì)照組用兔血清代替一抗,其余步驟保持一致。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)使用Excel 2016軟件初步處理后,使用Graphpad Prism 9軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)和單因素方差分析并繪圖。數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)情期湖羊和蒙古羊生殖激素水平比較

對(duì)發(fā)情期湖羊和蒙古羊血清中FSH和LH激素含量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖1所示,湖羊血清中FSH和LH含量均顯著高于蒙古羊(P<0.05)。

圖1 湖羊和蒙古羊血清中促卵泡激素(FSH)和促黃體生成素(LH)含量差異Fig.1 Differences of follicle stimulating hormone(FSH)and luteinizing hormone(LH)levels in serum between Hu sheep and Mongolian sheep*P<0.05. The same below.

2.2 不同綿羊品種卵巢中l(wèi)ncRNA與mRNA的比較分析

RNA-seq后對(duì)raw reads進(jìn)行過(guò)濾,共得到150.89 Gb clean reads。如表2所示,數(shù)據(jù)與綿羊(oar_v 4.0)參考基因組比對(duì),匹配效率68.60%～91.59%。Q30值均在87.05%以上,總堿基中G-C含量為50.30%,表明測(cè)序結(jié)果良好,clean reads質(zhì)量合格,可進(jìn)行下一步數(shù)據(jù)分析。本研究共鑒定到87 874個(gè)lncRNA(圖2-A),其中基因間區(qū)lncRNA 44 457 個(gè),占比50.60%,反義lncRNA 4 778 個(gè),占比5.40%,內(nèi)含子lncRNA 36 623個(gè),占比41.70%,正義lncRNA 2 016 個(gè),占比2.30%(圖2-B);lncRNA在不同染色體中均有不同程度的分布,其中在1～3號(hào)常染色體上最多(圖2-C),這與在綿羊下丘腦［23］上的研究結(jié)果一致;lncRNA表達(dá)量整體低于mRNA(圖2-D);lncRNA的ORF長(zhǎng)度在0～100 bp所占比例最高,而 mRNA的ORF長(zhǎng)度主要分布在0～200 bp(圖2-E);lncRNA和mRNA的序列長(zhǎng)度主要分布在200～500 bp(圖2-F);lncRNA主要包含2個(gè)外顯子,其數(shù)量明顯少于mRNA(圖2-G)。

圖2 不同綿羊品種卵巢組織中長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)和信使RNA(mRNA)的鑒定Fig.2 Identification of long non-coding RNA(lncRNA)and messenger RNA(mRNA) in the ovaries tissue of different sheep breeds A. lncRNA數(shù)統(tǒng)計(jì)的韋恩圖;B. lncRNA的分類(lèi)及數(shù)量;C. lncRNA的染色體分布［最外面的環(huán)代表染色體,中間從外向內(nèi)分別是正義lncRNA(綠色)、基因間lncRNA(紅色)、內(nèi)含子lncRNA(藍(lán)色)和反義lncRNA(灰色)］;D. lncRNA和mRNA相對(duì)表達(dá)量;E. lncRNA和mRNA ORF長(zhǎng)度;F. lncRNA和mRNA長(zhǎng)度;G. lncRNA和mRNA外顯子數(shù)量。A. Venn diagram of lncRNA number;B. Number and classification of lncRNA;C. The distribution of lncRNA in different chromosomes［The outermost ring represents different chromosomes. From the outside toward the inside:sense-lncRNA(green),lincRNA(red),intronic-lncRNA(blue),and antisense-lncRNA(gray),respectively］;D. Relative expression level of lncRNA and mRNA;E. ORF length of lncRNA and mRNA;F. Length of lncRNA and mRNA;G. Exon number of lncRNA and mRNA.

