UPLC-MS/MS法測(cè)定犬血漿中阿莫西林和克拉維酸片劑的生物等效性研究

徐一丹,郭凡溪,劉利鋒,2,張馮奕馳,王俊麗,鄒遠(yuǎn)鵬,余元倩,余祖功*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.南京朗博特動(dòng)物藥業(yè)有限公司,江蘇 南京 210032)

阿莫西林屬半合成廣譜青霉素類抗生素,化學(xué)名稱為(2S,5R,6R)-3,3-二甲基-6-［(R)-(-)-2-氨基-2-(4-羥基苯基)乙酰氨基］-7-氧代-4-硫雜-1-氮雜雙環(huán)［3.2.0］庚烷-2-甲酸三水合物,通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成而發(fā)揮殺菌作用［1］。它對(duì)金葡菌、鏈球菌、棒狀桿菌等革蘭陽(yáng)性菌以及大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、巴氏桿菌等革蘭陰性菌均有較強(qiáng)作用［2］。阿莫西林耐胃酸但不耐β-內(nèi)酰胺酶,易被β-內(nèi)酰胺酶水解破壞?？死S酸是一種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑,化學(xué)名稱為(2R,3Z,5R)-3-(2-羥基亞乙基)-7-氧代-4-氧雜-1-氮雜雙環(huán)［3.2.0］庚烷-2-羧酸,僅有微弱的抗菌活性,不單獨(dú)用于抗菌治療,通常與阿莫西林等β-內(nèi)酰胺抗生素合用以克服細(xì)菌的耐藥性［3］。阿莫西林克拉維酸鉀片在寵物臨床應(yīng)用于敏感菌所致的各種感染,如皮膚及軟組織感染、尿道感染、呼吸道感染等［4］。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已將寵物用阿莫西林克拉維酸鉀片列入《獸藥比對(duì)試驗(yàn)?zāi)夸?第一批)》。近年來(lái),寵物醫(yī)療行業(yè)在我國(guó)發(fā)展迅猛,國(guó)內(nèi)寵物用阿莫西林克拉維酸鉀制劑生產(chǎn)企業(yè)稀少,應(yīng)用前景廣闊。本研究首先建立犬血漿中阿莫西林和克拉維酸濃度的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法,并應(yīng)用該方法開(kāi)展國(guó)產(chǎn)阿莫西林克拉維酸鉀片與進(jìn)口產(chǎn)品(參比制劑)在犬體內(nèi)的生物等效性試驗(yàn),為國(guó)內(nèi)寵物制藥企業(yè)生產(chǎn)的阿莫西林克拉維酸鉀片的申請(qǐng)上市提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

阿莫西林對(duì)照品,中國(guó)食品藥品鑒定研究所,批號(hào)130409-201913,純度87.0%;克拉維酸標(biāo)準(zhǔn)品,中國(guó)食品藥品鑒定研究所,批號(hào)130429-201708,純度95.1%;阿莫西林D4標(biāo)準(zhǔn)品(阿莫西林的內(nèi)標(biāo)):ISOREAG?,批號(hào)21B029-A4,化學(xué)純度98.6%,同位素純度98.2%;阿莫西林克拉維酸片參比制劑,意大利豪普特制藥廠,批號(hào)01925600,規(guī)格為500 mg;阿莫西林克拉維酸片受試制劑,南京朗博特動(dòng)物藥業(yè)有限公司,批號(hào)202012311,規(guī)格為500 mg;超純水,由Millipore公司生產(chǎn)的Direct-Q5UV型水純化系統(tǒng)制備。甲醇和乙腈,德國(guó)Merck公司,色譜級(jí);甲酸,美國(guó)ASC公司,質(zhì)譜級(jí);二氯甲烷、正己烷、乙酸銨、冰醋酸均為分析純級(jí)試劑。

