冷凍干燥對蛋黃粉水溶性、結(jié)構(gòu)特性和活性抗體含量的影響

王喆,任廣躍,2*,段續(xù),2,郭凈芳,金鑫,苗峻偉,余祖艷,趙夢月,昂媛,王兆凱

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,河南 洛陽,471000)2(糧食儲藏安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南 鄭州,450001)

蛋黃含有豐富的磷脂、必需脂肪酸、維生素和礦物質(zhì),此外還含有生物活性蛋白質(zhì):卵黃抗體(immunoglobulin of yolk, IgY)[1]。然而新鮮雞蛋在常溫下易變質(zhì),在加工和運輸時造成了巨大的損失和浪費[2]。因此,干燥作為一種解決手段常被用來生產(chǎn)蛋黃粉(egg yolk powder, EYP)。EYP與新鮮蛋黃具有相同的營養(yǎng)成分,且保留了新鮮蛋黃的功能特性[3]。冷凍干燥(freeze-drying, FD)是一種生物制品常用的干燥方式,且是可以保留產(chǎn)品良好品質(zhì)的最佳干燥方式之一[4]。由于EYP含有大量的疏水甘油,水溶性較低,在工業(yè)化生產(chǎn)中可能受到限制。且研究表明,冷凍會使蛋黃液出現(xiàn)膠化的現(xiàn)象,這會導(dǎo)致蛋黃的溶解性大打折扣。其次,蛋黃液在經(jīng)過干燥處理后,脂類物質(zhì)會從低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)中分離并轉(zhuǎn)移至干蛋黃表面,嚴重降低其乳化性質(zhì)[5]。此外,目前采用的蛋黃改性方法有酶改性法[6-7]、調(diào)節(jié)pH法以及糖基化等,這些方法特別是酶改性法不僅成本過高,而且會對卵黃抗體的含量有一定影響。

目前,已有的EYP研究主要集中在對其乳化性和溶解性的提高[7-10],并未考慮干燥對卵黃抗體的影響。因此本研究采用冷凍干燥制備EYP,并添加雙糖(海藻糖、蔗糖)來改善凍干EYP的溶解性,并同時對卵黃抗體起到保護作用。以期探究冷凍干燥對EYP結(jié)構(gòu)的損害以及雙糖改善其溶解度的機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮紅皮雞蛋(每個大約60 g),洛陽本地超市;海藻糖、D-甘露醇,上海藍季生物科技有限公司;Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl,天津德恩化學(xué)試劑有限公司,配制pH 7.4、0.01 mol/L PBS緩沖液;雞卵黃抗體(IgY)ELISA試劑盒,上海臻科生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1A-50冷凍干燥機,北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;101型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,北京科偉永興儀器有限公司;Xrite color i5色差儀,美國愛色麗公司;TM3030Plus掃描電鏡,日本日立公司;DSC1差示掃描量熱儀,瑞士Mettler-Toledo公司;Vector 33型傅里葉變換中遠紅外儀,德國布魯克公司;Multiskan FC酶標(biāo)儀,上海賽默飛世爾儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛋黃液預(yù)處理

取若干雞蛋,破碎后將蛋黃置于濾紙去除多余蛋清和卵黃膜,收集蛋黃原液于燒杯中并65 ℃巴氏殺菌20 min。取適量蛋黃原液加入2倍體積的蒸餾水,攪拌均勻后按質(zhì)量等分為3份于同規(guī)格平板中,蛋黃液厚度不超過1 cm。配方如表1所示。將樣品置于磁力攪拌器中速攪拌30 min,隨后在-25 ℃冷凍8 h。

表1 配方組成(比例按蛋黃原液質(zhì)量計算)Table 1 Composition of formulation (proportion calculated by raw liquid mass of egg yolk)

1.3.2 EYP的制備

1.3.2.1 FD過程

將預(yù)凍好的樣品放置在真空冷凍干燥機隔板上后,將腔室壓力降低到20 Pa,將冷阱溫度降低到-50 ℃,降溫速率為2.5 ℃/min。樣品的初始溫度為-25 ℃,最終溫度的上限為20 ℃。冷阱溫度和腔室壓力分別保持在-50 ℃和20 Pa,干燥時間約為20 h。

