雞源大腸桿菌的抗藥性檢測研究

文│方杰（山東省青島市即墨區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局）

為掌握獸醫(yī)藥敏試驗技術(shù)，結(jié)合山東省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所公共衛(wèi)生試驗室的具體任務(wù)，對193株大腸桿菌，用高通量96點陣藥敏檢測儀檢測這些菌株對9種常用藥物（氨芐西林、氟苯尼考、頭孢噻呋、慶大霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、多西環(huán)素、新霉素、硫酸粘菌素）的最低抑菌濃度（MIC），結(jié)合圖像分析技術(shù)、數(shù)據(jù)庫技術(shù)和互聯(lián)網(wǎng)，構(gòu)建山東省抗藥性監(jiān)測網(wǎng)。研究結(jié)果表明，雞源大腸桿菌抗藥性普遍，應(yīng)通過建立獸醫(yī)抗藥性監(jiān)測網(wǎng)進行匯集和統(tǒng)一監(jiān)管，為抗菌藥物的有效使用提供依據(jù)和保障。

細菌抗藥性問題是困擾當今人類衛(wèi)生事業(yè)和畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展的重大難題，而藥敏試驗是衡量菌藥互作結(jié)果的技術(shù)方法，對敏感性不明確的分離菌株進行試驗，測試抗菌藥物在體外條件下對病原微生物有無抑制作用，檢測病原菌對各種抗菌藥物的敏感性，以此來指導(dǎo)抗菌藥物的使用。

雞大腸桿菌病是集約化雞場的常見疾病之一，廣泛流行于各大養(yǎng)殖場，且大腸桿菌具有血清型眾多、易繼發(fā)、地域性強、抗藥性突出、發(fā)病率高等特點。對肉雞糞便中分離的大腸桿菌進行9種臨床常用抗生素的藥敏檢測，旨在綜合分析動物源大腸桿菌的抗藥性流行病學，結(jié)合數(shù)據(jù)庫技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)技術(shù)建立獸醫(yī)抗藥性監(jiān)測網(wǎng)，為抗菌藥物的有效使用提供依據(jù)和保障。

一、試驗材料

試驗菌株。大腸桿菌標準菌株（E. coli ATCC 25922），采集于肉雞糞便。

二、試驗方法

1.大腸桿菌的復(fù)蘇與鑒定。

（1）試驗材料的制備。麥康凱平板的制備，用量筒稱量所需量的純凈水于錐形瓶中，然后用電子分析天平準確稱量所需量的麥康凱瓊脂粉末，倒入錐形瓶中（1升水加55克麥康凱瓊脂粉末）；MHA瓊脂的制備，同上，稱量一定量的水和MHA瓊脂粉末于錐形瓶中，（1升水加38克MHA瓊脂粉末）。將混合后的瓊脂用封口膜和報紙封口并用皮筋扎緊后放入高壓鍋中于121℃、15分鐘條件下滅菌。滅菌后在烘箱內(nèi)烘干，并冷卻到合適溫度后在超凈臺中倒入平板中，待瓊脂完全冷卻后將平板收好待用。

（2）待測菌復(fù)蘇。首先，將試驗室保存的大腸桿菌從-20℃的菌株保存箱中取出，把裝有待檢測菌的EP管放到漩渦振動器上震蕩均勻，將待測菌株移到超凈臺中，將配置好的MHA固體瓊脂培養(yǎng)基標號與待測樣品對應(yīng)。在無菌條件下，用接種針蘸取待測菌株在MHA固體瓊脂培養(yǎng)基上劃線。為保證劃出單菌落，在劃第二區(qū)時進行燒針，同時為保證不發(fā)生交叉污染，在劃完一株菌時也要進行燒針。但要注意燒針后要將針冷卻，防止將待測菌燒死，影響試驗結(jié)果。劃線后將所劃平板與兩株大腸桿菌標準菌株25922所劃平板放置于37℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)12～18小時。

2.藥敏試驗菌液的制備。

（1）生理鹽水的制備。用量筒稱量400毫升蒸餾水倒入錐形瓶中，然后用電子分析天平準確稱量3.6克氯化鈉溶于蒸餾水中，121℃ 15分鐘條件下滅菌，冷卻后在超凈臺內(nèi)用1000微升移液槍吸取1毫升分裝于2毫升無菌EP管中待用。

（2）菌株制備。將上述符合條件的MHA平板在超凈臺中用接種環(huán)挑取單菌落，放入盛有1毫升生理鹽水的EP管中。挑取時注意不要碰到其他菌落。挑取結(jié)束后將盛有瓊脂的EP管于漩渦振蕩器上震蕩2～3分鐘，使細菌完全與瓊脂分離，并在生理鹽水中分布均勻。

3.藥敏檢測。

（1）MHA瓊脂的制備與分裝。用量筒稱量所需的蒸餾水于錐形瓶中，然后用電子分析天平準確稱量所需的MHA瓊脂粉末倒入錐形瓶中混合，將混合后的瓊脂置于電爐上加熱煮沸，用移液器分裝到玻璃模制注射劑瓶中，每瓶裝18毫升，將分裝好的小瓶塞上瓶塞。

（2）藥物的配制與質(zhì)控。藥物的配制：參照CLSI標準VET01-S2上抗菌藥物相應(yīng)的R值制備待測抗菌藥物（母液濃度為200倍的R值），并用相應(yīng)的溶劑進行溶解（如表1所示），使用已滅菌的一次性過濾器過濾，經(jīng)一次性針管轉(zhuǎn)移至滅菌10毫升離心管中待用。（備注：氟苯尼考、硫酸新霉素CLSI標準沒有給出標準，本試驗室參照CLSI標準同類藥物氯霉素、慶大霉素標準。）

