松蘿提取物對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠HMGB1-RAGE通路及自噬相關(guān)基因的影響

趙青青,安 陽(yáng),張 軍,徐 暉,陸道敏,曹躍朋,寧喬怡,王 瑩

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴陽(yáng) 550001;2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,貴陽(yáng) 550001)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種自身免疫性疾病,其主要病理改變?cè)诨そM織,以對(duì)稱性、破壞性關(guān)節(jié)炎為特征,致殘率高[1]?；ぜ?xì)胞自噬參與了RA關(guān)節(jié)的炎癥與損壞,高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein,HMGB1)是重要的細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)基因,近年來(lái)研究認(rèn)為其與高親和力受體也就是晚期糖基化終產(chǎn)物受體(the receptor of advanced glycation endproducts,RAGE)結(jié)合,促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞(synovialfibroblast,SF)遷移、增殖和分化,進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞和功能喪失[2]。研究證實(shí),HMGB1-RAGE可以激活死亡相關(guān)蛋白激酶(death-associated protein kinase,DAPK)促使Beclin1磷酸化,誘導(dǎo)Beclin1與B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)分離,調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬[3],調(diào)控關(guān)節(jié)炎癥。

侗藥松蘿性味甘、平,有除濕通絡(luò)、清熱解毒之功。有研究證實(shí),松蘿提取物有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑制血管生成等作用[4]。課題組在前期的臨床研究中證實(shí)松蘿的組方可改善RA患者的臨床癥狀和體征,降低炎癥水平[5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示,松蘿制劑能減輕膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型大鼠關(guān)節(jié)腫脹,降低滑膜細(xì)胞活化核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)的蛋白活性[6-7]。本研究探討松蘿提取物對(duì)HMGB1-RAGE通路及自噬相關(guān)基因的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)Wistar大鼠54只,雌性,5周齡,體重(160±10)g,購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心,許可證號(hào)SCXK(鄂)2020-0018,飼養(yǎng)于貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。電熱恒溫培養(yǎng)(ICV-450)購(gòu)自日本ASONE公司;離心機(jī)(HI650)購(gòu)自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司;HMGB1檢測(cè)試劑盒(SEA399Ra)購(gòu)自武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司;QuantiCyto?Rat IL-6 ELISA kit(ERC003.48)購(gòu)自深圳欣博盛生物科技有限公司;磷酸酶抑制劑(S1873)、RIPA裂解液(P0013B)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0010)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Taq Plus DNA Polymerase(ET105-01)購(gòu)自日本TINGEN公司;松蘿提取物[批號(hào):IU0130,其主要成分為松蘿酸(純度>98%)]、羥氯喹(HCQ,批號(hào):IH0720)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1分組和建模

飼養(yǎng)環(huán)境(22±2)℃、濕度約70%,適應(yīng)性豢養(yǎng)1周啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為松蘿提取物低劑量組、松蘿提取物中劑量組、松蘿提取物高劑量組、HCQ組、模型組、空白組[8],每組9只。

牛Ⅱ型膠原放置醋酸(0.1 mol/L)內(nèi)溶解,充分混合(2 mg/mL溶液),4 ℃冰箱靜置1 d。等量混合弗氏全佐劑同時(shí)乳化得到Ⅱ型膠原乳液,向大鼠尾根部注射0.1 mL以誘導(dǎo)炎癥,構(gòu)建穩(wěn)定的CIA大鼠模型[9]。有效建模的標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)由關(guān)節(jié)炎評(píng)分顯示模型大鼠的趾端到踝關(guān)節(jié)區(qū)域見(jiàn)紅腫現(xiàn)象,同時(shí)關(guān)節(jié)炎評(píng)分在4分以上[10]。

根據(jù)課題組先前的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)[4]及臨床成人用量(常規(guī)15 g、小量6 g、大量120 g)之間的比例,本研究松蘿提取物給藥低劑量為2 mg/kg,中劑量為6 mg/kg,高劑量為54 mg/kg。HCQ成人用量為每天400 mg,根據(jù)60 kg成人和動(dòng)物藥物劑量對(duì)應(yīng)換算系數(shù)表,雙方換算系數(shù)W=5.4,即大鼠用藥劑量為人用藥劑量的5.4倍[11],由此每只大鼠用藥量為每天36 mg。各組給予相應(yīng)藥物灌胃,空白組及模型組灌胃等量生理鹽水,每天1次,連續(xù)灌胃28 d。