1.2 儀器設(shè)備

AcquityTMUPLC系統(tǒng)超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司);Xevo TQD型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子源(美國(guó)Waters公司);QUINTIX125D-1CN型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司);Centrisart D-16C型和D-14C型低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Sartorius公司);Direct-Q5UV型水純化系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司);XW-80A型渦旋混合儀(上海馳唐電子有限公司);M1800H-J型超聲波清洗儀(美國(guó)BRASON公司);SLK-03000-S型振蕩器(Scilogex公司);BCD-458WDVNU1型冰箱(海爾集團(tuán));ULTS1490型超低溫冰箱(賽默飛世爾儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

26只成年健康比格犬,雌雄各半,體重為(9.35±1.28)kg,來(lái)源于江蘇亞?wèn)|實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。將實(shí)驗(yàn)犬飼養(yǎng)于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心普通動(dòng)物房?jī)?nèi),飼喂不含任何抗菌藥物的實(shí)驗(yàn)犬維持飼料,試驗(yàn)前進(jìn)行7 d的適應(yīng)性飼養(yǎng)和觀察。

1.4 相關(guān)溶液的制備

1.4.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液阿莫西林儲(chǔ)備液:精確稱量阿莫西林對(duì)照品置于50 mL量瓶,用50%甲醇水溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成200 μg·mL-1的儲(chǔ)備液?？死S酸儲(chǔ)備液:精確稱量克拉維酸對(duì)照品置于10 mL量瓶,用90%乙腈水超聲溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成1 mg·mL-1的儲(chǔ)備液。對(duì)照品儲(chǔ)備液平行制備2份,分別用于標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品的制備。阿莫西林D4儲(chǔ)備液:精確量取50%甲醇水1 mL溶解阿莫西林D4(1 mg)后將全部溶液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,用50%甲醇水稀釋至刻度,搖勻,即得內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。儲(chǔ)備液均置于-80 ℃冷凍保存。

1.4.2 系列工作液用超純水精確稀釋阿莫西林儲(chǔ)備液,制成0.2、1、5、10、25、50、100 μg·mL-1的阿莫西林系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液和0.2、0.5、40、80 μg·mL-1的阿莫西林質(zhì)控工作液;用超純水精確稀釋克拉維酸儲(chǔ)備液,制成1、4、10、20、40、60、100 μg·mL-1的克拉維酸系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液和1、2、50、75 μg·mL-1的克拉維酸質(zhì)控工作液。精確量取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液適量,用超純水稀釋20倍,即得5 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)工作液。工作液于2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 LC-MS/MS測(cè)定方法

1.5.1 色譜條件色譜柱為Acquity UPLC HSS T3 column(100 mm×2.1 mm,1.8 μm),流速0.3 mL·min-1,進(jìn)樣量5 μL,柱溫30 ℃。阿莫西林:進(jìn)樣室溫度4 ℃,流動(dòng)相A為乙腈,流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸水溶液。洗脫程序:0～0.1 min,0% A;0.1～3.0 min,0%～90% A;3.0～5.0 min,90% A;5.0～5.1 min,90%～0% A;5.1～9.0 min,0% A?？死S酸:進(jìn)樣室溫度6 ℃,流動(dòng)相A為乙腈,流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)0.01%的甲酸水溶液。梯度洗脫程序:0～0.5 min,0% A;0.5～2.5 min,0%～65% A;2.5～3.6 min,65% A;3.6～3.7 min,65%～0% A;3.7～5.5 min,0% A。

1.5.2 質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源使分析物離子化,并在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式下分別對(duì)阿莫西林及內(nèi)標(biāo)進(jìn)行正離子(ESI+)監(jiān)測(cè),對(duì)克拉維酸及內(nèi)標(biāo)進(jìn)行負(fù)離子(ESI-)監(jiān)測(cè)。阿莫西林:毛細(xì)管電壓3.0 kV,離子源溫度150 ℃,脫溶劑溫度350 ℃,脫溶劑氣流速800 L·h-1,錐孔氣流速50 L·h-1?？死S酸:毛細(xì)管電壓3.0 kV,離子源溫度150 ℃,脫溶劑溫度500 ℃,脫溶劑氣流速800 L·h-1,錐孔氣流速50 L·h-1。各化合物的定量定性離子對(duì)、錐孔電壓和碰撞能見(jiàn)表1。

