籃狀菌屬糙刺孢籃狀菌組的兩個(gè)中國(guó)新記錄種

王 龍

(中國(guó)科學(xué)院 微生物研究所真菌學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100101)

1 引言

籃狀菌屬(TalaromycesC.R. Benj.)真菌廣泛分布于陸地、水體(淡水和海水)、空氣等環(huán)境,是自然界物質(zhì)循環(huán)中的重要分解者。籃狀菌的無(wú)性階段一般形成對(duì)稱雙輪生帚狀枝(symmetrical biverticillate penicillus)的產(chǎn)分生孢子結(jié)構(gòu),即在分生孢子梗莖(孢梗莖)頂端產(chǎn)生簇生的、大小相近的梗基(metula),在?；敹水a(chǎn)生簇生的、大小相近的披針形瓶梗(phialide),?；推抗＞瘦S對(duì)稱排列,在瓶梗頂端產(chǎn)生向基性生的鏈狀排列的分生孢子。若產(chǎn)生有性繁殖結(jié)構(gòu),則會(huì)形成裸囊殼(gymnothecium)型子囊果,內(nèi)含無(wú)規(guī)則排列的球形至橢球形子囊,子囊壁較薄,易消解,每個(gè)子囊內(nèi)含8個(gè)子囊孢子,子囊孢子通常呈橢球形,壁通常粗糙[1, 2]。

目前,基于3個(gè)蛋白質(zhì)基因序列,即β-tubulin gene(BenA)、calmodulin gene(CaM)、DNA-dependent RNA polymerase II second largest subunit gene(Rpb2)和rDNA ITS1-5.8S-ITS2(ITS)序列的分析,籃狀菌屬被劃分為8個(gè)組(section),即桿孢籃狀菌組(sect.BacillisporiYilmaz, Frisvad &Samson、sect.HeliciYilmaz, Frisvad &Samson)、島籃狀菌組(sect.Islandici(Pitt) Yilmaz, Frisvad &Samson)、紫籃狀菌組(sectPurpureiStolk &Samson)、近膨籃狀菌組(sect.SubinflatiYilmaz, Frisvad &Samson)、籃狀菌組(sect.Talaromyces)、糙刺孢籃狀菌組(sect.TrachypermiYaguchi &Udagawa)和細(xì)?；@狀菌組(sect.TenuesB.D. Sun, A.J. Chen, Houbraken &Samson),籃狀菌屬目前已報(bào)道約200種[2-8]。

糙刺孢籃狀菌組是籃狀菌屬中已發(fā)現(xiàn)物種較多的組,該組全球已報(bào)道36種,我國(guó)僅發(fā)現(xiàn)12個(gè)種[4-7, 9-12]。該組物種通常生長(zhǎng)局限,一般形成雙輪生和/或三輪生帚狀枝的無(wú)性產(chǎn)孢結(jié)構(gòu),少數(shù)還兼有單輪生帚狀枝,有些種會(huì)產(chǎn)生白色或黃白色裸囊殼型的有性繁殖結(jié)構(gòu)。少數(shù)種產(chǎn)生嗜氮酮類色素(azaphilones),呈紅色可溶性色素?cái)U(kuò)散到培養(yǎng)基中,或只存在于菌絲內(nèi)而不擴(kuò)散的培養(yǎng)基中,使得菌落背面呈紅色,如白雙輪籃狀菌(T.albobiverticillius(H.M. Hsieh, Y.M. Ju &S.Y. Hsieh) Samson, N. Yilmaz, Frisvad &Seifert),暗玫瑰籃狀菌(T.atroroseusN. Yilmaz, Frisvad, Houbraken &Samson),紅色素籃狀菌(T.rubrifaciensW.W. Gao)等。該類色素結(jié)構(gòu)類似于橙色或紅色紅曲色素(orange or redMonascuspigments),如絲紅素(mitorubrin)、暗玫瑰素(atrorosin),而且上述這三個(gè)種均不產(chǎn)真菌毒素,因此它們具有用于開(kāi)發(fā)食用色素的潛力[13, 14]。