表1 藥物配制的溶劑及濃度

藥物的質(zhì)控：根據(jù)CLSI建立的標準（CLSI4th2013）藥敏方法，參考其規(guī)定的質(zhì)控范圍（如表2），采用微量肉湯稀釋法用E. coli ATCC25922進行質(zhì)控。

表2 大腸桿菌對九種抗菌藥物的MIC解釋標準及質(zhì)控范圍微克/毫升

首先，將盛有大腸桿菌標準菌的EP管置于37℃恒溫搖床中搖12～18小時，然后在無菌條件下用移液槍吸400微升用MHB肉湯稀釋待用（一般稀釋10倍），吸取2毫升稀釋好的菌液加到比色皿中，在600納米波長條件下以MHB肉湯為空白對照，用紫外分光光度計測的OD值在0.08～0.1之間，此時菌液濃度在107～108之間符合標準。

用上述標準菌在96孔板上采用肉湯稀釋法對試驗所用9種藥物進行質(zhì)控，以確保試驗的準確性。

（3）藥物平板的制備。藥物平板的制備：按照不同抗菌藥物設(shè)定的不同濃度梯度將藥物進行倍比稀釋后，在無菌條件下加入上述分裝好含有18毫升MHA瓊脂的鈉鈣玻璃模制注射劑瓶中。藥物充分混合后迅速倒入藥敏檢測平板中，倒板時要注意不要倒出氣泡，倒完后待瓊脂冷卻后將蓋子蓋上，標注好藥物與濃度待接種試驗用。如氨芐西林的平板制備，用移液槍準確吸取4毫升藥物母液后再用移液槍吸取1毫升無菌水稀釋藥物，連續(xù)吹打藥物混勻后得到16R的藥物，然后再用移液槍將混合后的藥物吸出1毫升棄掉，從剩余4毫升藥物中吸出2毫升加到盛有瓊脂的小瓶中混勻，將剩余的2毫升藥物再加2毫升無菌水稀釋到8R，以此類推進行倍比稀釋，直至我們需要的最低濃度，完成藥板的制備。

三、結(jié)果與分析

1.動物源大腸桿菌的MIC頻率。采樣批次的雞源大腸桿菌對9種藥物的整體抗藥性水平較高，敏感性存在一定的差異性?？梢钥闯觯鶞y菌株對氟苯尼考的敏感性較高，抗藥率僅為13.99%；其次是硫酸粘菌素，其抗藥率為22.28%；頭孢噻呋和環(huán)丙沙星的敏感性也比較高，抗藥率分別為22.8%和25.39%；氨芐西林的抗性菌數(shù)量多，抗藥性較高，達到53.37%；多西環(huán)素的抗藥率也比較高，為50.26%；慶大霉素出現(xiàn)了兩極分化，抗藥率為37.38%；恩諾沙星和新霉素的細菌抗藥性也比較高，分別為47.15%和39.9%。

2.雞源大腸桿菌的多重抗藥性研究。多重抗藥菌是指一種病原菌對三類或三類以上抗菌藥物同時產(chǎn)生抗藥性的現(xiàn)象。本試驗選取的9種藥物分別屬于6種不同種類的藥物，對6種藥物的多重抗藥情況進行統(tǒng)計。

由表3可知，193株雞源大腸桿菌中有87株菌具有多重抗藥性，多重抗藥率達到45.08%。其中對四、五類藥物均有抗藥性的菌株共46株，有10株更是對六類抗菌藥物都具有抗藥性。不具有多重抗藥性的菌株共有106株，對所有藥物都保持敏感性的只有24株，一耐和二耐共82株。

表3 雞源大腸桿菌的多重抗藥情況

四、討論

1.試驗過程的關(guān)鍵細節(jié)。試驗過程中很多關(guān)鍵細節(jié)關(guān)系到藥敏試驗結(jié)果的準確性和有效性。對以往采集菌種進行復(fù)蘇是為了保證細菌活力，防止菌株保藏時間過長而導(dǎo)致細菌活力降低，不能正常生長而影響試驗結(jié)果；菌種鑒定是為了防止采樣時混有雜菌。菌污染或采樣時誤采其他細菌等因素會影響試驗結(jié)果；操作環(huán)境的嚴格無菌是為了防止其他細菌污染，從而影響試驗結(jié)果；試驗過程中對大腸桿菌培養(yǎng)液測定OD值是為了確定菌株接種濃度符合標準，使試驗規(guī)范具有可信度；對待測藥物進行質(zhì)量控制是為了檢測藥物是否符合標準，防止因藥物不符合標準或失效等問題影響試驗結(jié)果。

2.96點陣藥敏檢測儀的優(yōu)勢。在采樣數(shù)量龐大的前提下，本試驗運用96點陣藥敏檢測儀系統(tǒng)進行科學的藥敏試驗，得到樣本的具體MIC，簡便快捷。比起微量肉湯稀釋法更加節(jié)約成本、節(jié)省資源、簡單高效、科學準確；比起紙片擴散法測量抑菌圈直徑，該方法可以得到具體的MIC值，方便給臨床選藥和確定用量提供更直接的理論依據(jù)。而連接計算機設(shè)備的數(shù)字化讀數(shù)方法更是將主觀誤差減到最小。