1.2.2樣品采集

待最后1次灌胃結(jié)束后2 h,經(jīng)腹腔注入0.4 mL/100 g氨基甲酸乙酯行麻醉處理,采集5 mL左右的股動(dòng)脈血液室溫下靜置0.5 h,3 000 r/min離心15 min,提取血清,待后續(xù)實(shí)驗(yàn)。處死大鼠,取后右足踝關(guān)節(jié),分離出滑膜組織,檢測(cè)蛋白水平。

1.2.3ELISA檢測(cè)血清致炎因子水平

采集大鼠血液,常規(guī)離心,分離血清,ELISA檢測(cè)HMGB1、IL-6水平。按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作,37 ℃反應(yīng)30 min溫育,洗板5次,加入酶標(biāo)試劑,37 ℃反應(yīng),再洗板5次,加入顯色液A、B,37 ℃顯色10 min,加入終止液,酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度(A)值。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)Bcl-2、Beclin1和Ⅲ型磷酸肌醇3激酶(ptdlns3K Class 3,PI3K C3)mRNA表達(dá)

完成總RNA的提取和對(duì)cDNA的逆轉(zhuǎn)錄合成。合成條件:50 ℃ 2 min,95 ℃ 10 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。測(cè)定Bcl-2、Beclin1、PI3K C3 mRNA表達(dá)。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Beclin1、Bcl-2、PI3K C3引物序列

1.2.5Western blot檢測(cè)HMGB1、RAGE、Beclin1、Bcl-2和PI3K C3蛋白表達(dá)

將剪碎的滑膜組織塊勻漿,冰上裂解30 min后,在4 ℃下12 000 r/min離心5 min,取上清液。以BSA為標(biāo)準(zhǔn),Bradford 法對(duì)上清液進(jìn)行蛋白定量。隨后進(jìn)行蛋白變性,SDS-PVDF電泳,TBST封閉液浸泡PVDF膜,室溫?fù)u床封閉2 h。一抗4 ℃過(guò)夜,二抗孵育2 h,反復(fù)洗膜,顯色曝光,分析目的條帶相對(duì)灰度值。

1.2.6關(guān)節(jié)滑膜病理形態(tài)學(xué)觀察

取關(guān)節(jié)滑膜組織,4%多聚甲醛溶液,石蠟包埋,常規(guī)HE和膠原纖維染色。光鏡下觀察滑膜細(xì)胞病理改變,圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.2.7透射電子顯微鏡觀察自噬體情況

將待觀察細(xì)胞離心,洗滌,戊二醛、鋨酸固定,丙酮梯度脫水,浸泡,包埋,修塊,定位,切片,染色。在透射電鏡下觀察細(xì)胞自噬體和自噬泡的形成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)和關(guān)節(jié)腫脹情況

與模型組[(3.50±0.53)分]比較,HCQ組[(1.62±0.74)分]和松蘿提取物中、高劑量組[(2.25±0.88)分、(1.75±0.70)分]關(guān)節(jié)炎指數(shù)降低(P<0.05),關(guān)節(jié)紅腫情況明顯緩解;與HCQ組比較,松蘿提取物中、高劑量組關(guān)節(jié)炎指數(shù)、紅腫情況無(wú)明顯變化(P>0.05),松蘿提取物低劑量組[(3.00±0.75)ng/mL]關(guān)節(jié)炎指數(shù)升高(P<0.05),見(jiàn)圖1。

A:空白組,無(wú)關(guān)節(jié)發(fā)紅、腫脹;B:模型組,可見(jiàn)腳趾延續(xù)到整個(gè)踝關(guān)節(jié)重度紅腫;C:松蘿提取物低劑量組,可見(jiàn)足爪關(guān)節(jié)紅腫較模型組稍緩解;D、E、F:分別為松蘿提取物中、高劑量組及HCQ組,可見(jiàn)足爪關(guān)節(jié)紅腫明顯緩解。

2.2 關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)

