復(fù)方降糖玉液調(diào)節(jié)JAK2/STAT3/SOCS-1通路對(duì)糖尿病腎損傷大鼠的保護(hù)作用研究

古麗努爾·艾尼,劉春麗,王彥娥

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830054)

糖尿病腎損傷是糖尿病進(jìn)展過程中常見的并發(fā)癥,臨床以腎小球?yàn)V過率降低及蛋白尿?yàn)橹饕卣?隨著疾病進(jìn)展會(huì)發(fā)展成為腎衰竭,危及患者生命。目前研究認(rèn)為,糖尿病腎損傷的發(fā)生發(fā)展與糖代謝異常、腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變、腎組織氧化應(yīng)激損傷、腎臟中異位脂肪沉積等多種因素有關(guān)[1-3]。酪氨酸蛋白激酶2(JAK2)/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)/細(xì)胞因子信號(hào)抑制物1(SOCS-1)通路是近年來研究發(fā)現(xiàn)的與糖尿病腎損傷密切相關(guān)的信號(hào)通路[4],調(diào)節(jié)該通路及相關(guān)蛋白的異常表達(dá)能夠顯著修復(fù)糖尿病大鼠腎組織損傷[5]。復(fù)方降糖玉液是基于中醫(yī)理論由多種中藥材組成的中藥成方制劑,臨床用于糖尿病及其并發(fā)癥的治療療效較好。本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察了復(fù)方降糖玉液對(duì)糖尿病腎損傷的修復(fù)作用及對(duì)JAK2/STAT3/SOCS-1通路的影響,旨在明確其藥理作用,為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠72只,6～8周齡,體重200～220 g,購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(新)2018-0002。飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～25 ℃,相對(duì)濕度40%～70%,晝夜交替12 h,自由飲食。

1.2設(shè)備與儀器 CKX41-F32FL熒光倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司);SpectraMax iD5酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司);S700石蠟切片機(jī)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);BK-280全自動(dòng)生化分析儀(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司);STX622電子天平(奧豪斯國際貿(mào)易有限公司);Gel Doc EZ凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司);M16RS高速冷凍離心機(jī)(上海邁皋科學(xué)儀器有限公司)。

1.3藥品及試劑 復(fù)方降糖玉液(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑,由黃芪15 g、生曬參10 g、制首烏10 g、黃精15 g、生地20 g、三七10 g、天花粉15 g組成,批號(hào):11120021);厄貝沙坦(海正輝瑞制藥有限公司,批號(hào):CA161,規(guī)格:150 mg/片);高糖高脂飼料(北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):1012);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司,貨號(hào):P4812);白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(上海酶研生物科技有限公司,貨號(hào):EK-R36877);單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)ELISA試劑盒(上海繼和生物科技有限公司,貨號(hào):JH-H10542);JAK2(貨號(hào):ab108596)、p-JAK2(貨號(hào):ab32101)、STAT3(貨號(hào):ab68153)、p-STAT3(貨號(hào):ab267373)、SOCS-1(貨號(hào):ab280886)、GAPDH(貨號(hào):ab181602)兔單克隆抗體(艾博抗貿(mào)易有限公司),辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(艾博抗貿(mào)易有限公司,貨號(hào):ab150077);二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒(貨號(hào):PC0020)、TUNEL試劑盒(貨號(hào):T2130)、HE染色試劑盒(貨號(hào):G1120)、磷酸鹽緩沖液(貨號(hào):P1031)(北京索萊寶科技有限公司);蛋白酶K(碧云天生物科技有限公司,貨號(hào):ST533);含DAPI抗熒光淬滅封片液(碧云天生物科技有限公司,貨號(hào):P0131)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 隨機(jī)取12只大鼠作為空白組,其余60只大鼠參考文獻(xiàn)[6-7]方法建立糖尿病腎損傷模型:采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周后,大鼠禁食12 h,一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg,大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)7 d,采尾靜脈血測定血糖(采血前大鼠禁食6 h),以血糖≥7 mmol/L視為糖尿病模型建立成功,繼續(xù)喂養(yǎng)4周并收集24 h尿液,測定尿蛋白量,以空腹血糖≥16.7 mmol/L同時(shí)24 h尿蛋白量≥30 mg/24 h視為糖尿病腎損傷造模成功。將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、厄貝沙坦及復(fù)方降糖玉液低、中、高劑量組,每組12只。復(fù)方降糖玉液低、中、高劑量組按照成人給藥劑量的6.25倍計(jì)算,分別給予2.5 g/kg、5 g/kg、10 g/kg(以生藥含量計(jì))復(fù)方降糖玉液灌胃,厄貝沙坦組參考文獻(xiàn)[8-9]給予厄貝沙坦0.02 g/kg灌胃,空白組及模型組給予生理鹽水灌胃,均 1次/d,連續(xù)8周。