1.3.2.2 EYP的處理

冷凍干燥過程結(jié)束后,樣品呈現(xiàn)為干燥的餅狀,使用粉碎機在2 000 r/min粉碎機中粉碎2 min,將得到的EYP用自封袋密封保存待測。

1.4 殘余水分含量

分別稱取1 g干燥樣品,置于烘箱中105 ℃絕干,并計算殘余水分含量。每個樣品平行測定3次,取平均值。

1.5 溶解度的測定

按照GU等[3]的方法并稍作修改,分別稱取0.5 g干燥樣品溶于5 mL蒸餾水中,并使用渦旋儀渦旋2 min,隨后3 000 r/min離心5 min,取上清液于105 ℃絕干,稱取干物質(zhì)質(zhì)量,溶解度的計算如公式(1)所示:

(1)

式中:m1,上清液干物質(zhì)質(zhì)量,g;m2,樣品質(zhì)量,g。

1.6 粉體特性

1.6.1 流動性的測定

將漏斗固定在鐵架臺上并保持垂直,漏斗下方鋪上潔凈白紙,使漏斗出口的最底端距白紙3 cm。分別稱取1 g樣品,將樣品沿漏斗內(nèi)壁緩慢倒入,使其在漏斗下方形成錐體,記錄錐體的高為h(cm),半徑為r(cm),其休止角(γ)的計算如公式(2)所示:

(2)

1.6.2 堆積密度的測定

按照MOUNIR等[2]的方法并加以修改。稱取1 g樣品,置于5 mL干燥量筒中,輕輕振蕩使其平坦后,記錄體積,其堆積密度的計算如公式(3)所示:

(3)

式中:ρ,堆積密度,g/cm3;m,樣品質(zhì)量,g;V,樣品容積,cm3。

1.7 表面疏水性的測定

由于EYP的溶解性較低,故采用溴酚藍(bromophenol blue, BPB)結(jié)合法來測定EYP表面疏水性,參考SHEN等[11]的方法并加以改動。將樣品溶解于蒸餾水配制5 mg/mL蛋黃溶液,并渦旋1 min。取1 mL蛋黃溶液加入200 μL溴酚藍溶液(1 mg/mL)渦旋混合,室溫下反應(yīng)10 min,并使用1 mL去離子水代替樣品溶液與200 μL溴酚藍溶液混合作為空白對照。樣品經(jīng)10 000 r/min離心15 min,上清液稀釋10倍,測定595 nm處吸光值。表面疏水性用溴酚藍結(jié)合量(BPB bound, μg)表示,BPB bound的計算如公式(4)所示:

(4)

式中:Abs空白,空白對照在595 nm處的吸光度值;Abs樣品,樣品在595 nm處的吸光度值。

1.8 色澤

使用Xrite color i5型色差儀(美國愛色麗公司)分析了EYP的顏色。分析前,用白色CR-400校準(zhǔn)板對儀器進行校準(zhǔn),將樣品放在透明塑料袋中以測量顏色。所有分析均測3次平行。

1.9 掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)

樣品經(jīng)過噴金處理后,在15 kV的加速電壓下,使用SEM對凍干EYP的顯微結(jié)構(gòu)進行了表征。

1.10 差示掃描量熱儀(differential scanning calorimeter, DSC)分析

使用DSC分析了EYP的熱行為。樣品在N2凈化的干盒中進行稱重和制備。每次測量都使用2個封閉的鋁坩鍋:一個空坩鍋作為參考,另一個坩鍋裝有5 mg的EYP。以高純N2為載氣(100 mL/min),樣品在25 ℃平衡3 min后,以20 ℃/min的速率將樣品從25 ℃降至-70 ℃,然后再以20 ℃/min的速率升溫至100 ℃。采用軟件分析標(biāo)記了初始的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度和偏移的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度以及蛋黃液的共晶溫度(eutectic temperature,Teu)。通過計算拐點,確定了中間玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(glass transition temperature,Tg),為進一步的評價提供了依據(jù)。

1.11 傅里葉中遠紅外光譜法(Fourier transform infrared spectrometer, FT-IR)測定二級結(jié)構(gòu)

參考KUDRE等[12]的方法,使用傅里葉變換中遠紅外儀對凍干樣品進行FT-IR分析。將約300 μg樣品與約300 mg干燥KBr混合,并使用真空壓片機進行壓片,用干N2連續(xù)清洗儀器和樣品室。以KBr光譜為背景,每個樣本掃描64次,平均分辨率為4 cm-1,對4 000～400 cm-1的光譜進行分析。然后對得到的FT-IR譜進行二階導(dǎo)數(shù)處理、基線校正和平滑處理。