表2 樣品測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表Table 2 Sample sequencing data statistics

2.3 不同差異分組間lncRNA和mRNA差異表達(dá)分析

如圖3所示,經(jīng)過(guò)差異比對(duì),在DorsetvsHBB、HanBBvsHBB、MonvsDorset、MonvsHBB、MonvsHanBB 5個(gè)差異分組中,分別獲得6 920［↑(上調(diào))2 735,↓(下調(diào))4 185］、3 929(↑1 356,↓2 573)、5 505(↑3 966,↓1 539)、925(↑415,↓510)、3 661(↑2 712,↓949)個(gè)差異 lncRNA;12 251(↑5 126,↓7 125)、5 424(↑2 009,↓3 415)、11 548(↑6 982,↓4 566)、2 037(↑769,↓1 268)、4 791(↑3 299,↓1 492)個(gè)差異mRNA。為驗(yàn)證RNA-seq結(jié)果的準(zhǔn)確性,分別隨機(jī)選取5個(gè)lncRNA和mRNA進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。結(jié)果表明,MSTRG.597282.1、MSTRG.645655.1和MSTRG.127771.15的lncRNA相對(duì)表達(dá)量在蒙古羊卵巢組織中顯著高于湖羊(圖4-A,P<0.05),這與測(cè)序中FPKM值的趨勢(shì)一致(圖4-B),而MMP2、GDF9、SFRP4(分泌型卷曲相關(guān)蛋白4)、LRP5(低密度脂受體蛋白5)和FZD7(卷曲同源物7)在內(nèi)的5個(gè)mRNA表達(dá)差異也與測(cè)序相同(圖4-C和D),證明測(cè)序結(jié)果可靠,可用于后續(xù)功能分析。

圖4 湖羊和蒙古羊卵巢中l(wèi)ncRNA和mRNA的驗(yàn)證Fig.4 Verification of lncRNA and mRNA expression in the ovaries of Hu sheep and Mongolian sheep A. lncRNA的相對(duì)表達(dá)量Relative expression level of lncRNA;B. lncRNA的FPKM值Fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments(FPKM)value of lncRNA;C. mRNA的相對(duì)表達(dá)量Relative expression level of mRNA;D. mRNA的FPKM值FPKM value of mRNA.**P<0.01. The same below.

2.4 不同差異分組中共有和特有差異基因分析及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

如圖5-A所示:在5個(gè)差異分組DorsetvsHBB、HanBBvsHBB、MonvsDorset、MonvsHBB、MonvsHanBB中存在129個(gè)共有差異表達(dá)基因(differentially expressed gene,DEG),去除新基因后經(jīng)String網(wǎng)站預(yù)測(cè),其中32個(gè)DEG存在互作關(guān)系,構(gòu)建蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖(圖5-B);功能富集分析進(jìn)一步篩選到MMP2、CHAD(軟骨黏附素)、HOXA10(子宮內(nèi)膜同源盒基因A10)、GNB2(G蛋白β2)、COL4A1(Ⅳ型膠原α1)、ACTB(β-肌動(dòng)蛋白)、COL6A3(Ⅵ型膠原蛋白α3)、CREB3L2(cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白3樣2)和LOC101115805等9個(gè)與繁殖相關(guān)的共有DEG;同時(shí),5個(gè)組分別獲得61、8、37、68、4個(gè)與繁殖相關(guān)的特有DEG(圖5-A),MonvsHBB組中鑒定到GDF9、FZD7、FSTL3(卵泡抑素樣蛋白3)等多個(gè)與繁殖相關(guān)的基因。

圖5 共有差異基因(DEG)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Protein interaction network of common differentially expressed gene(DEG)A. 各差異分組的DEG數(shù)Number of DEG in each differential group;B. 蛋白互作網(wǎng)絡(luò) Protein interaction network.

2.5 不同差異分組中共有和特有差異lncRNA分析及l(fā)ncRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

進(jìn)一步對(duì)各組共有和特有l(wèi)ncRNA進(jìn)行篩選,共鑒定到60個(gè)共有差異lncRNA(圖6-A),對(duì)其進(jìn)行功能注釋,從中選擇與繁殖相關(guān)的差異lncRNA,主要富集到受精、卵母細(xì)胞成熟、配子發(fā)生等條目(圖7-A)。在KEGG富集分析中,主要富集到嗅覺(jué)傳導(dǎo)、核糖體、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等通路。繁殖相關(guān)差異lncRNA則富集到PI3K-Akt、Wnt、GnRH等信號(hào)通路(圖7-B),其中,MSTRG.127771.15、MSTRG.29220.1和MSTRG.646338.1均靶向MMP2基因。進(jìn)一步提高篩選條件后(|log2FC| ≥ 4,FDR<0.01),獲得28個(gè)與雌性生殖相關(guān)的差異 lncRNA,構(gòu)建其lncRNA-mRNA的互作網(wǎng)絡(luò)(圖6-B),其中存在多個(gè)靶向Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵基因的lncRNA。

