日本腦炎病毒NS1蛋白致腦血管內皮細胞損傷研究

潘俊慧,劉亞林,梁真潔,楊興淼,謝盛達,曹瑞兵

(南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院,江蘇 南京 210095)

日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是一種蚊媒傳播的單股正鏈RNA病毒,屬于黃病毒科黃病毒屬［1］。水禽和豬是JEV重要的中間宿主和擴增宿主。JEV感染可導致人和馬發(fā)生腦炎,種豬感染后可表現(xiàn)為母豬流產、公豬睪丸炎,對養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失［2-3］。JEV基因組的開放閱讀框(ORF)編碼一個多聚蛋白,經(jīng)病毒和宿主蛋白酶切割成3種結構蛋白(C、prM和E)和7種非結構蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)［4］。

JEV非結構蛋白1(NS1)由352個氨基酸組成,其相對分子質量為(40～50)×103,具體的大小取決于蛋白的糖基化狀態(tài)。JEV NS1蛋白可形成單體、二聚體和六聚體［4］,位于胞質中的單體和二聚體蛋白具有促進病毒組裝的功能,而六聚體蛋白是一種分泌蛋白,會被感染的細胞分泌至宿主體液循環(huán)系統(tǒng)［5］。已有研究報道,JEV NS1可與異質核糖核蛋白K(hnRNP K)、波形蛋白(vimentin)相互作用進而調節(jié)病毒的復制［6］。JEV NS1蛋白免疫小鼠后可提供90%的保護率［7-10］,為新型JEV疫苗的研制提供了科學思路。登革熱病毒(Dengue virus,DENV)的分泌性NS1蛋白(sNS1)能夠增強蚊子通過吸血方式對病毒的攝取,而針對NS1蛋白的特異性抗體能抑制DENV從動物傳播到蚊子［1］。目前,JEV sNS1蛋白的生物學功能尚未闡明。

糖萼(endothelial glycocalyx,EGL)覆蓋在血管腔內皮細胞表面,是血管屏障的重要成分。EGL主要通過蛋白聚糖(主要為糖胺聚糖)和糖蛋白(包含酸性寡糖和唾液酸寡糖,是寡糖鏈與多肽鏈共價相連所構成的復合糖)與內皮相連并形成一個網(wǎng)絡結構。糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAG)是糖萼最重要的“主鏈”分子。在血管內皮上主要存在5種糖胺聚糖鏈:硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)、硫酸軟骨素(chondroitin sulfate,CS)、硫酸皮膚素(dermatin sulfate,DS)、硫酸角質素(keratan sulfate,KS)和透明質酸(hyaluronic acid,HA)。EGL的結構對維持血管內皮的完整性至關重要。有報道稱,DENV sNS1通過激活內皮細胞溶酶體中的唾液酸酶來水解EGL中的唾液酸修飾,sNS1蛋白能夠激活組織蛋白酶L和乙酰肝素酶的級聯(lián)反應導致HS從EGL脫離,總之,sNS1蛋白通過這2條途徑實現(xiàn)對EGL的破壞,從而損傷血管內皮并造成血漿滲漏［11］。另外,其他黃病毒如寨卡病毒,也能利用這種機制破壞血管內皮［5］,但JEV NS1蛋白是否具有損傷內皮細胞的生物學功能尚不清楚。

JEV NS1是一種糖基化修飾的蛋白,含Asn-130(N130)和Asn-207(N207)2個保守的N-糖基化位點,西尼羅病毒(WNV)的NS1蛋白除上述2個糖基化位點外還有第3個Asn-175(N175)糖基化位點［12］。鑒于JEV感染機體會導致腦炎的發(fā)生［13］,為探究JEV sNS1蛋白的生物學功能,本研究擬通過昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)獲得JEV NS1蛋白及其N207糖基化位點突變蛋白,再以人腦微血管內皮細胞(HBMEC)為模型,通過檢測細胞表面的唾液酸修飾和胞內組織蛋白酶L的表達水平來評價NS1蛋白對內皮細胞的損傷情況,并利用小鼠試驗進一步探究sNS1蛋白對血腦屏障的影響,也為優(yōu)化JEV亞單位疫苗候選抗原奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞與毒株

sf9昆蟲細胞、High5細胞、人腦微血管內皮細胞系(HBMEC)、供體載體pFastBac1、感受態(tài)細胞DH5α、DH10Bac均由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