空白組病理結(jié)構(gòu)正常。模型組可見(jiàn)滑膜細(xì)胞明顯增生,并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),血管翳形成。與模型組比較,各劑量松蘿提取物組及HCQ組滑膜細(xì)胞增殖程度逐漸減低,滑膜細(xì)胞層數(shù)減少,排列更整齊,見(jiàn)圖2。

A:空白組;B:模型組;C:松蘿提取物低劑量組;D:松蘿提取物中劑量組;E:松蘿提取物高劑量組;F:HCQ組。

2.3 各組大鼠IL-6、HMGB1水平

與空白組比較,模型組IL-6與HMGB1水平升高(P<0.05);與模型組比較,松蘿提取物低、中、高劑量組、HCQ組HMGB1、IL-6水平降低(P<0.05);與HCQ組比較,松蘿提取物低劑量組HMGB1、IL-6水平升高(P<0.05),松蘿提取物中、高劑量組HMGB1、IL-6水平無(wú)明顯變化(P>0.05),見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清中IL-6、HMGB1水平比較

2.4 各組大鼠滑膜組織Beclin1、Bcl-2與PI3K C3 mRNA表達(dá)

與空白組比較,松蘿提取物不同劑量組、HCQ組和模型組Bcl-2、PI3K C3 mRNA表達(dá)升高,Beclin1 mRNA表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,HCQ組和松蘿提取物中、高劑量組Bcl-2、PI3K C3 mRNA表達(dá)降低,Beclin1 mRNA表達(dá)升高(P<0.05);與HCQ組比較,松蘿提取物高、中劑量組上述指標(biāo)無(wú)明顯變化(P>0.05),見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠滑膜組織Beclin1、Bcl-2與PI3K C3 mRNA表達(dá)比較

2.5 各組大鼠滑膜組織HMGB1、RAGE、Bcl-2、PI3K C3與Beclin1蛋白表達(dá)

與空白組比較,模型組HMGB1、RAGE、Bcl-2、PI3K C3蛋白表達(dá)升高,Beclin1蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,HCQ組和松蘿提取物中、高劑量組HMGB1、RAGE、Bcl-2、PI3K C3蛋白表達(dá)降低,Beclin1蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與HCQ組比較,松蘿提取物中、高劑量組上述指標(biāo)無(wú)明顯變化(P>0.05),見(jiàn)圖3、表4。

A:空白組;B:模型組;C:松蘿提取物低劑量組;D:松蘿提取物中劑量組;E:松蘿提取物高劑量組;F:HCQ組。

表4 各組大鼠滑膜組織HMGB1、RAGE、Bcl-2、PI3K C3與Beclin1蛋白表達(dá)比較

2.6 透射電子顯微鏡觀察自噬體情況

透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),空白組滑膜組織中細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)完整,有少量自噬體形成,維持正常細(xì)胞代謝需求;與空白組比較,模型組細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)完整,數(shù)量有所增加,自噬體數(shù)量相對(duì)較少;與模型組比較,松蘿提取物低劑量組細(xì)胞自噬體數(shù)量未見(jiàn)明顯異常變化,松蘿提取物中劑量組細(xì)胞自噬體數(shù)量增加,細(xì)胞出現(xiàn)一定固縮,凋亡程度加重,松蘿提取物高劑量組及HCQ組自噬體數(shù)量增加更明顯,見(jiàn)圖4。

3 討 論

RA屬于一類尚無(wú)確切病因的多因素自身免疫性疾病,侗族醫(yī)學(xué)屬“水熱病”范疇,主要是由于外感風(fēng)、寒、濕、熱等邪毒,導(dǎo)致“氣血熱、水火交爭(zhēng)”的變化,致使脈道不通、氣血水津代謝異常,機(jī)體蘊(yùn)生“邪熱”所致,不通則痛,不榮則痛,疼痛乃邪熱蘊(yùn)阻關(guān)節(jié)之外像[12]。在病因、病機(jī)及治療理論上,侗醫(yī)名家吳定元著《草木春秋》系統(tǒng)的描述了風(fēng)濕病的發(fā)病特征,對(duì)風(fēng)濕病提出“趕邪、消水”的診療方法,認(rèn)為有邪當(dāng)驅(qū)趕,腫脹宜消水。侗藥松蘿性味甘、平,有氣無(wú)味而屬陽(yáng),主表散、上升,使在表之邪氣得以發(fā)散,在內(nèi)的水濕得以宣發(fā)肅降、通調(diào)水道,讓水液自流;該藥生于樹(shù)顛而下垂,位陽(yáng)兼有陰的屬性,主里、下降,可通過(guò)利水分消在內(nèi)之邪。具有祛風(fēng)除濕通絡(luò)、消腫止痛、清熱解毒化邪氣之功[13],可治風(fēng)濕痹痛、跌打損傷。

