適于紅棗汁發(fā)酵的乳酸菌的篩選及其發(fā)酵特性分析

徐銘陽(yáng),李崎,鄭飛云,王金晶,鈕成拓,劉春鳳*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫,214122)2(江南大學(xué) 釀酒科學(xué)與工程研究室,江蘇 無(wú)錫,214122)

紅棗是鼠李科棗屬植物果實(shí),因同時(shí)擁有食用和藥用價(jià)值、富含活性成分使其成為極佳的功能性食品原料[1]。我國(guó)的紅棗產(chǎn)量世界第一,現(xiàn)年產(chǎn)量已達(dá)750萬(wàn)t左右,約占世界紅棗總產(chǎn)量的90%[2]。但是目前紅棗存在著過(guò)于甜膩而市場(chǎng)不大、不易儲(chǔ)存、附加值低等問(wèn)題,主要以鮮棗和干棗直接食用的消費(fèi)形式,導(dǎo)致產(chǎn)量逐年提升但是價(jià)格卻走低的現(xiàn)象[3]。

乳酸菌是最有代表性的益生菌,被廣泛用作天然食品生物防腐劑,因?yàn)樗鼈兡芡ㄟ^(guò)快速合成有機(jī)酸進(jìn)行酸化,防止有害微生物污染而延長(zhǎng)食品的儲(chǔ)存時(shí)間[4]。植物乳酸菌飲料不含乳制品成分,消除了乳糖不耐癥等問(wèn)題隱患,同時(shí)植物乳酸菌飲料能提供多種營(yíng)養(yǎng)元素,且植物中的多酚可作為益生元促進(jìn)人體腸道菌群的生長(zhǎng)及其對(duì)腸細(xì)胞的黏附[5],通過(guò)乳酸菌發(fā)酵還會(huì)提高多酚類(lèi)物質(zhì)的生理活性和吸收率[6]。

隨著功能性食品市場(chǎng)的擴(kuò)大,植物發(fā)酵飲料成為備受關(guān)注的功能性食品之一,而現(xiàn)紅棗發(fā)酵產(chǎn)品多為棗酒和紅棗醋,技術(shù)已趨于成熟但市場(chǎng)較小,對(duì)于紅棗酸奶、紅棗復(fù)合飲料來(lái)說(shuō),有關(guān)發(fā)酵工藝優(yōu)化方向的研究偏多[7],但對(duì)其成分與風(fēng)味的研究較少,故紅棗雖然歷史悠久但在新技術(shù)不斷發(fā)展的今天仍有巨大的開(kāi)發(fā)潛力,紅棗發(fā)酵飲料作為新型的紅棗產(chǎn)品具有廣闊的市場(chǎng)前景。

在低糖飲料受到大多人喜愛(ài)的趨勢(shì)下,利用乳酸菌發(fā)酵紅棗汁可以豐富紅棗深加工產(chǎn)品門(mén)類(lèi)、提高紅棗產(chǎn)品功能屬性、提升紅棗產(chǎn)品附加值,具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。為此,本研究以分離各水果樣品中潛在乳酸菌和實(shí)驗(yàn)室保藏共計(jì)204株菌株為研究對(duì)象,判斷其產(chǎn)酸能力、耐酸能力和耐膽鹽能力的益生菌特性,并分析菌株發(fā)酵所得紅棗汁理化指標(biāo)、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及其香氣貢獻(xiàn),最終得到具有優(yōu)良潛力的乳酸菌菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

河北產(chǎn)金絲小棗,市售;乳酸菌,實(shí)驗(yàn)室保藏菌株;有機(jī)酸、揮發(fā)性化合物標(biāo)準(zhǔn)品為色譜純,美國(guó)Sigma公司;其他試驗(yàn)藥品均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