本文報(bào)道該組的我國(guó)兩個(gè)新記錄種,即熱微黃籃狀菌(T.calidominioluteusHoubraken &Pyrri)和卡迪斯籃狀菌〔T.gaditanus(C. Ramírez and A.T. Martínez) Houbraken and Soccio〕,其中卡迪斯籃狀菌產(chǎn)生紅色可溶性色素。

2 材料與方法

2.1 菌株分離

土壤樣品中真菌的分離采用倍比稀釋涂布平皿法[15, 16],即將樣品碾碎混勻,取約1 g樣品放入裝有9 mL滅菌的0.1%瓊脂水溶液的大試管中,搖勻成懸濁液,作為第一稀釋度,然后取該稀釋度的懸濁液1 mL倒入第二個(gè)同樣的大試管中搖勻,作為第二稀釋度,依此類推直到第五個(gè)稀釋度,取最后兩個(gè)連續(xù)的稀釋度的懸濁液約1 mL傾倒于氯硝胺虎紅氯霉素瓊脂培養(yǎng)基(Dichloran rose bengal chloramphenicol agar,DRBC)上,用無(wú)菌涂布棒均勻涂布,于25 ℃倒置培養(yǎng),等菌長(zhǎng)出后挑取單菌落獲得純培養(yǎng)菌株。本研究的菌株保存在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心 (AS3.8022、CGMCC 3.15382和AS3.16376)。

2.2 傳統(tǒng)分類學(xué)研究

菌株的鑒定培養(yǎng)使用查氏酵母精瓊脂(Czapek yeast autolysate agar, CYA)培養(yǎng)基在25 ℃和37 ℃培養(yǎng)7天和麥芽精瓊脂(5% malt extract agar, MEA)培養(yǎng)基在25 ℃培養(yǎng)7天,然后進(jìn)行菌落形態(tài)的觀測(cè)和描述,分生孢子、菌絲體、滲出液和可溶性色素及菌落背面的顏色命名參考Ridgway的命名法,產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的普通光學(xué)顯微鏡觀測(cè)挑取在MEA上25 ℃培養(yǎng)7天的菌體材料進(jìn)行[2, 17]。

2.3 基因擴(kuò)增及測(cè)序

采用植物基因組DNA提取試劑盒(通用型TSP101-200,擎科生物技術(shù)有限公司)提取真菌基因組DNA。上述四個(gè)遺傳標(biāo)記的PCR擴(kuò)增方法參考王龍等[18],其中擴(kuò)增BenA的引物參考Glass and Donaldson[19],CaM的引物參考Wang[20],Rpb2的引物參考Jiang et al.[21],ITS的引物參考White et al.[22]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳后純化,然后交給擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

2.4 分子系統(tǒng)學(xué)分析

測(cè)序得到序列使用Bioedit 7.0.9[23]進(jìn)行人工校對(duì)并刪除引物序列,然后提交到GenBank(熱微黃籃狀菌AS3.8022:BenA= OQ992535,CaM= OQ992536,Rpb2 = OQ992537,ITS = OQ981605;CGMCC 3.15382:BenA= ON569410,CaM= OQ626763,Rpb2 = OQ626765,ITS = OQ608443;卡迪斯籃狀菌AS3.16376(DJ6-12):BenA= ON569411,CaM= OQ626764,Rpb2 = ON569397,ITS = OQ608444)。選擇糙刺孢籃狀菌組中34個(gè)種的模式菌株和本研究的三個(gè)菌株的上述四個(gè)基因序列組合進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析,以紫籃狀菌組的褐孢籃狀菌(T.brunneosporusRodr.-Andr., Cano &Stchigel)作為外群。這些菌株的BenA-CaM-Rpb2-ITS組合序列矩陣包括空格(gap)共1889個(gè)位點(diǎn)(site)。系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析采用最大似然法(Maximum Likelihood, ML),分析軟件使用MEGA6[24],最適堿基替代模型(substitution model)和位點(diǎn)演化速率(rates among sites)設(shè)為“K2+GI”,系統(tǒng)樹(shù)中各演化支的可靠性采用自展法(bootstrap)1 000次重復(fù)進(jìn)行評(píng)估(圖 1),序列矩陣中的空格“gaps”的處理選擇“partial deletion”[25]。