表1 阿莫西林、克拉維酸和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass parameters of amoxicillin,clavulanic acid and internal standard

1.6 血漿樣品預(yù)處理

1.6.1 阿莫西林血樣預(yù)處理1)取血漿樣品200 μL,精確加入內(nèi)標(biāo)工作液50 μL,渦旋30 s,加入醋酸銨緩沖液(pH6.0)250 μL和乙腈400 μL,渦旋2 min,200 r·min-1振蕩10 min,4 ℃、12 000 r·min-1離心 10 min;2)取上清液0.5 mL,加入二氯甲烷1 mL,渦旋2 min,4 ℃、6 000 r·min-1離心10 min;3)取上層水相100 μL,加超純水300 μL,渦旋混勻,0.22 μm濾頭過(guò)濾后進(jìn)樣分析。

1.6.2 克拉維酸血樣預(yù)處理1)取血漿樣品400 μL,加入670 μL乙腈,渦旋3 min,4 ℃、13 000 r·min-1離心10 min;2)轉(zhuǎn)移上清液置干凈的離心管中,加入二氯甲烷1 mL,渦旋1 min,4 ℃、8 000 r·min-1離心6 min;3)取上層液體,加入正己烷400 μL,渦旋1 min,4 ℃、13 000 r·min-1離心10 min;4)取下層水相,0.22 μm濾頭過(guò)濾后進(jìn)樣分析。

1.7 方法學(xué)驗(yàn)證

1.7.1 專屬性阿莫西林:取6只不同犬的空白血漿樣品、空白血漿加100 μg·mL-1阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)溶液,空白血漿加100 μg·mL-1克拉維酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,空白血漿加內(nèi)標(biāo)工作液,按1.6.1節(jié)方法處理樣品后檢測(cè)?？死S酸:取6只不同犬的空白血漿樣品、空白血漿加100 μg·mL-1阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)溶液,空白血漿加100 μg·mL-1克拉維酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.6.2節(jié)方法處理樣品后檢測(cè)。

1.7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性分析取空白血漿180 μL,分別加入相應(yīng)濃度的阿莫西林系列標(biāo)準(zhǔn)工作液20 μL,制成20、100、500、1 000、2 500、5 000、10 000 ng·mL-1的阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品;取空白血漿380 μL,分別加入相應(yīng)濃度的克拉維酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作液20 μL,制成50、200、500、1 000、2 000、3 000和5 000 ng·mL-1的克拉維酸標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品。按1.6節(jié)方法處理后進(jìn)樣檢測(cè),以阿莫西林濃度(x,ng·mL-1)為橫坐標(biāo),峰面積比值(y)為縱坐標(biāo),繪制阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)曲線。以克拉維酸樣品濃度(x,ng·mL-1)為橫坐標(biāo),克拉維酸峰面積(y)為縱坐標(biāo),繪制克拉維酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。2種分析物標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算均采用加權(quán)(W=1/x)最小二乘法線性回歸分析。

1.7.3 準(zhǔn)確度和精密度取空白血漿180 μL,分別加入相應(yīng)濃度的阿莫西林質(zhì)控工作液20 μL,制備阿莫西林質(zhì)量濃度為20、50、4 000、8 000 ng·mL-1的質(zhì)控樣品;取空白血漿380 μL,分別加入相應(yīng)濃度的克拉維酸質(zhì)控工作液20 μL,制備克拉維酸質(zhì)量濃度為50、100、2 500、3 750 ng·mL-1的質(zhì)控樣品。每個(gè)濃度5個(gè)平行樣品,連續(xù)制備并測(cè)定3個(gè)分析批,根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得質(zhì)控樣品濃度,計(jì)算準(zhǔn)確度、批內(nèi)(n=5)及批間(n=15)精密度。