1.12 ELISA法測定卵黃抗體含量

使用上海臻科生物科技有限公司的“雞卵黃抗體(IgY)ELISA試劑盒”測定樣品中的活性卵黃抗體含量。取0.5 g EYP溶于4.5 mL、0.01 mol/L PBS中并渦旋1 min,然后26 ℃下8 000 r/min離心15 min,取上清液測定。根據(jù)說明書進行了酶聯(lián)免疫吸附試驗,抗原-抗體反應(yīng)完成后使用Multiskan FC型酶標(biāo)儀測定吸光度,并按照試劑盒所帶標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量。

1.13 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 19.0軟件進行顯著性分析(P<0.05),使用Origin 8.5軟件進行數(shù)據(jù)處理。上述試驗均重復(fù)3次,最終結(jié)果以平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 殘余水分含量與溶解度

冷凍干燥樣品未粉碎前為干燥的凍干餅,呈海綿狀。在3組樣品中,添加了雙糖的樣品感官上要比未添加雙糖的樣品更加細膩,所有樣品的殘余水分含量均≤5%(表2)。各個樣品的溶解度如表2所示。

表2 凍干EYP的殘余水分含量和溶解度Table 2 Residual moisture content and solubility of lyophilized egg yolk powder

結(jié)果表明,未添加配方的EYP溶解度僅為15%,而經(jīng)過添加了雙糖的EYP溶解度則大大提高了,這說明雙糖的添加不僅在EYP中引入了親水基團,且結(jié)合表面疏水性、微觀結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化來看,雙糖維持了EYP中脂蛋白的天然結(jié)構(gòu),進而改善了凍干EYP的溶解性。且添加蔗糖的樣品明顯高于添加海藻糖的樣品,這可能是由于蔗糖更親水。此外,冷凍干燥破壞了蛋白質(zhì)的自然結(jié)構(gòu),誘導(dǎo)了蛋白質(zhì)的聚集,這個過程可能是不可逆的[13]。因此,在EYP復(fù)水后,蛋白質(zhì)聚集導(dǎo)致了不溶性蛋黃粉大顆粒的產(chǎn)生,降低了EYP的溶解度。

2.2 冷凍干燥EYP的粉體特性

凍干EYP的流動性和堆積密度由圖1所示,添加了雙糖的樣品普遍比對照樣品有更低的休止角和更高的堆積密度。由圖1-a可以看出,添加了雙糖的樣品較未添加雙糖的樣品休止角均有所降低。根據(jù)MOUNIR等[2]的研究,冷凍干燥可能會破壞EYP中脂蛋白的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致蛋黃顆粒中的脂肪融出,并轉(zhuǎn)移到蛋黃顆粒表面,使蛋黃顆粒的黏附性增加,導(dǎo)致流動性變差。而雙糖在冷凍干燥過程中起到了凍干保護劑的作用,一定程度上維持了其天然結(jié)構(gòu)。

a-休止角;b-堆積密度圖1 凍干EYP的休止角和堆積密度Fig.1 Rest angle and accumulation density of lyophilized yolk powder

EYP的堆積密度由圖1-b所示。結(jié)果表明,不管是添加蔗糖樣品還是添加海藻糖樣品,EYP的堆積密度均較對照樣品增加了。這表明未添加雙糖的EYP粉體顆粒較大且黏附性較大,導(dǎo)致顆粒間空隙較大,因此堆積密度較小。而添加了配方處理的EYP顆粒較小且黏附性較小,粉體更加細膩,堆積密度更高。

2.3 表面疏水性

表面疏水性(BPB bound)可以用來反映蛋白質(zhì)分子表面疏水基團的數(shù)量,與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、構(gòu)象和功能密切相關(guān)[14-15]。從表3可以看出,與空白對照相比,樣品在添加輔料后表面疏水性均有所降低?？赡艿脑蚴抢鋬龈稍镎T導(dǎo)蛋白質(zhì)變性,從而破壞了蛋白質(zhì)的自然狀態(tài),暴露了其表面的氫鍵和極性基團,導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集。此外,EYP的溶解度也與其表面疏水性密切相關(guān)。研究表明,表面疏水性與溶解度呈負相關(guān),這是由于暴露的疏水基團在廣泛的分子間相互作用中溶解度降低,與本研究的結(jié)果一致[16-17]。

表3 凍干EYP的表面疏水性Table 3 Surface hydrophobicity of lyophilized egg yolk powder

2.4 色澤分析

顏色是反映食物特征的一個重要因素,如新鮮度,可以影響消費者的選擇[18]。表4顯示了EYP的顏色屬性:L*、a*和b*。結(jié)果表明,不同添加制備的EYP的色度值不同,添加雙糖的EYP的亮度值均高于對照樣品。此外,b*代表黃藍值,因此隨著粉末的黃色的增加而增加。與FD對照樣品相比,添加海藻糖和蔗糖的樣品均呈現(xiàn)出更明顯的黃色且亮度更高,擁有更好的色澤。