圖7 與繁殖相關(guān)差異lncRNA靶基因的GO和KEGG分析Fig.7 Analysis of target genes of differentially lncRNA related to reproduction by GO and KEGG A. 繁殖相關(guān)差異lncRNA的GO分析GO analysis of lncRNA related to reproduction;B. 繁殖相關(guān)差異lncRNA的KEGG分析 KEGG analysis of lncRNA related to reproduction.

如圖6-A所示:在5個(gè)差異分組中分別存在1 414、129、355、403、212個(gè)特有差異 lncRNA,經(jīng)功能富集分析,獲得1 139、79、313、325、133個(gè)特有差異lncRNA與繁殖相關(guān)。在5個(gè)差異分組中均存在靶向共有差異基因MMP2的特有差異 lncRNA。

2.6 基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)在湖羊和蒙古羊全身組織中的表達(dá)模式

如上所述,MMP2基因在各差異分組中均差異顯著,因此,以MMP2為對(duì)象,檢測(cè)其在蒙古羊和湖羊組織中的表達(dá)模式。結(jié)果(圖8-A)表明,MMP2基因在湖羊和蒙古羊中表達(dá)趨勢(shì)一致,均在卵巢組織中高表達(dá),其次則是在肺臟中有較高表達(dá)。MMP2蛋白在湖羊腺垂體細(xì)胞(垂體)、顆粒細(xì)胞(卵巢)、子宮腔上皮細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞(子宮)中均檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)(圖8-B)。

圖8 基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)在湖羊和蒙古羊組織中的表達(dá)模式Fig.8 Expression pattern of matrix metallopeptidase 2(MMP2)in Hu sheep and Mongolian sheep tissue A. MMP2在蒙古羊和湖羊組織中的表達(dá)量;B. MMP2在湖羊垂體、卵巢和子宮中的表達(dá)定位(NC:陰性對(duì)照;AC:腺垂體細(xì)胞;GC:顆粒細(xì)胞;LE:腔上皮細(xì)胞;GE:腺上皮細(xì)胞)。A. Expression level of MMP2 in Mongolian sheep and Hu sheep;B. Expression location of MMP2 in pituitary,ovary and uterus of Hu sheep(NC:Negative control;AC:Adenohypophysis cell;GC:Granular cell;LE:Luminal epithelium;GE:Glandular epithelium).

3 討論

多胎性是綿羊種畜最重要的評(píng)價(jià)指標(biāo),其不僅與遺傳因素(品種)有關(guān),還受到表觀遺傳調(diào)控的影響。研究表明,lncRNA參與卵巢發(fā)育［25］、卵子發(fā)生［26］、妊娠維持［27］等生殖過(guò)程,這為探究lncRNA調(diào)控綿羊繁殖性能提供契機(jī)。因此,本研究對(duì)不同綿羊品種發(fā)情期卵巢組織進(jìn)行RNA-seq分析后發(fā)現(xiàn),在5 個(gè)差異分組(DorsetvsHBB、HanBBvsHBB、MonvsDorset、MonvsHBB、MonvsHanBB)中,分別獲得6 920、3 929、5 505、925、3 661個(gè)差異lncRNA和12 251、5 424、11 548、2 037和4 791個(gè)差異mRNA。有學(xué)者結(jié)合湖羊的體型以及蒙古羊的南遷歷史,認(rèn)為蒙古羊是湖羊的祖先［28］。而在MonvsHBB組中差異lncRNA和mRNA數(shù)最少,在一定程度上也證實(shí)了這個(gè)說(shuō)法。因此,2個(gè)親緣關(guān)系較近的綿羊品種,造成繁殖力差異的lncRNA和mRNA更值得我們關(guān)注。