高糖DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、細胞培養(yǎng)基Grace insect medium和SF-900Ⅱ SFM及Cell FectinⅡ昆蟲細胞轉染試劑均購自Invitrogen公司;蛋白膠配制試劑盒購自雅酶生物有限公司;細胞培養(yǎng)板和細胞培養(yǎng)瓶購自無錫耐思生命科技股份有限公司。

1.3 JEV NS1和NS1 N207Q基因的擴增

以真核表達質粒pVAX-NS1為模板［14］,參考JEV的基因組序列(GenBank:GQ918133.2)并使用Primestar高保真擴增酶分別擴增包含有助于蛋白分泌的蜂肽基因序列［15］(下劃線)的JEVNS1和NS1N207Q的目的片段。引物序列通過Oligo 7軟件設計,由南京擎科生物科技有限合成。引物對序列如下:

NS1 F/R:5′-CGCGGATCCGCCACCATGGATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTGTACATTTCTTACATCTATGCGACCGATCAATT-3′/5′-TTGTCGAGACTGCAGGCTCTAGACTAATGGTGATGGTGATGATGAGCATCAACCTGCGATCTG-3′;N207Q F/R:5′-GGATTGAGAGTCGCTACCAAGACACATGGAAACT TG-3′/5′-CAAGTTTCCATGTGTCTTGGTAGCGACTCTCAATCC-3′。

1.4 重組質粒pFast-NS1和pFast-NS1 N207Q的構建

1.4.1 重組質粒pFast-NS1的構建經(jīng)鑒定成功的NS1目的片段和載體pFastbac1采用BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切,純化后使用T4連接酶進行連接,再轉化到感受態(tài)DH5α,從培養(yǎng)平板中挑取單一菌落進行鑒定。

1.4.2 重組質粒pFast-NS1N207Q的構建以pVAX-NS1為模板,通過PCR擴增獲得NS1N207Q-1/NS1N207Q-2,與載體pFastbac1通過同源重組的方法進行連接(圖1)。使用同源重組酶將線性化的載體片段和純化的NS1N207Q片段進行反應。反應體系如下:pFastBac1酶切純化片段110 ng,NS1N207Q-1純化片段12 ng,NS1N207Q-2純化片段11 ng,5×CE MultiS Buffer 4 μL,Exnase MultiS 2 μL,ddH2O補至 20 μL。使用PCR儀,37 ℃反應30 min。

圖1 同源重組克隆技術步驟Fig.1 Procedure of homologous recombination cloning technology

1.5 重組桿粒rBacmid-NS1和rBacmid-NS1 N207Q的構建

取鑒定正確的pFastBac1-NS1和pFastBac1-NS1N207Q重組質粒1 μL,加入新鮮制備的感受態(tài)DH10Bac/E.coli中,冰浴30 min;置于42 ℃水浴鍋中熱激90 s,迅速冰浴2 min;向其加入800 μL的液體LB培養(yǎng)基,置于37 ℃搖床,220 r·min-1培養(yǎng)4 h;在新的1.5 mL EP管中,用無抗性的液體LB培養(yǎng)基與培養(yǎng)好的菌液按照10倍比進行稀釋,然后將菌液均勻涂在含卡那霉素、四環(huán)素和慶大霉素的3種抗生素的平板中,置于37 ℃培養(yǎng)48 h;在藍白斑板上取單個白色菌落,重新劃線得到純化的白色菌落,經(jīng)PCR鑒定成功后獲得重組桿粒。