MRS(de Man,Rogosa and Sharpe)培養(yǎng)基用于乳酸菌培養(yǎng),主要成分包括酵母粉5 g、蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、葡萄糖10 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸氫二銨2 g、MgSO40.6 g、MnSO40.3 g、吐溫-80 1 mL,蒸餾水1 000 mL,瓊脂粉20 g(用于固體培養(yǎng)基),115 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基:調(diào)整處理好的紅棗汁含糖量為140 g/L,于高壓蒸汽滅菌鍋105 ℃滅菌10 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種分離

取不同水果榨汁后,調(diào)整糖度至140 g/L,取200 mL倒入無(wú)菌三角瓶中,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中自然發(fā)酵48 h,取2 mL菌液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%生理鹽水10倍稀釋7個(gè)濃度梯度,將稀釋的菌液均勻涂布在含有25 mg/L制霉菌素的抗菌MRS平板上,37 ℃厭氧培養(yǎng)2 d,并觀(guān)察菌落生長(zhǎng)情況。每組3個(gè)平行。將培養(yǎng)后的MRS平板中具有典型乳酸菌特征的單菌落挑出,在MRS平板中進(jìn)行二次劃線(xiàn)分離。將分離到的單菌落培養(yǎng)后接入甘油管在-80 ℃下保存,并編號(hào)。

1.3.2 菌株產(chǎn)酸能力

將甘油管保藏菌株接種于MRS液體試管中,37 ℃、180 r/min培養(yǎng)活化2次后接種的菌株,接種于含有溴甲基酚紫的MRS平板上,37 ℃培養(yǎng)48 h,保留使培養(yǎng)基顯著變黃色的菌株進(jìn)行下一級(jí)篩選。

1.3.3 菌株益生菌特性

1.3.3.1 耐酸能力

將上述篩選獲得的具有產(chǎn)酸能力的菌株接種于MRS液體試管中,37 ℃活化12～18 h,將活化后菌液分別接種于pH為2的酸性MRS液體培養(yǎng)基和普通MRS液體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)3 h,稀釋合適的倍數(shù)后涂布MRS平板,計(jì)算耐酸存活率,每組3個(gè)平行。將存活率≥95%的乳酸菌確定為耐酸能力較強(qiáng)的菌株。

耐酸存活率按公式(1)計(jì)算:

(1)

式中:N1,耐酸培養(yǎng)基培養(yǎng)后菌落數(shù);N2,MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)后菌落數(shù)。

1.3.3.2 耐膽鹽能力

將上述篩選獲得的耐酸能力較強(qiáng)的菌株在MRS液體試管中37 ℃活化12～18 h后,將同一菌株以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量分別接種于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基和普通MRS液體培養(yǎng)基中,在620 nm波長(zhǎng)下,同一菌種在不同培養(yǎng)基中增加0.3單位吸光度的時(shí)間之差,被認(rèn)為是菌株在含0.3%膽鹽環(huán)境中的適應(yīng)時(shí)間,其值越低表示菌株耐膽鹽能力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 紅棗汁的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

以紅棗汁為原料,調(diào)整含糖量至140 g/L,可滴定酸2質(zhì) g/L,發(fā)酵規(guī)模500 mL,裝液量60%,105 ℃高壓蒸汽滅菌10 min,接種植物乳植桿菌MY-12使其在紅棗汁中的菌濃度達(dá)到1×107CFU/mL,37 ℃發(fā)酵48 h,發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液基本理化指標(biāo),并進(jìn)行感官品評(píng)分析。

1.4 分析檢測(cè)方法

1.4.1 基礎(chǔ)理化指標(biāo)測(cè)定

參照GB/T 31121—2014 《果蔬汁類(lèi)及其飲料》和GB 4789.35—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》中的方法,測(cè)定紅棗發(fā)酵飲料的可溶性固形物含量、pH值、總酸、總糖、活菌數(shù)和酒精度。

1.4.2 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

1.4.2.1 DPPH自由基清除率測(cè)定

使用無(wú)水乙醇溶解DPPH并配制0.3 mmol/L的DPPH溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用并于黑暗避光處保存。

取0.1 mL待測(cè)樣品或無(wú)水乙醇對(duì)照加入0.4 mL DPPH溶液,在室溫下避光反應(yīng)30 min,在517 nm處測(cè)定吸光值。根據(jù)公式(2)計(jì)算清除率:

(2)

式中:A0,DPPH溶液+無(wú)水乙醇;A1,DPPH溶液+樣品。

1.4.2.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除率測(cè)定

取5 mL的7 mmol/L ABTS溶液和88 μL的140 mmol/L K2S2O8在室溫下避光放置24 h生成ABTS陽(yáng)離子自由基,現(xiàn)配現(xiàn)用,用無(wú)水乙醇稀釋至734 nm處吸光度為0.70±0.02。

取0.2 mL待測(cè)樣品和無(wú)水乙醇對(duì)照加入ABTS自由基4.8 mL,在室溫下于暗處反應(yīng)30 min,測(cè)定734 nm處吸光值,按公式(3)計(jì)算:

(3)

式中:A0,ABTS溶液+無(wú)水乙醇;A1,ABTS溶液+樣品。

1.4.2.3 鐵離子還原力(ferric reducing antioxidant power,FRAP)測(cè)定

0.3 mol/L醋酸鈉緩沖液:1.82 g無(wú)水醋酸鈉和16 mL冰醋酸,加水定容至1 L,用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3.6。10 mmol/L氯化三苯四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TPTZ)溶液:TPTZ溶于40 mmol/L HCl。20 mmol/L FeCl3溶液:FeCl3溶于去離子水。上述3種溶液按照10∶1∶1的體積比混合后,即為FRAP工作液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

取待測(cè)液0.1 mL加入工作液3 mL,37 ℃反應(yīng)10 min,于593 nm處測(cè)定吸光值。

1.4.2.4 總多酚含量的測(cè)定(福林酚法)

取1 mL樣品置于100 mL容量瓶中,加入60 mL去離子水和5 mL福林酚試劑,混勻后加入15 mL Na2CO3(200 mg/L),添加去離子水至100 mL,充分混合。20 ℃反應(yīng)2 h后,在波長(zhǎng)765 nm處測(cè)定吸光度,以相應(yīng)試劑作為空白對(duì)照。

1.4.2.5 游離酚類(lèi)物質(zhì)含量的測(cè)定

樣品預(yù)處理:將3 g的樣品加入到10 mL的甲醇-水溶液中[V(甲醇)∶V(水)=8∶2]中,渦旋1 min后10 000 r/min離心15 min,取上清液過(guò)有機(jī)膜后-20 ℃保存。

采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定不同酚類(lèi)化合物及含量。色譜分離條件:色譜柱BEH C18柱(50 mm×2.1 mm I.D,1.7 mm粒度),波長(zhǎng)掃描范圍設(shè)置200～600 nm。流動(dòng)相A為100%乙腈,流動(dòng)相B為0.1%甲酸在超純水中,采用梯度洗脫方式,流速0.3 mL/min。進(jìn)樣量5 μL,梯度洗脫順序:98%～80% B(0～15 min)、80%～60%B(15～20 min)、60%～20%B(20～25 min)、20%～0B(25～27 min)、0～98%B(0.1 min)、98% B(27.1～30 min)。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI)負(fù)離子模式檢測(cè),全掃描模式,質(zhì)量范圍m/z50～2 000。噴霧電壓3.0 kV,氮?dú)饬魉?0 L/min,輔助氣流速50 L/min,毛細(xì)管溫度400 ℃,加熱器溫度100 ℃。

數(shù)據(jù)采集和處理使用美國(guó)Waters公司的MassLynx4.1 SCN805軟件。

1.4.3 非揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定

1.4.3.1 有機(jī)酸含量的測(cè)定

將樣品適當(dāng)稀釋后,經(jīng)C18固相萃取柱過(guò)濾后用0.22 μm水系濾膜過(guò)濾備用。色譜條件:色譜柱Waters X Select HSS T3(4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相:0.02 mol/L(pH 2.5)KH2PO4緩沖液;流速0.5 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm;進(jìn)樣量10 μL;柱溫30 ℃。根據(jù)峰保留時(shí)間和峰面積與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品比較作定量測(cè)定。