1.7.4 基質(zhì)效應(yīng)空白基質(zhì)加標(biāo)樣品制備:取6只不同犬的空白血漿,用乙腈沉淀蛋白并渦旋離心后,取全部上清液,分別加入低、高濃度質(zhì)控工作液(阿莫西林樣品加內(nèi)標(biāo)工作液),再按1.6節(jié)方法繼續(xù)處理。每個(gè)濃度6個(gè)平行樣品。純?nèi)芤簶悠分苽?以超純水替換空白血漿,其余步驟相同。記錄檢測(cè)空白基質(zhì)加標(biāo)樣品的阿莫西林峰面積為As,內(nèi)標(biāo)峰面積為Ais;檢測(cè)純?nèi)芤簶悠返陌⒛髁址迕娣e平均值為Bs,內(nèi)標(biāo)峰面積平均值為Bis。計(jì)算經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子［(As/Bs)/(Ais/Bis)×100%］及其精密度。記錄檢測(cè)空白基質(zhì)加標(biāo)樣品的克拉維酸峰面積為C,純?nèi)芤簶悠返目死S酸峰面積平均值為D,計(jì)算基質(zhì)因子(C/D×100%)及其精密度。

1.7.5 稀釋可靠性制備20 000 ng·mL-1的阿莫西林血漿樣品,用空白血漿稀釋4倍;制備8 000 ng·mL-1的克拉維酸血漿樣品,用空白血漿稀釋4倍。每種藥物各制備5個(gè)平行樣品,分別按1.6節(jié)方法處理后檢測(cè)。根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得稀釋后樣品的檢測(cè)濃度,將檢測(cè)濃度乘以稀釋倍數(shù)與制備濃度比較,計(jì)算準(zhǔn)確度和精密度。

1.7.6 穩(wěn)定性對(duì)低、中、高濃度的質(zhì)控樣品進(jìn)行如下條件的穩(wěn)定性考察:血漿樣品-80 ℃反復(fù)凍融3次的穩(wěn)定性;血漿樣品-80 ℃長(zhǎng)期放置(克拉維酸和阿莫西林血漿樣品分別放置45 d和112 d)的穩(wěn)定性;預(yù)處理后樣品進(jìn)樣室放置24 h穩(wěn)定性;阿莫西林血漿樣品室溫放置8 h穩(wěn)定性和克拉維酸血漿樣品2～8 ℃放置8 h穩(wěn)定性。

1.8 藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)

采用單劑量、雙處理、雙周期交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì),選26只成年健康比格犬隨機(jī)分為2組(TR和RT組),每只受試犬進(jìn)行2個(gè)周期試驗(yàn),各服用1次受試制劑(T)和1次參比制劑(R),每次服用半片(含阿莫西林200 mg,克拉維酸50 mg),清洗期設(shè)置為14 d。受試犬給藥前禁食12 h,除給藥前1 h和給藥后2 h禁止飲水外,任意飲水。次日早晨空腹取血樣后,給犬口服受試制劑或參比制劑,并灌服5 mL水促其吞服,4 h后統(tǒng)一飼喂犬維持飼料。分別在口服給藥前及給藥后10 min、20 min、30 min、45 min、1 h、1.25 h、1.5 h、1.75 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h、4.5 h、5 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h和24 h于犬的前肢靜脈采集血液3～3.5 mL。采集的血樣在預(yù)冷的離心機(jī)(2～8 ℃)以2 150g離心10 min,分離的血漿轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中,置于-80 ℃冰箱冷凍保存待測(cè)。阿莫西林血漿樣品檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)為給藥前和給藥后10 min、20 min、30 min、45 min、1 h、1.25 h、1.5 h、1.75 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h和24 h,克拉維酸血漿樣品檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)分別為給藥前和給藥后10 min、20 min、30 min、45 min、1 h、1.25 h、1.5 h、1.75 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h、4.5 h、5 h、6 h、8 h和10 h。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Phoenix Winnonlin 8.1藥動(dòng)學(xué)軟件以非房室模型分析藥動(dòng)學(xué)血漿樣品的濃度數(shù)據(jù),獲得藥動(dòng)學(xué)參數(shù),對(duì)參比制劑和受試制劑藥動(dòng)學(xué)參數(shù)峰值濃度Cmax、藥物濃度-時(shí)間曲線下面積AUC0-t和AUC0-∞對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析及雙向單側(cè)t檢驗(yàn)并計(jì)算90%置信區(qū)間范圍,達(dá)峰時(shí)間Tmax需經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn),進(jìn)而評(píng)價(jià)生物等效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