3 結(jié)果與分析

3.1 分子系統(tǒng)學(xué)分析結(jié)果

根據(jù)三個(gè)蛋白質(zhì)基因和ITS組合序列矩陣的分子系統(tǒng)學(xué)分析結(jié)果顯示我國(guó)菌株AS3.8022和CGMCC 3.15382與熱微黃籃狀菌的模式菌株CBS 147313 聚在一個(gè)分支,AS3.16376與卡迪斯籃狀菌的模式菌株CBS 169.81聚在一起,bootstrap支持率均分別為100%和99%。通過(guò)上述傳統(tǒng)分類學(xué)和DNA序列系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析方法對(duì)這兩株菌進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒定,參考我國(guó)已發(fā)表的籃狀菌物種,確定熱微籃狀菌和卡迪斯籃狀菌為我國(guó)新記錄種(圖1～3)。

注:自展法(bootstrap)評(píng)估值≥70%的分支標(biāo)記在分支節(jié)點(diǎn)處,T 表示模式菌株,粗體表示新記錄種。—:標(biāo)尺為 0.02每核苷酸替代率。

3.2 新記錄種描述

熱微黃籃狀菌,如圖2。

注:(a,b)在CYA和MEA上25 ℃培養(yǎng)7天的菌落;(c～e)分生孢子梗;(f)分生孢子;標(biāo)尺為10 μm。

TalaromycescalidominioluteusHoubraken &Pyrri, J. Fungi 7: 993, 2021[5]。

在查氏酵母膏瓊脂(CYA)上25 ℃培養(yǎng)7天,形成直徑16～20 mm的菌落,稍厚,菌落表面平坦或稍帶溝紋,中央凸起,菌落邊緣整齊;呈絨狀菌落質(zhì)地;產(chǎn)大量分生孢子,顏色呈深灰綠色,近于安多佛綠色至艾綠色Andover Green to Artemisia Green(R. Pl. XLVII);菌絲體呈白色至硫磺黃色Sulphur Yellow(R. Pl. V);不產(chǎn)或產(chǎn)微量無(wú)色滲出液;產(chǎn)適量可溶性色素,黃褐色至橙皮黃色Orange Buff(R. Pl. III);菌落背面橙赤褐色至煅赭褐色Orange Rufous to Burnt Sienna(R. Pl. II)。

在麥芽精瓊脂(MEA)上25 ℃培養(yǎng)7天,形成直徑13～23 mm的菌落,稍厚,菌落表面平坦,邊緣整齊;呈絨狀菌落質(zhì)地;產(chǎn)大量分生孢子,顏色呈安多佛綠色至艾綠色Andover Green to Artemisia Green(R. Pl. XLVII);菌絲體呈白色至硫磺黃色Sulphur Yellow(R. Pl. V);不產(chǎn)滲出液及可溶性色素;菌落背面呈旱金蓮皮黃色Capucine Buff(R. Pl. III)。在CYA上37 ℃培養(yǎng)7天,未萌發(fā)。

從表面菌絲產(chǎn)生分生孢子梗,分生孢子梗莖100～200 μm × 2.5～3.5 μm,壁光滑;帚狀枝雙輪生,排列較緊密,偶見(jiàn)1～2個(gè)副枝;梗基每輪3～10個(gè),10～16 μm × 2.5～3.5 μm;瓶梗披針形,每輪3～8個(gè),10～13 μm × 2～3 μm;分生孢子呈橢球形至檸檬形,3～4 μm × 2～2.5 μm,壁光滑。

分布和基物:安徽黃山土壤(AS3.8022);新疆阜康梧桐溝土壤(CGMCC3.15382)。

卡迪斯籃狀菌,如圖3。

注:(a,b)在CYA和MEA上25 ℃ 培養(yǎng)7天的菌落;(c～e) 分生孢子梗;(f) 分生孢子,標(biāo)尺為10 μm。

Talaromycesgaditanus(C. Ramírez and A.T. Martínez) Houbraken and Soccio, J. Fungi 7: 993, 2021[5]。