經(jīng)RT-qPCR驗(yàn)證后進(jìn)一步對(duì)共有差異lncRNA和mRNA進(jìn)行功能注釋,發(fā)現(xiàn)與繁殖相關(guān)的共有差異lncRNA主要注釋到受精、卵母細(xì)胞成熟、配子發(fā)生等條目,富集到PI3K-Akt、Wnt等已被證實(shí)與繁殖相關(guān)的通路中,并構(gòu)建了lncRNA-mRNA互作網(wǎng)路圖,這為后續(xù)深入探究綿羊繁殖力調(diào)控機(jī)制提供參考。其中,MSTRG.62667.21、MSTRG.64407.1等多個(gè)差異lncRNA均靶向Wnt通路相關(guān)基因,這與前人的研究結(jié)果一致［29］,提示lncRNA可能通過(guò)調(diào)控Wnt通路關(guān)鍵基因來(lái)影響綿羊繁殖力。同時(shí),本研究篩選獲得9個(gè)(HOXA10、MMP2、CHAD等)與繁殖相關(guān)的共有DEG,HOXA10基因被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)鍵調(diào)控因子［30］,CHAD蛋白也在小鼠胚胎和卵巢中較高表達(dá)［31］。在不同綿羊品種卵巢組織中均存在顯著差異,表明這些DEG可能在綿羊卵巢的分子調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮重要作用。此外,在MonvsHBB組中,篩選到GDF9、FSTL3、FZD7等與繁殖相關(guān)的特有DEG,GDF9已被證實(shí)與綿羊繁殖力相關(guān)［6］,FSTL3基因可以通過(guò)降低綿羊孕激素水平,調(diào)節(jié)綿羊的發(fā)情周期［32］。以上研究表明,lncRNA和mRNA可能參與綿羊繁殖力的調(diào)控過(guò)程,但具體機(jī)制有待揭示。

如上所述,在各差異分組中,Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵基因MMP2及相關(guān)lncRNA的表達(dá)水平存在顯著差異。MMP2蛋白能夠降解Ⅳ型膠原蛋白促使卵泡形態(tài)發(fā)生改變,對(duì)哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育發(fā)揮重要作用［33］。本研究結(jié)果表明,MMP2蛋白在湖羊垂體、卵巢和子宮組織中均檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào),在蒙古羊和湖羊的卵巢組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),提示MMP2基因可能參與綿羊繁殖調(diào)控過(guò)程。有學(xué)者認(rèn)為MMP2的高表達(dá)可能是卵泡閉鎖的標(biāo)志,參與優(yōu)勢(shì)卵泡的選擇［34］,這在一定程度上解釋了本試驗(yàn)中低繁蒙古羊卵巢中MMP2表達(dá)量高于高繁湖羊的原因,但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

另外,FSH和LH是主導(dǎo)卵泡發(fā)育的2種主要激素。初情期后,FSH和LH對(duì)卵泡發(fā)育起主要調(diào)節(jié)作用,且二者相互協(xié)調(diào),刺激卵泡成熟與排卵。由于多胎性與卵泡發(fā)育關(guān)系密切,且與排卵優(yōu)勢(shì)卵泡數(shù)量直接相關(guān),因此,FSH與LH含量與綿羊的產(chǎn)羔性狀存在一定的相關(guān)性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),高繁湖羊中LH水平顯著高于低繁湖羊［35］。與此類(lèi)似,不同綿羊品種中,發(fā)情期單羔美利奴羊中FSH和LH含量均顯著低于多羔湖羊［36］,這在一定程度上驗(yàn)證了本研究中湖羊血清中FSH和LH含量顯著高于蒙古羊的結(jié)論。但也有研究者認(rèn)為這是高繁綿羊卵巢卵泡對(duì)FSH和LH的靈敏度更高造成的結(jié)果［37］。

綜上,本試驗(yàn)繪制了不同綿羊品種卵巢組織中差異lncRNA和mRNA表達(dá)圖譜,篩選到與繁殖相關(guān)的lncRNA和mRNA,探究候選基因MMP2在不同組織中的表達(dá)差異,并初步確定MMP2蛋白的表達(dá)定位,為后續(xù)揭示lncRNA參與綿羊繁殖力的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。