2.1.1 專屬性從圖1可以看出,阿莫西林的保留時(shí)間約為2.6 min,內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間約為2.6 min;從圖2 可以看出,克拉維酸的保留時(shí)間約為3.0 min。以上結(jié)果表明,來(lái)源不同的空白基質(zhì)中分析物保留時(shí)間處無(wú)雜峰干擾,且各分析物之間無(wú)相互干擾,方法專屬性良好。

圖1 血漿中阿莫西林和內(nèi)標(biāo)(阿莫西林D4)的典型MRM色譜圖Fig.1 Typical MRM chromatogram of amoxicillin and internal standard(amoxicillin-D4)in plasma A. 空白血漿 Blank plasma;B. 空白血漿添加100 μg·mL-1克拉維酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 Blank plasma spiked with a concentration of 100 μg·mL-1 clavulanic acid standard solution;C. 空白血漿添加5 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)工作液 Blank plasma spiked with a concentration of internal standand working solution;D. 空白血漿添加100 μg·mL-1阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)溶液 Blank plasma spiked with a concentration of 100 μg·mL-1 amoxicillin standard solution.

圖2 血漿中克拉維酸的典型MRM色譜圖Fig.2 Typical MRM chromatogram of clavulanic acid in plasma A. 空白血漿 Blank plasma;B. 空白血漿添加100 μg·mL-1阿莫西林標(biāo)準(zhǔn)溶液 Blank plasma spiked with a concentration of 100 μg·mL-1 amoxicillin standard solution;C. 空白血漿添加100 μg·mL-1克拉維酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 Blank plasma spiked with a concentration of 100 μg·mL-1 clavulanic acid standard solution.

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性犬血漿中阿莫西林在20～10 000 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,其回歸方程為y=0.000 494 291x-0.000 021 446 9(R2=0.999 7)。犬血漿中克拉維酸在50～5 000 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,其回歸方程為y=4.384 69x+5.984 01(R2=0.997 7)。

2.1.3 準(zhǔn)確度和精密度由表2可見(jiàn),阿莫西林和克拉維酸質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度均在標(biāo)示值的15%范圍內(nèi),批內(nèi)(n=5)、批間(n=15)精密度均小于15%,表明該方法檢測(cè)重復(fù)性良好。

表2 方法的準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果Table 2 Accuracy and precision results of the detection method

2.1.4 基質(zhì)效應(yīng)阿莫西林在低、高濃度下,經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化后基質(zhì)因子的平均值分別為105.5%、104.6%,RSD分別為4.0%、1.2%;克拉維酸在低、高濃度下,基質(zhì)因子的平均值分別為102.7%、97.6%,RSD分別為1.3%、1.4%,表明不同來(lái)源的血漿基質(zhì)對(duì)阿莫西林和克拉維酸的測(cè)定結(jié)果沒(méi)有影響。

2.1.5 稀釋可靠性阿莫西林稀釋樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確度為95.2%～98.8%,RSD為1.6%;克拉維酸稀釋樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確度為94.9%～105.1%,RSD為3.9%,表明該稀釋方法不影響樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確度和精密度。

2.1.6 穩(wěn)定性考察結(jié)果血漿中藥物穩(wěn)定性考察結(jié)果見(jiàn)表3,結(jié)果顯示血漿中藥物濃度檢測(cè)的準(zhǔn)確度均在85%～115%范圍內(nèi),RSD小于15%,表明血漿樣品中阿莫西林和克拉維酸在不同儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定性良好。