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.124 h尿蛋白定量及空腹血糖 末次灌胃后,收集各組大鼠24 h尿液,測定24 h尿蛋白定量。末次灌胃后24 h,禁食6 h,尾靜脈取血,血糖儀測定空腹血糖水平。

1.5.2糖化血紅蛋白及腎功能指標(biāo) 大鼠稱重后,采用10%水合氯醛麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈取血至干凈離心管,全自動(dòng)生化分析儀測定糖化血紅蛋白、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)水平。

1.5.3腎指數(shù)及腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量 處死大鼠,取腎組織并稱重,計(jì)算腎指數(shù),腎指數(shù)=腎質(zhì)量(mg)/體重(g)×100%。取腎組織,研磨勻漿后離心取上清,使用相應(yīng)試劑盒測定TNF-α、IL-1β、MCP-1含量。

1.5.4腎組織病理形態(tài) 分離腎組織,制成5 μm石蠟切片,常規(guī)HE染色,置于顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察。

1.5.5腎組織細(xì)胞凋亡情況 取制備好的5 μm石蠟切片,使用二甲苯脫蠟后,梯度乙醇至水,滴加20 μg/mL的蛋白酶K抗原修復(fù)后,磷酸鹽緩沖液清洗3次,滴加50 μL的TUNEL染色液,37 ℃條件下避光孵育60 min,再次使用磷酸鹽緩沖液清洗3次,滴加含有DAPI的抗熒光淬滅劑,蓋上蓋玻片,置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照。細(xì)胞凋亡率=TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5.6腎組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3及SOCS-1蛋白表達(dá)情況 取腎組織,研磨勻漿后離心取上清,試劑盒測定蛋白含量并取含有50 μg蛋白的上清液,經(jīng)電泳分離、轉(zhuǎn)膜及脫脂牛奶封閉后,用GAPDH、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS-1兔抗體按照1∶1 000稀釋后4 ℃孵育過夜,TBST清洗并用山羊抗兔二抗在室溫下按照1∶2 000稀釋后孵育1 h,使用化學(xué)發(fā)光液在凝膠成像系統(tǒng)拍照,以GAPDH為內(nèi)參,Image J 1.8.0計(jì)算JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS-1蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行分析處理,計(jì)量資料呈正態(tài)分布,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較使用LSD檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血糖及腎功能指標(biāo)比較 模型組大鼠24 h尿蛋白定量、空腹血糖、糖化血紅蛋白、BUN、SCr水平均明顯高于空白組(P均<0.05);復(fù)方降糖玉液各組及厄貝沙坦組大鼠24 h尿蛋白定量、空腹血糖、糖化血紅蛋白、BUN、SCr水平均明顯低于模型組,且上述各指標(biāo)均隨復(fù)方降糖玉液劑量的增加而逐漸降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表1。

表1 空白組和糖尿病腎損傷各組大鼠血糖及腎功能指標(biāo)比較

2.2各組大鼠腎指數(shù)及腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量比較 模型組大鼠腎指數(shù)及腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量均明顯高于空白組(P均<0.05);復(fù)方降糖玉液各組及厄貝沙坦組大鼠腎指數(shù)及腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量均明顯低于模型組,且上述各指標(biāo)均隨復(fù)方降糖玉液劑量的增加而逐漸降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表2。

表2 空白組和糖尿病腎損傷各組大鼠腎指數(shù)及腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量比較

2.3各組大鼠腎組織病理學(xué)形態(tài) 空白組大鼠腎組織病理形態(tài)正常;模型組大鼠腎組織有明顯炎癥細(xì)胞浸潤,細(xì)胞排列不整齊,腎小管擴(kuò)張;與模型組比較,復(fù)方降糖玉液各組及厄貝沙坦組大鼠腎組織炎癥浸潤減輕,細(xì)胞排列整齊,腎小管無明顯擴(kuò)張。見圖1。

圖1 空白組和糖尿病腎損傷各組大鼠腎組織病理學(xué)HE染色表現(xiàn)(×200)

2.4各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡情況比較 空白組大鼠腎組織細(xì)胞無明顯凋亡;模型組大鼠腎組織細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡,凋亡率明顯高于空白組(P<0.05);復(fù)方降糖玉液各組及厄貝沙坦組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡減少,細(xì)胞凋亡率均明顯低于模型組,且細(xì)胞凋亡率隨著復(fù)方降糖玉液劑量的增加而逐漸降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖2及圖3。

圖2 空白組和糖尿病腎損傷各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡染色情況(×200)

圖3 空白組和糖尿病腎損傷各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡率

2.5各組大鼠腎組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS-1蛋白表達(dá)情況 與空白組比較,模型組大鼠腎組織中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值均明顯升高(P均<0.05),腎組織中 SOCS-1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低(P<0.05);與模型組比較,復(fù)方降糖玉液各組及厄貝沙坦組大鼠腎組織中p-JAK2/ JAK2、p-STAT3/STAT3比值均明顯降低,腎組織中 SOCS-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高,且上述各指標(biāo)均隨復(fù)方降糖玉液劑量的增加變化更明顯,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見圖4。