1.6 重組桿狀病毒的制備

將sf9細胞用移液管吹下來進行計數(shù),然后均勻鋪到24孔板;待24孔板的sf9細胞生長密度為80%～90%時,開始轉染。具體操作:取1 μg重組桿粒加到100 μL雙無抗的Grace Medium;取Cell FectinⅡ 6 μL加入100 μL雙無抗的Grace Medium中,混勻;將稀釋好的桿粒與轉染試劑混勻,室溫孵育40 min。同時,用無菌PBS溶液清洗3次24孔細胞板里的細胞后棄洗液;將Grace Medium加入桿粒和轉染試劑的混合液中,吹吸混勻,最后將混合物加入細胞孔中,27 ℃繼續(xù)培養(yǎng)5 h后換液,24孔細胞板加入500 μL sf-900Ⅱ SFM,將細胞板置于27 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),直到病變產生,收取病毒液。

1.7 桿狀病毒的傳代及擴增

將轉染后收集的病毒液作為P1代病毒液,在4 ℃條件下4 000g離心15 min,然后將上清液進行過濾。收取P1代毒液,一部分儲存在4 ℃冰箱備用,一部分儲存在-80 ℃冰箱中長期保存,剩下的病毒液繼續(xù)傳代。將P1代病毒按照1∶10體積比感染sf9細胞,27 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h,根據(jù)細胞病變情況收集病毒液,然后將其在4 ℃條件下4 000g離心15 min,收取P2代病毒液,置于4 ℃避光保存;將P2代病毒液按照上述相同的操作大量擴增獲得P3代病毒液,按照20%的比例感染High5細胞并懸浮培養(yǎng),72 h收集上清液,使用親和層析的純化方式獲得目的蛋白。

1.8 NS1蛋白致人腦血管內皮細胞(HBMEC)損傷的細胞表面分子唾液酸修飾的檢測

向細胞生長密度為80%的細胞培養(yǎng)皿中加入終濃度為5 μg·mL-1的NS1和NS1 N207Q蛋白,孵育 6 h 后通過檢測WGA的熒光強度衡量HBMEC細胞表面的唾液酸修飾含量。WGA是一種小麥胚芽凝集素,能夠選擇結合N-乙酰唾液酸殘基,其在溶液中以異二聚體的形式存在,相對分子質量約為38×103。避光操作下用PBS將WGA試劑稀釋至5.0 μg·mL-1;取200 μL加入細胞培養(yǎng)皿中,置于5% CO2細胞培養(yǎng)箱中,37 ℃ 避光孵育30 min;經(jīng)PBS清洗后用4%的多聚甲醛固定,經(jīng)DAPI染核后在熒光顯微鏡下觀察熒光強度。

1.9 NS1蛋白致HBMEC損傷的組織蛋白酶L含量變化檢測

向細胞生長密度為80%的細胞培養(yǎng)皿中加入終濃度為5 μg·mL-1的NS1和NS1 N207Q蛋白,孵育6 h后將培養(yǎng)皿中的細胞固定,再經(jīng)0.1% Triton-100破膜處理后以組織蛋白酶L特異性單抗為一抗進行孵育,共聚焦顯微鏡下檢測細胞內的組織蛋白酶L含量的變化。

1.10 NS1蛋白致小鼠血腦屏障(BBB)損傷檢測

為觀察JEV NS1蛋白對HBMEC損傷致小鼠BBB的影響,參照文獻［5］將4周齡Balb/c雌鼠分為3組,分別尾靜脈注射NS1、NS1 N207Q和PBS。每只注射劑量為10 mg·kg-1。注射后每天記錄小鼠的臨床癥狀和精神狀態(tài)。分別在注射24、48和72 h后,經(jīng)尾靜脈注射200 μL的1%伊文思藍染料,1 h后用麻醉劑進行麻醉,并用30 mL生理鹽水進行心臟灌注,剖取小鼠腦部,觀察小鼠腦部的伊文思藍染色情況。