表3 不同條件下犬血漿中阿莫西林和克拉維酸的穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果Table 3 Stability result of amoxicillin and clavulanic acid in dog plasma in different

2.2 藥物的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

共有25只受試犬完成試驗(yàn),1只受試犬因嘔吐時(shí)間在2倍中位達(dá)峰時(shí)間(Tmax)內(nèi)而退出試驗(yàn)。采用Phoenix Winnonlin 8.1藥動(dòng)學(xué)軟件的非房室模型計(jì)算得到25只犬單劑量口服阿莫西林克拉維酸鉀片受試制劑和參比制劑后平均藥動(dòng)學(xué)參數(shù),結(jié)果見(jiàn)表4,繪制的平均血藥濃度-時(shí)間曲線如圖3所示。

圖3 犬口服參比制劑(R)或受試制劑(T)后阿莫西林和克拉維酸平均血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.3 Mean plasma concentration-time curve of amoxicillin and clavulanic acid in dogs after oral administration of reference(R)or test

表4 犬口服阿莫西林和克拉維酸受試制劑和參比制劑后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Table 4 Pharmacokinetic parameters of amoxicillin and clavulanic acid after oral administration of test and reference preparations in

2.3 藥物的生物等效性分析

將阿莫西林和克拉維酸主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0-t及AUC0-∞對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表5。兩制劑間各參數(shù)均無(wú)顯著差異(P>0.05),雙向單側(cè)t檢驗(yàn)結(jié)果表明t1和t2均大于單側(cè)t0.05,幾何平均值的90%置信區(qū)間均在80%～125%等效范圍內(nèi),Tmax經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)在受試制劑和參比制劑間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),表明兩制劑生物等效。

表5 受試制劑(T)和參比制劑(R)主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后幾何平均值(GMR)比值的90%置信區(qū)間

3 討論

本文首先建立了一種準(zhǔn)確、便捷的犬血漿中阿莫西林和克拉維酸濃度測(cè)定的UPLC-MS/MS法。阿莫西林是兩性化合物,結(jié)構(gòu)式中有氨基和羧基,在電噴霧離子源(ESI)的正離子(ESI+)和負(fù)離子(ESI-)模式下均有響應(yīng)?？死S酸的結(jié)構(gòu)式中僅有羧基,難以帶正電荷,僅在ESI-模式下有響應(yīng)。文獻(xiàn)［5-8］報(bào)道中應(yīng)用MS/MS監(jiān)測(cè)阿莫西林和克拉維酸一般有2種方式:一種是分開(kāi)檢測(cè),阿莫西林應(yīng)用ESI+模式,而克拉維酸應(yīng)用ESI-模式;另一種是在ESI-模式下同時(shí)監(jiān)測(cè)阿莫西林和克拉維酸。同時(shí)監(jiān)測(cè)2種成分能大大縮短分析時(shí)間,因此本試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)首選這一方式。而試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),ESI-模式下,當(dāng)克拉維酸濃度為50～2 000 ng·mL-1時(shí)阿莫西林和克拉維酸之間互不干擾,均能準(zhǔn)確定量,但當(dāng)克拉維酸濃度超過(guò)2 000 ng·mL-1時(shí),對(duì)阿莫西林的響應(yīng)有抑制作用,目前未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道這一現(xiàn)象,這可能與生物樣品基質(zhì)或質(zhì)譜型號(hào)有關(guān)。在生物等效性試驗(yàn)中,方法的定量準(zhǔn)確為必要條件,而這種抑制現(xiàn)象影響樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確度,考慮到阿莫西林在ESI-模式下的響應(yīng)遠(yuǎn)低于ESI+模式,因此最終選擇應(yīng)用ESI+模式監(jiān)測(cè)阿莫西林,ESI-模式監(jiān)測(cè)克拉維酸。在ESI+模式下,在流動(dòng)相中加入甲酸可促進(jìn)阿莫西林分子的離子化,增強(qiáng)其響應(yīng),因此在儀器允許條件下甲酸添加量至0.1%;而ESI-模式下,降低甲酸的含量能使克拉維酸獲得更好的峰型和更高的響應(yīng),因此在克拉維酸流動(dòng)相條件中將甲酸水溶液中甲酸的含量調(diào)至0.01%。阿莫西林和克拉維酸均選擇梯度洗脫模式,當(dāng)初始比例中含有機(jī)相時(shí),分析物峰形變差,響應(yīng)減弱,因此初始比例中乙腈比例為0%。