圖4 空白組和糖尿病腎損傷各組大鼠腎組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS-1蛋白表達(dá)情況

3 討 論

糖尿病腎損傷是由于糖尿病患者長期血糖控制不良引起的腎組織病變,目前以對(duì)癥治療為主,其中厄貝沙坦因具有降壓、調(diào)節(jié)腎臟血流及保護(hù)腎細(xì)胞作用而被廣泛用于高血壓合并2型糖尿病腎損傷的治療,所以本實(shí)驗(yàn)將其作為陽性對(duì)照藥物。但現(xiàn)有的治療手段均不能改變糖尿病腎損傷最終進(jìn)展為終末期腎病的結(jié)局[10],所以研發(fā)糖尿病腎損傷的治療藥物尤為迫切。

中醫(yī)理論認(rèn)為,糖尿病腎損傷主要是由于脾腎虧虛,濁毒內(nèi)蘊(yùn),進(jìn)而導(dǎo)致腎絡(luò)瘀結(jié),腎用失司,腎陰虧虛,津液不足,脈絡(luò)虧虛,澀滯成瘀,所以中醫(yī)認(rèn)為糖尿病腎損傷的治療應(yīng)以益氣活血、扶正化瘀為主[11-12]。復(fù)方降糖玉液方中以黃芪、生曬參、制首烏補(bǔ)肝腎,益精血,起到補(bǔ)氣固表之功效;以黃精補(bǔ)氣養(yǎng)陰,健脾益腎;生地清熱涼血、養(yǎng)陰生津;三七散瘀止血,消腫定痛;天花粉生津止渴;全方使陽升而陰應(yīng),進(jìn)而起到益氣補(bǔ)血、滋陰補(bǔ)腎之功效。本實(shí)驗(yàn)研究表明,復(fù)方降糖玉液各組及厄貝沙坦組大鼠24 h尿蛋白定量、空腹血糖、糖化血紅蛋白、BUN、SCr、腎指數(shù)、腎組織細(xì)胞凋亡率均明顯低于模型組,腎組織炎癥浸潤明顯減輕,且各項(xiàng)指標(biāo)隨著復(fù)方降糖玉液劑量的增加變化更明顯。提示復(fù)方降糖玉液可呈劑量依賴性地減輕蛋白尿,控制血糖水平,保護(hù)腎功能,減輕腎損傷,抑制腎組織細(xì)胞凋亡。

近年來研究表明,糖尿病腎損傷的發(fā)生及進(jìn)展與JAK2/STAT3通路激活及炎癥反應(yīng)有關(guān),TNF-α、IL-1β、MCP-1與腎組織的炎癥反應(yīng)有關(guān),JAK2/STAT3/SOCS-1通路活化會(huì)導(dǎo)致TNF-α、IL-1β、MCP-1水平異常升高,進(jìn)而導(dǎo)致大鼠腎組織炎癥損傷的發(fā)生及進(jìn)展[13];而下調(diào)腎組織中p-JAK2、p-STAT3表達(dá),上調(diào)SOCS-1表達(dá)可減輕糖尿病腎損傷[13-15]。Porro等[16]研究證實(shí),升高SOCS-1水平能夠顯著降低JAK/STAT通路相關(guān)蛋白水平,進(jìn)而顯著抑制炎癥反應(yīng)并促進(jìn)抗炎因子的釋放,進(jìn)而抑制組織損傷。Morelli 等[17]研究表明,升高SOCS-1水平則能夠通過抑制JAK/STAT通路的激活,進(jìn)而有效降低IFN-γ及IL-22等炎癥因子對(duì)組織器官的過度刺激作用,抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生。由此可見,調(diào)節(jié)JAK2/STAT3/SOCS-1通路及相關(guān)蛋白的表達(dá)水平可能是治療糖尿病腎損傷的有效途徑。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量和p-JAK2/JAK2、p-STAT3/ STAT3比值均明顯升高,腎組織中 SOCS-1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低;與模型組比較,復(fù)方降糖玉液各組大鼠腎組織中TNF-α、IL-1β、MCP-1含量和p-JAK2/ JAK2、p-STAT3/ STAT3比值均明顯降低,腎組織中 SOCS-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高。提示復(fù)方降糖玉液能夠呈劑量依賴性地抑制JAK2/STAT3/SOCS-1通路激活,下調(diào)TNF-α、IL-1β、MCP-1水平,從而減輕腎組織炎癥損傷,保護(hù)腎組織細(xì)胞。

綜上所述,復(fù)方降糖玉液能夠明顯降低糖尿病腎損傷大鼠的尿蛋白和血糖,保護(hù)腎功能,抑制腎組織細(xì)胞凋亡,減輕腎組織損傷,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)JAK2/STAT3/SOCS-1通路,抑制TNF-α、IL-1β、MCP-1表達(dá),減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。