在查氏酵母膏瓊脂(CYA)上25 ℃培養(yǎng)7天,形成直徑11～12 mm的菌落,較薄,菌落表面不平坦,邊緣整齊;呈絨狀菌落質(zhì)地;產(chǎn)稀疏分生孢子,顏色呈玉石綠色Jade Green(R. Pl. XXXI);菌絲體呈白色夾雜淡紅色;不產(chǎn)滲出液;產(chǎn)生適量可溶性色素,呈猩紅色Scarlet(R. Pl. I);菌落背面呈牛血紅色Ox-blood Red(R. Pl. I)。

在麥芽精瓊脂(MEA)上25 ℃培養(yǎng)7天,形成直徑22～23 mm的菌落,較厚,表面具較多輻射狀皺紋,邊緣呈流蘇狀;呈短絮狀菌落質(zhì)地;分生孢子無(wú)或稀疏,分布于中央,顏色呈玉石綠色Jade Green(R. Pl. XXXI);產(chǎn)綠黃色菌絲體Green-Yellow(R. Pl. V);不產(chǎn)滲出液及可溶性色素;菌落背面呈生赤者褐色Raw Sienna (R. Pl. III)。

在CYA上37 ℃培養(yǎng)7天,未萌發(fā)。

從表面菌絲產(chǎn)生分生孢子梗,分生孢子梗莖100～200 μm × 2.5～3.5 μm,壁光滑;產(chǎn)生雙輪生帚狀枝的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu);?；枯?～8個(gè),排列緊密,10～13 μm × 2.5～3.5 μm;瓶梗呈披針形,每輪4～8個(gè),排列緊密,9～13 μm × 2～3 μm;產(chǎn)生檸檬形分生孢子,2.5～4 μm × 2～3 μm,壁光滑。

分布和基物:西藏日喀則定結(jié)縣土壤(DJ6-12=AS3.163 76)。

4 討論

本文報(bào)道的這兩個(gè)新記錄種屬于微黃籃狀菌群(T.minioluteusspecies group),該群目前包括8個(gè)種,即非洲籃狀菌(T.africanusHoubraken, Pyrri &Visagie)、熱微黃籃狀菌、重慶籃狀菌(T.chongqingensisX.C. Wang &W.Y. Zhuang)、卡迪斯籃狀菌、日耳曼籃狀菌(T.germanicusHoubraken &Pyrri)、微黃籃狀菌(T.minioluteus(Dierckx) Samson, N. Yilmaz, Frisvad &Seifert)、明尼蘇達(dá)籃狀菌(T.minnesotensisGuevara-Suarez, Cano &Dania García)和薩姆森籃狀菌(T.samsonii(Quintan.) Houbraken &Pyrri)。熱微黃籃狀菌在形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上均與非洲籃狀菌關(guān)系最近,卡迪斯籃狀菌在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上與重慶籃狀菌、微黃籃狀菌、薩姆森籃狀菌關(guān)系較近[5],我們的研究也顯示同樣的結(jié)果(圖 1)。

熱微黃籃狀菌此前只發(fā)現(xiàn)于荷蘭、伊朗、泰國(guó)和尼日利亞,GenBank目前只有11個(gè)菌株的序列[5]。在菌落特征上,我國(guó)的兩個(gè)菌株AS3.8022和CGMCC 3.15382在CYA上25 ℃時(shí)比模式菌株CBS 147313(DTO 052-G3)生長(zhǎng)慢(16～20 mm vs. 20～30 mm),在MEA上,模式菌株產(chǎn)生橙褐色(orange-brown)滲出液,而我國(guó)菌株不產(chǎn)滲出液。其它菌落特征,如菌落質(zhì)地、分生孢子產(chǎn)量和顏色以及菌絲體顏色均與模式菌株類似。在顯微特征上,我國(guó)菌株與模式菌株在帚狀枝及各其個(gè)部分的形態(tài)和維度與模式菌株幾乎沒(méi)有差別。我國(guó)這兩個(gè)菌株四個(gè)遺傳標(biāo)記序列完全相同,它們與模式菌株的BenA序列無(wú)差別(ON569410和OQ992535 vs. OK338786),CaM序列有7個(gè)堿基差別(OQ626763和OQ992536 vs. OK338817),Rpb2序列只差2個(gè)堿基(OQ626765和OQ992537 vs. OK338837),ITS序列只有1個(gè)堿基的差異(OQ608443和OQ981605 vs. OK339612)。基于BenA-CaM-Rpb2-ITS組合序列的發(fā)育樹(shù)顯示這兩個(gè)菌株與模式菌株同在一個(gè)分支且bootstrap支持率為99%(圖 1)。