2 結果與分析

2.1 表達JEV NS1蛋白的重組桿狀病毒的鑒定

外源蛋白在昆蟲細胞中分泌效率通常較低,在NS1的N端加入蜂肽序列可提高分泌效率,并在蛋白分泌之后切割蜂肽,這樣不影響NS1蛋白的生物功能［15］。設計JEVNS1基因片段的上游擴增引物并引入蜂肽序列,經(jīng)PCR擴增獲得JEVNS1基因,經(jīng)10 g·L-1核酸膠電泳檢測,獲得的1 099 bp目的條帶與預期NS1大小一致(圖2-A)。用限制性內切酶BamHⅠ和XbaⅠ進行載體線性化,將NS1片段克隆到桿狀病毒表達體系的供體質粒pFastBac1。挑選陽性菌落,提取質粒進行BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定,條帶大小與預期結果相符(圖2-B),測序后確定已成功獲得pFastBac1-NS1重組質粒。

圖2 表達JEV NS1蛋白的重組桿狀病毒的鑒定Fig.2 Identification of recombinant baculovirus expressing JEV NS1 protein A.NS1目的片段的鑒定及擴增;B.重組質粒 pFast-NS1的酶切鑒定;C.重組桿粒rBacmid-NS1菌液的PCR鑒定;D. sf9細胞表達NS1蛋白的間接免疫熒光鑒定;E.Western blot和SDS-PAGE檢測NS1蛋白(Mock:空白對照)。A. Detection and amplification of NS1;B.Identification of pFast-NS1 by double restriction enzyme digestions;C. Identification of rBacmid-NS1 by PCR;D. Indirect immunofluorescence identification the expression of NS1 in sf9 cells;E. The analysis of recombinant of NS1 in Western blot and SDS-PAGE(Mock:Black control).

將鑒定成功的重組穿梭質粒轉座到感受態(tài)DH10Bac/E.coli,通過四環(huán)素、卡那霉素和慶大霉素的3種抗性和藍白斑篩選得到白斑的rBacmid。使用M13上、下游引物進行菌液PCR鑒定,得到大小約3 350 bp的核酸條帶,與編碼NS1蛋白的基因片段的大小相符。由于目的片段較長,退火溫度的設置和引物匹配靈敏度使用普通擴增酶進行擴增時出現(xiàn)非特異性結合,導致在約1 700 bp處出現(xiàn)非特異性條帶(圖2-C),以上結果表明rBacmid-NS1成功構建。

將rBacmid-NS1轉染sf9細胞,72 h后收獲桿狀病毒P1代。將P1的桿狀病毒進一步擴增獲得P2代。P2代桿狀病毒按照10%的體積比接種于sf9細胞,72 h后對重組病毒進行免疫熒光檢測(IFA)和Western blot鑒定。固定sf9細胞,用NS1蛋白單克隆抗體作為IFA鑒定的一抗,在倒置熒光顯微鏡下觀察,重組桿狀病毒接種的細胞能夠產生特異性的紅色熒光,而對照孔的sf9細胞孔則無明顯熒光(圖2-D),表明拯救的桿狀病毒能夠有效表達NS1蛋白;Western blot能夠檢測到相對分子質量45×103左右的NS1條帶(圖2-E)。綜上,成功制備了能表達NS1蛋白的重組桿狀病毒。

2.2 NS1及其突變體NS1 N207Q蛋白的表達及純化

將P3代NS1重組桿狀病毒分別按照5%和10%的體積比接種High5細胞,通過對上清液樣品進行鑒定,發(fā)現(xiàn)接毒量為10%且收樣時間為72 h的上清培養(yǎng)基中表達的NS1蛋白含量最多,因此后續(xù)的NS1蛋白表達選擇接毒量為10%的比例,收樣時間為72 h(圖3-A)。