自噬是一種參與細(xì)胞解決應(yīng)激、修復(fù)損傷和維持穩(wěn)態(tài)的重要代謝過(guò)程。但過(guò)度自噬或持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),會(huì)引起細(xì)胞代謝紊亂甚至細(xì)胞凋亡[14]。研究表明,自噬在滑膜炎的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用,自噬失調(diào)可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的加劇和RA發(fā)病[15]。HMGB1及其受體RAGE的表達(dá)和激活可以促進(jìn)自噬的發(fā)生和早期階段的進(jìn)展,同時(shí)HMGB1還可以通過(guò)啟動(dòng)NF-κB和絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)等多種信號(hào)通路,促進(jìn)IL-6等炎癥因子的釋放來(lái)促進(jìn)炎癥反應(yīng),進(jìn)而影響自噬的進(jìn)程[16]。在自噬初期,Beclin1與PI3K C3蛋白結(jié)合形成復(fù)合物[17],促進(jìn)磷脂酰肌醇3-磷酸產(chǎn)生,從而促進(jìn)自噬體形成和成熟。另外,Beclin-1與Bcl-2通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體自噬清除病態(tài)線粒體等[18],保證細(xì)胞代謝的平穩(wěn)和能量的供應(yīng)。Brazilin(具有抗炎特性)處理RA滑膜細(xì)胞后,LC3-Ⅱ和Beclin1等與自噬相關(guān)的蛋白表達(dá)升高[19]。此外,用自噬抑制劑如氯喹類處理CIA大鼠模型后,可以有效減輕炎癥反應(yīng)、減少趨化因子的分泌等[20]。自噬在類風(fēng)濕炎癥中有重要的作用,調(diào)控自噬可能成為治療類風(fēng)濕疾病的一個(gè)重要手段。

本研究結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯升高,大鼠滑膜組織中HMGB1、RAGE、Bcl-2、PI3K C3蛋白表達(dá)明顯升高,Bcl-2、PI3K C3 mRNA表達(dá)升高,Beclin1 mRNA和蛋白表達(dá)降低,表明模型制備成功。經(jīng)過(guò)不同劑量松蘿提取物或HCQ的干預(yù)后,大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)有所下降,IL-6炎性因子水平改善,滑膜組織Beclin1 mRNA和蛋白表達(dá)有不同程度升高,HMGB1、RAGE、Bcl-2、PI3K C3蛋白表達(dá)降低,Bcl-2、PI3K C3 mRNA表達(dá)降低。與HCQ組比較,松蘿提取物中、高劑量組的關(guān)節(jié)指數(shù)評(píng)分,血清IL-6、HMGB1水平,滑膜組織HMGB1、RAGE、Bcl-2、PI3K C3、Beclin1蛋白表達(dá)及Beclin1、Bcl-2、PI3K C3 mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)。透射電子顯微鏡顯示,松蘿提取物中、高劑量組及HCQ組自噬體數(shù)量增加,細(xì)胞凋亡程度加重,松蘿提取物可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬達(dá)到抑制滑膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用。藥物的劑量是影響治療效果的重要因素,本研究表明松蘿提取物低劑量組與模型組,松蘿提取物中、高劑量組與HCQ組上述指標(biāo)未顯示明顯差異,為確保治療效果最大化,對(duì)該藥物的劑量需進(jìn)行深入的研究,發(fā)現(xiàn)最佳劑量以便更好地評(píng)估藥物的療效和安全性。

綜上所述,松蘿提取物可能通過(guò)調(diào)控自噬水平降低炎癥反應(yīng)。