卡迪斯籃狀菌此前只發(fā)現(xiàn)于西班牙、荷蘭、丹麥和美國(guó),GenBank目前只有7個(gè)菌株的序列[5]。我國(guó)菌株AS3.16376與模式菌株CBS 169.81(DTO 228-B8)在CYA菌落形態(tài)上差別較大,我國(guó)菌株生長(zhǎng)局限,產(chǎn)稀疏的分生孢子,菌絲體白色夾雜淡紅色,產(chǎn)較多紅色可溶性色素,菌落背面呈牛血紅色;而模式菌株則生長(zhǎng)適度,產(chǎn)較多分生孢子,菌絲體呈淺黃色,不產(chǎn)可溶性色素,菌落背面呈褐色[5]。這可能由于不同菌株利用硝態(tài)氮的能力不同,而且不同氮源對(duì)真菌生長(zhǎng)和次級(jí)代謝具有很大影響[26]。但它們?cè)贛EA上的菌落特征非常相近,均形成絮狀綠黃色菌絲體和稀疏的分生孢子,不產(chǎn)滲出液和可溶性色素,背面呈褐色。我國(guó)菌株與模式菌株的顯微結(jié)構(gòu)各部分的形態(tài)和尺度幾乎無(wú)差別。它們的BenA序列只有2個(gè)堿基差異(ON569411 vs. OK338775),CaM序列有5個(gè)堿基差別(OQ626764 vs.OK338802),Rpb2序列有5個(gè)堿基的差異(ON569397 vs.OK338827),ITS序列只有1個(gè)堿基差別(OQ608444 vs.MH861318)。根據(jù)BenA-CaM-Rpb2-ITS組合序列的發(fā)育樹(shù)顯示AS3.16376與模式菌株同在一個(gè)分支且bootstrap支持率為100%(圖1)。

目前人類食用色素主要來(lái)源于植物、動(dòng)物材料的提取物,如花青素、類胡蘿卜素、甜菜苷、姜黃素和胭脂紅酸等。這些色素原料的種植和養(yǎng)殖消耗大量自然資源、人力和能源,并產(chǎn)生大量廢棄物和二氧化碳,若采用微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)則會(huì)大幅降低成本并減少?gòu)U棄物和二氧化碳排放,如工業(yè)上用三孢布拉霉(BlakesleatrisporaThaxt.)生產(chǎn)β-胡蘿卜素,紅發(fā)夫酵母(PhaffiarhodozymaM.W. Mill., Yoney. &Soneda)生產(chǎn)蝦青素,紫色紅曲和紅色紅曲(MonascuspurpureusWent和M.ruberTiegh.)生產(chǎn)紅曲色素等[27]。紅曲色素屬于嗜氮酮類色素,該類色素是一類非常具有開(kāi)發(fā)前景的天然色素。除了紅曲屬(MonascusTiegh.)外,已報(bào)道還有8屬真菌可以產(chǎn)生嗜氮酮類色素,其中籃狀菌屬和青霉屬(PenicilliumLink)是產(chǎn)生嗜氮酮類色素最具潛力的兩個(gè)屬[28]。已有報(bào)道,利用暗玫瑰籃狀菌發(fā)酵生產(chǎn)一種嗜氮酮類色素,即暗玫瑰素S(atrorosin S),產(chǎn)量可達(dá)0.9 g/L,而且成本低、純度高、無(wú)任何真菌毒素[29, 30]。除了本文提到的這四個(gè)產(chǎn)色素的物種外,籃狀菌至少還有21個(gè)種產(chǎn)生嗜氮酮類色素[31]。我國(guó)幅員遼闊,氣候類型復(fù)雜多變,自然環(huán)境多種多樣,隨著研究技術(shù)的進(jìn)步,如傳統(tǒng)分類學(xué)技術(shù)結(jié)合環(huán)境基因組學(xué)(environmental metagenomics),將會(huì)有更多的籃狀菌新種和新記錄種被發(fā)現(xiàn),為真菌資源的研究、開(kāi)發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。