圖3 NS1和NS1 N207Q蛋白的表達與純化Fig.3 Expression and purification of NS1 and NS1 N207Q proteins A. NS1重組桿狀病毒感染High5最優(yōu)表達鑒定;B. Western blot鑒定區(qū)分NS1和NS1 N207Q;C. 間接免疫熒光鑒定sf9細胞表達NS1 N207Q蛋白;D. SDS-PAGE鑒定純化的NS1蛋白;E. SDS-PAGE鑒定純化的NS1 N207Q蛋白;F. Western blot鑒定純化的NS1蛋白;G. Western blot鑒定純化的NS1 N207Q蛋白。1～9/1′～8′:150 mmol·L-1咪唑洗脫液,10～13/10′～11′:300 mmol·L-1咪唑洗脫液。A. Identification of optimal expression of High 5 infected by recombinant baculovirus NS1;B. The molecular weight difference between NS1 and NS1 N207Q was determined by Western blot;C. Indirect immunofluorescence identification the expression of NS1 N207Q in sf9 cells D.The purified NS1 protein was identified by SDS-PAGE;E. The purified NS1 N207Q protein was identified by SDS-PAGE;F. The purified NS1 protein was identified by Western blot;G. The purified NS1 protein was identified by Western blot. 1-9/1′-8′:150 mmol·L-1 imidazole eluent,10-13/10′-11′:300 mmol·L-1 imidazole eluent.

本研究使用1 L的細胞搖瓶懸浮培養(yǎng)High5細胞200 mL,收集細胞培養(yǎng)上清液,經(jīng)蛋白親和柱純化并通過SDS-PAGE和Western blot鑒定,發(fā)現(xiàn)JEV NS1蛋白在150 mmol·L-1咪唑洗脫下獲得條帶單一的NS1蛋白,而300 mmol·L-1咪唑洗脫下NS1蛋白的條帶較粗,存在雜蛋白,說明NS1蛋白得到有效純化(圖3-B、C)。

為了后續(xù)探究JEV NS1蛋白特異性的生物學功能,在有效制備出JEV NS1蛋白的條件下,又通過點突變的方式突變其N207糖基化位點,經(jīng)鑒定后成功拯救出NS1突變蛋白NS1 N207Q的重組桿狀病毒,且突變蛋白的分子質量要略小于NS1蛋白的分子質量(圖3-D、E)。NS1 N207Q重組桿狀病毒感染High5細胞,收集上清液并純化,再經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定,可知NS1 N207Q蛋白得到有效純化(圖3-F、G)。

2.3 NS1蛋白致HBMEC細胞表面唾液酸和組織蛋白酶L含量變化的檢測

為了探究JEV NS1蛋白的生物學功能,選用昆蟲細胞-桿狀病毒系統(tǒng)獲得真核NS1蛋白及其突變蛋白。前期的探究中發(fā)現(xiàn)向HBMEC中添加NS1蛋白導致細胞間隙變大且細胞狀態(tài)較差的現(xiàn)象,由于內皮細胞表面的保護屏障主要為糖萼(EGL),唾液酸是EGL的重要成分［5］,因此,通過共聚焦的方式檢測NS1蛋白對細胞表面唾液酸修飾的影響。將HBMEC接種培養(yǎng)皿,待細胞密度達到100%時,添加5 μg·mL-1NS1作用6 h,使用WGA熒光染料染色后固定細胞,在熒光顯微鏡下觀察細胞表面分子唾液酸的修飾,我們發(fā)現(xiàn)NS1蛋白作用HBMEC細胞6 h后,與空白對照組相比,添加NS1蛋白組細胞表面的唾液酸含量明顯減少(圖4-A)。

圖4 人腦微血管內皮細胞(HBMEC)表面唾液酸含量(A)和細胞內組織蛋白酶L含量(B)檢測Fig.4 Detection of the content of sialic acid on the HBMEC surface(A)and the content of cathepsin L(B)in HEMECWGA:唾液酸指示劑 Sialic acid indicator;DAPI:細胞核染色 Nuclear staining.