1.4.3.2 糖與多元醇含量的測(cè)定

葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油和山梨醇的含量通過(guò)Waters1525 HPLC折射率檢測(cè)器,使用Sugarpak 16.5 mm×300 mm陽(yáng)離子交換柱進(jìn)行分析,流動(dòng)相為超純水,流速0.3 mL/min,柱溫85 ℃,進(jìn)樣體積10 L。

1.4.4 揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定

通過(guò)固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定樣品中揮發(fā)性化合物,樣品處理?xiàng)l件:將8 mL樣品加入20 mL潔凈螺口頂空瓶中,并加入2.0 g NaCl和2-辛醇內(nèi)標(biāo)(終質(zhì)量濃度50 μg/L)。45 ℃預(yù)熱5 min,萃取60 min。萃取結(jié)束后,將75 μm CAR/PDMS萃取頭插入進(jìn)樣口,250 ℃解吸附5 min。分析條件為:EG-20 m彈性石英毛細(xì)管柱,30 m×0.25 m×0.25 μm;載氣為高純氦氣,恒定流量0.8 mL/min,升溫程序:從180 ℃開(kāi)始,保持2 min,以3 ℃/min升溫到230 ℃,保持10 min;進(jìn)樣口溫度250 ℃,出樣口溫度200 ℃;檢測(cè)電壓350 V。

質(zhì)譜條件:電子轟擊(EI)源,發(fā)射電流200 μA,電子能量70 eV,掃描范圍20～550 U。未知化合物定性通過(guò)與NIST05質(zhì)譜庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)譜圖比對(duì)確定,化合物定量通過(guò)在體積分?jǐn)?shù)10%乙醇溶液中配制待測(cè)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液,根據(jù)定量化合物與內(nèi)標(biāo)化合物峰面積比值與定量化合物濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)確定樣品中揮發(fā)性化合物濃度。

1.4.5 感官品評(píng)

感官品評(píng)小組由4位具有專(zhuān)業(yè)品評(píng)經(jīng)驗(yàn)的老師和16名經(jīng)品評(píng)訓(xùn)練選拔出的研究生組成,小組成員定期開(kāi)展紅棗飲料感官品評(píng)訓(xùn)練后作為品評(píng)員完成感官品評(píng)。在評(píng)價(jià)中,將棗汁樣品的酸、膩、澀味和花香、果香、臭或異味進(jìn)行描述,并要求小組成員評(píng)價(jià)棗漿的外觀(guān)、發(fā)酵性和整體接受程度。專(zhuān)家組成員對(duì)每個(gè)樣品的感官屬性的強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為10分,從“幾乎感受不到”(1分)到“感受極強(qiáng)”(10分)。

1.4.6 菌株16S rDNA鑒定

將甘油管保藏菌株于10 mL MRS培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r/min過(guò)夜活化,隨后轉(zhuǎn)接至10 mL MRS培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12～16 h。取適量培養(yǎng)液離心1 min(12 000 r/min),棄上清液,采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取基于16S rDNA的菌株的分子鑒定基因組DNA。16S rDNA基因的擴(kuò)增準(zhǔn)備使用引物:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-TACGGYACCTTGTTACGACTT-3′。采用BLAST方式將測(cè)定的16S rDNA序列與GenBank中的菌株進(jìn)行比對(duì),構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理與分析

使用GraphPadPrism8.4.3軟件繪圖,SPSS 26.0軟件作顯著性、主成分等統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌株的篩選

試驗(yàn)從紅棗、梨和桃子等十幾種水果的自然培養(yǎng)基中分離得到乳酸菌株123株,加上實(shí)驗(yàn)室保藏乳酸菌株81株,共204株乳酸菌株用于下一步試驗(yàn)篩選,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 菌株篩選結(jié)果Table 1 Strain screening results