根據(jù)Xi等［5］報(bào)道的血漿樣品前處理方法,以乙腈沉淀樣品中蛋白后,直接用超純水稀釋后進(jìn)樣。我們?cè)谥貜?fù)該處理方法時(shí),發(fā)現(xiàn)處理后的樣品中乙腈含量較高時(shí),阿莫西林和克拉維酸均出現(xiàn)響應(yīng)減弱,色譜峰分叉、分裂的現(xiàn)象,因此選擇在乙腈沉淀蛋白后,加入二氯甲烷萃取乙腈,取水層分析,峰型明顯改善且響應(yīng)也明顯提高［9-10］。在本文建立的方法下,阿莫西林定量限血漿濃度為20 ng·mL-1,進(jìn)樣分析濃度低至2 ng·mL-1,比Xi等［5］、Zhang等［7］和Yoon等［11］報(bào)道方法的靈敏度更高。克拉維酸經(jīng)二氯甲烷去除乙腈后進(jìn)樣分析,發(fā)現(xiàn)基線噪聲較高而影響定量限和低濃度樣品的定量,經(jīng)篩選考察后發(fā)現(xiàn)二氯甲烷去除乙腈,取水層添加同體積正己烷渦旋除脂,可降低出峰處的基線噪聲,提高樣品檢測(cè)準(zhǔn)確度和靈敏度。

本文阿莫西林檢測(cè)方法中選擇同位素內(nèi)標(biāo)(阿莫西林D4),由于其具有相同的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),可有效消除基質(zhì)效應(yīng),提高準(zhǔn)確度和精密度及穩(wěn)定性。此外,基于克拉維酸高濃度下對(duì)阿莫西林響應(yīng)存在抑制作用,而給藥后克拉維酸的Cmax遠(yuǎn)高于2 000 ng·mL-1,故未選用阿莫西林D4為內(nèi)標(biāo),且無(wú)內(nèi)標(biāo)條件下,克拉維酸定量檢測(cè)的準(zhǔn)確度和精密度良好。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證,本研究建立的犬血漿中阿莫西林、克拉維酸濃度的檢測(cè)方法均特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、精密度好,適用于犬口服阿莫西林克拉維酸鉀片的生物等效性測(cè)定。

犬分別經(jīng)單劑量(阿莫西林 200 mg,克拉維酸 50 mg)口服受試制劑和參比制劑后,受試制劑阿莫西林、克拉維酸的平均血藥濃度-時(shí)間曲線與參比制劑基本吻合,顯示兩制劑口服后在犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為基本一致。經(jīng)藥動(dòng)學(xué)軟件分析獲取主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0-t和AUC0-∞并將其對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化,方差分析結(jié)果表明阿莫西林和克拉維酸的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)在受試和參比制劑間差異均不顯著,雙向單側(cè)t檢驗(yàn)符合要求,且?guī)缀纹骄当?T/R)的90%置信區(qū)間均在80.00%～125.00%規(guī)定范圍內(nèi),Tmax經(jīng)非參數(shù)分析后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。按照《獸用化學(xué)藥品血藥濃度法生物等效性試驗(yàn)指導(dǎo)原則》［12］和《中國(guó)藥典》(2020年版)四部附錄9011《藥物制劑人體生物利用度和生物等效性試驗(yàn)指導(dǎo)原則》［13］規(guī)定,可以判定受試制劑和參比制劑生物等效。