由于EGL的另外一個重要成分為硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,而組織蛋白酶L是降解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的重要前體蛋白酶［16］。為了進一步探究NS1蛋白對EGL的影響,我們又檢測了NS1蛋白處理后的HBMEC中組織蛋白酶L含量。在共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),與空白對照組相比,添加NS1蛋白組細胞中組織蛋白酶L含量增多(圖4-B)。

根據(jù)以上試驗結果可得,JEV NS1蛋白具有下調腦內皮細胞表面唾液酸修飾的功能,并且NS1蛋白可誘導細胞內組織蛋白酶L的表達并通過激活硫酸乙酰肝素酶降解硫酸乙酰肝素最終造成EGL的損傷。為了探究該功能是否為NS1蛋白的特異性生物學功能,我們又將NS1突變蛋白NS1 N207Q以相同的方式作用HBMEC,6 h后檢測內皮細胞表面的唾液酸修飾和細胞內組織蛋白酶L含量。檢測結果表明,與對照組相比,添加NS1 N207Q蛋白組細胞的唾液酸修飾含量和組織蛋白酶L含量均無明顯變化。因此,JEV NS1蛋白可降解HBMEC細胞表面的EGL并對內皮屏障造成損傷。

2.4 JEV NS1及NS1 N207Q蛋白對小鼠血腦屏障功能的影響

既然JEV NS1蛋白對于內皮細胞有明顯損傷作用,且內皮細胞又是血腦屏障的重要組成成分,于是我們思考內皮細胞損傷是否對血腦屏障功能產生影響。參照已有文獻DENV NS1蛋白尾靜脈接種劑量為10 mg·kg-1［5］進行相關試驗操作。對試驗小鼠進行臨床癥狀觀察:NS1蛋白接種組和NS1 N207蛋白接種組小鼠,在24、48和72 h的觀察期內,小鼠無明顯異常,精神狀態(tài)良好,食欲飲水正常,接種部位未出現(xiàn)發(fā)熱、紅腫等異?，F(xiàn)象;PBS接種組在72 h的試驗觀察期內正常。各組小鼠均未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀。

如圖5所示:小鼠心臟灌注生理鹽水后取出小鼠腦部,注射后24～72 h,NS1蛋白組均能觀察到藍色染料,而NS1 N207Q蛋白組和PBS組均未觀察到明顯的藍色染料。此結果表明,NS1蛋白在注射后24和48 h即對小鼠的血腦屏障造成損傷,而72 h后對小鼠的血腦屏障的損傷減弱,而注射NS1 N207Q蛋白組小鼠血腦屏障無明顯損傷,PBS組正常。

圖5 NS1蛋白致小鼠血腦屏障損傷的染色觀察Fig.5 Observation of brain staining on blood-brain barrier injury caused by NS1 protein in mice

3 討論

本試驗在探究JEV NS1蛋白生物學功能時發(fā)現(xiàn),向HBMEC中添加NS1蛋白,細胞間隙變大且細胞狀態(tài)較差。體外試驗結果顯示,JEV NS1蛋白能夠下調HBMEC表面分子的唾液酸修飾,并且能夠上調細胞內組織蛋白酶L的表達,表明NS1蛋白具有損傷腦內皮細胞糖萼的生物學功能。伊文思藍屬于一種常用的偶氮染料制劑,在血液中與血漿白蛋白有很高的親和力,因此在科學研究中常被用于示蹤劑觀察血腦屏障(BBB)的完整性［17］。動物試驗表明,注射NS1蛋白后小鼠的腦部觀察到藍色的伊文思藍染料。由此判斷JEV NS1蛋白具有損傷小鼠血腦屏障的功能。但在作用時間為72 h時,NS1蛋白損傷血腦屏障的作用減弱。其原因可能是DENV NS1蛋白作用內皮細胞是一個動態(tài)變化的過程［12］,NS1蛋白作用的前期效果較為明顯,后期其作用相對較弱;注射到小鼠體內的NS1蛋白隨著時間的增加,也會在小鼠體內逐漸被降解。有研究指出,蛋白的糖基化對于其生物學功能有重要影響［5］。為了探究JEV NS1蛋白損傷內皮功能的特異性,我們將NS1蛋白的N207糖基化位點進行突變并獲得突變蛋白NS1 N207Q。試驗結果顯示,JEV NS1 N207Q處理后HBMEC表面的唾液酸修飾和組織蛋白酶L含量均無明顯變化,說明NS1 N207Q蛋白處理對小鼠的血腦屏障無明顯損傷。由此可得,JEV NS1蛋白N207位點對其損傷腦內皮的生物學功能具有重要作用。