表4 凍干EYP的色澤Table 4 Color of lyophilized EYP

2.5 微觀結(jié)構(gòu)分析

圖2為FD得到的EYP的微觀結(jié)構(gòu)。所有樣品均呈不規(guī)則的片狀,FD對照樣品表面有許多突出的顆粒,這是由于低密度脂蛋白中脂質(zhì)物質(zhì)分離并轉(zhuǎn)移到干蛋黃表面。此外,對照樣品顯示出更多的蛋黃顆粒聚集,可能是由于在凍干過程中,水合殼被部分破壞,從而破壞了蛋白質(zhì)的自然狀態(tài),表面的氫鍵和極性基團會暴露出來,導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。在干燥過程中,當(dāng)水合殼被破壞,蛋白質(zhì)暴露在缺水的環(huán)境中,質(zhì)子傾向于向電離的羧基轉(zhuǎn)移,從而盡可能地消除蛋白質(zhì)中的電荷。電荷的減少可能會促進蛋白質(zhì)分子間的疏水相互作用,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集[19]。這增加了脂蛋白分子之間的疏水相互作用,并導(dǎo)致蛋黃顆粒相互作用并形成聚集體。添加蔗糖和海藻糖的EYP呈現(xiàn)出更分散的狀態(tài),且粒徑更小,分布更均勻,因此蛋黃顆粒溶解時與水的接觸面更大,更易溶解。此外,添加雙糖的EYP表面較對照樣品更光滑,突起較少,這說明雙糖有效抑制了脂質(zhì)的融出。

a-1(對照)(×200);b-2(×200);c-3(×200);d-1(對照)(×1 000);e-2(×1 000);f-3(×1 000)圖2 EYP的微觀結(jié)構(gòu)Fig.2 Microstructure of the EYP

2.6 DSC分析

EYP的Tg和Teu與配方組成顯著相關(guān)(表5)。3組樣品的Teu均高于冷凍干燥機的冷阱溫度,適用于冷凍干燥。對于Tg,較高的Tg值表明分子運動較慢。FD對照樣品的Tg和Teu值分別為34.14 ℃和-8.01 ℃,添加雙糖的樣品Tg均增加,添加海藻糖樣品的Tg高于添加蔗糖的樣品,這是由于海藻糖的Tg更高。蛋白質(zhì)聚集需要大量的擴散運動,但隨著Tg的增加而減慢[20]。這表明了添加雙糖可以抑制EYP中蛋白質(zhì)的聚集。此外,具有較高的Tg值,表明其具有較高的溫度耐受性,并能在較高的溫度下保持其穩(wěn)定性[21]。因此,含雙糖的EYP可以在較高的溫度下保存并保持其穩(wěn)定性。

表5 蛋黃液的共晶溫度和EYP的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Table 5 The cocrystal temperature of the egg yolk fluid and the glass transition temperature of the EYP

2.7 傅里葉變換中遠紅外分析

圖3 EYP的FT-IR圖譜Fig.3 FT-IR spectrum of EYP

表6 EYP的二級結(jié)構(gòu)相對含量Table 6 Secondary structure relative content of EYP

2.8 EYP中活性IgY的含量

如表7所示,與對照組相比,添加雙糖的EYP中保留的活性IgY含量增加。在之前的研究中,冷凍干燥會影響IgY的活性,但海藻糖和蔗糖對IgY均有保護作用[13,24],且海藻糖的保護效果要優(yōu)于蔗糖。

表7 EYP的活性IgY保留含量Table 7 Active IgY retention content of EYP

3 結(jié)論

通過測定EYP的溶解度、色澤、熱穩(wěn)定性以及活性卵黃抗體的含量,確定了雙糖對凍干EYP水溶性和活性抗體含量的改善作用。此外,通過測定微觀結(jié)構(gòu)、表面疏水性以及二級結(jié)構(gòu),明確了凍干破壞了蛋黃粉中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),并導(dǎo)致了干燥后蛋黃顆粒的聚集以及溶解度的降低,而雙糖可以抑制這一過程,對蛋白質(zhì)起到保護作用,這說明EYP的水溶性與其LDL的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。因此深入研究在保持其活性卵黃抗體含量的基礎(chǔ)上,提高其水溶性和穩(wěn)定性,對EYP在食品領(lǐng)域的應(yīng)用具有深遠影響。