JEV NS1是一個多功能的非結構蛋白,對病毒的增殖有重要作用,其主要參與病毒復制復合體的形成,具有促進病毒復制的功能［18-19］。此外,NS1蛋白還參與機體的免疫相關因子的互作［20］。JEV感染細胞后產生的NS1蛋白以含有脂質物的桶狀六聚體形式分泌,并進入到血液循環(huán)中,因此其可以用作診斷抗原和病毒感染嚴重程度的生物標志物［21］。有研究提出NS1基因作為核酸疫苗免疫小鼠,可以保護90%小鼠抵抗致死劑量的JEV感染［22］。然而,目前針對JEV分泌的NS1蛋白的生物學功能研究較少。有研究報道,DENV NS1蛋白直接與血管內皮細胞相互作用,導致血管內皮糖萼受到破壞,而內皮糖萼層(EGL)維持內皮屏障完整性至關重要［23］。因此,本試驗制備了分泌性JEV NS1蛋白并通過體外和體內實驗結果證明JEV NS1蛋白可損傷HBMEC并影響小鼠的血腦屏障,而其突變蛋白NS1 N207Q損傷HBMEC的功能喪失。

研究報道,登革熱病毒(DENV)和寨卡病毒(ZIKV)的NS1蛋白可以促進蚊子感染病毒,而NS1蛋白抗體可通過Fc依賴性的方式結合體液中及細胞膜上的NS1蛋白清除被病毒感染的細胞［24-25］。因此,病毒的NS1蛋白被認為是新型疫苗的潛在候選抗原。研究表明,用關鍵片段缺失的NS1蛋白免疫小鼠既可以降低損傷宿主血管的副作用,也能保護小鼠對抗DENV的致死性感染;同時也能減少病毒對蚊子的感染,從而減弱DENV的自然傳播鏈,這可能為控制黃病毒在自然界中的傳播提供新途徑［1］。因此,JEV NS1蛋白可作為一種既可以提供免疫保護又可以阻斷病毒的跨宿主傳播的雙效抗原。

雖然JEV NS1具有一定免疫原性［9,26-27］,但是NS1蛋白本身會誘發(fā)內皮細胞損傷,無法直接作為候選亞單位疫苗的儲備蛋白,而NS1 N207Q蛋白則無明顯損傷作用,可以作為候選免疫原進行進一步的探究。

本試驗根據(jù)氨基酸序列的分析,將207糖基化位點進行突變,制備出對內皮細胞無明顯損傷作用的NS1 N207Q蛋白。由于分泌到上清液中的重組NS1 N207Q蛋白的純化效率較低,后續(xù)研究需要進一步對蛋白序列進行優(yōu)化或選擇添加雙標簽以及使用親和層析與分子篩組等純化模式以提高純化蛋白的效率［13-14］,也可通過缺失具有損傷功能的目的片段而獲得安全有效的缺失NS1蛋白,可結合E蛋白制備既產生中和抗體又產生NS1抗體的二聯(lián)苗。

綜上所述,本研究通過人腦內皮細胞損傷試驗和小鼠血腦屏障通透性試驗,結果表明JEV NS1蛋白能夠引起腦內皮的損傷,而NS1 N207Q突變蛋白對內皮的損傷作用顯著減弱。本研究為JEV新型亞單位疫苗的研制提供新思路和物質基礎。