使用含有溴甲基酚紫的產(chǎn)酸能力檢測(cè)瓊脂培養(yǎng)基,通過(guò)顯色程度對(duì)富集得到的乳酸菌進(jìn)行產(chǎn)酸能力表征檢測(cè)。其中89株菌株在產(chǎn)酸培養(yǎng)基上為黃色或橙色,即表示菌株產(chǎn)酸能力好,48 h內(nèi)的生長(zhǎng)代謝旺盛。益生菌需要通過(guò)人體消化系統(tǒng)到腸道才能發(fā)揮作用,根據(jù)人體消化途徑,是否有著耐強(qiáng)酸能力和高膽鹽濃度的適應(yīng)力是優(yōu)良益生菌的篩選標(biāo)準(zhǔn)。研究將上述菌株依次開(kāi)展耐酸能力和耐膽鹽能力測(cè)試,考察其耐酸和耐膽鹽性能,如表1所示,耐酸存活率>95%的有11株菌,對(duì)膽鹽培養(yǎng)基適應(yīng)時(shí)間<3 h的菌株共有6株。后續(xù)研究進(jìn)一步以這6株菌株為研究對(duì)象,開(kāi)展紅棗汁發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

2.2 紅棗汁乳酸菌發(fā)酵

2.2.1 基本理化指標(biāo)分析

將篩選出的6株乳酸菌接種于紅棗汁中37 ℃發(fā)酵48 h,測(cè)定發(fā)酵液基礎(chǔ)理化指標(biāo),結(jié)果如表2所示。紅棗汁中的可溶性固形物最高,接種乳酸菌后,可溶性固形物含量有不同程度下降,其中M-48發(fā)酵樣品減少了多達(dá)61.15%的可溶性固形物,MY-41對(duì)可溶性固形物的減少最低,僅有3.60%。不同菌株發(fā)酵液中的總酸和總糖測(cè)定結(jié)果比較可知,M-48發(fā)酵液含有的總糖量最少,僅為26.85 g/L,而總酸含量最高,達(dá)到14.63 g/L。菌株MY-17和MY-23發(fā)酵液中總酸較高而總糖含量較低,MY-41和YM-51發(fā)酵液中總酸較低而總糖含量較高,相比之下,菌株MY-12的總糖和總酸含量均處于中等水平,其酸和糖的含量水平有著更為合適的發(fā)酵口味優(yōu)勢(shì)潛力。6株乳酸菌經(jīng)48 h發(fā)酵完成后的活菌數(shù)都符合國(guó)家對(duì)乳酸菌飲料的活菌數(shù)控制標(biāo)準(zhǔn)(>6 lg CFU/mL),其中MY-12發(fā)酵液中活菌數(shù)最高,達(dá)到9.74 lg CFU/mL,這表明其在棗汁中生長(zhǎng)能力強(qiáng)。而酒精度指標(biāo)方面,除M-48發(fā)酵樣品外,其他菌株發(fā)酵的樣品酒精度均<0.5%,隸屬于無(wú)酒精飲料的范疇。

表2 紅棗飲料理化指標(biāo)Table 2 Physicochemical indices of jujube beverage

2.2.2 紅棗乳酸菌發(fā)酵液抗氧化性測(cè)定

6株乳酸菌發(fā)酵后紅棗汁的抗氧化活性如電子版中的增強(qiáng)出版附表1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034909)。相較于對(duì)照紅棗汁,6株乳酸菌發(fā)酵后均能提升對(duì)DPPH、ABTS和FRAP的自由基清除能力。其中,乳酸菌MY-12發(fā)酵液對(duì)于DPPH自由基和FRAP的清除能力較強(qiáng),相較對(duì)照組分別提升了2.81和7.97 mmol Trolox/L;而菌株M-48發(fā)酵液對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力最強(qiáng),比對(duì)照樣品提升了35.34%。以上結(jié)果表明,紅棗汁接種乳酸菌發(fā)酵對(duì)其抗氧化能力的提升具有正向影響。乳酸菌MY-12和M-48發(fā)酵后總多酚含量分別較紅棗汁增加了27.90%和65.12%,這可能由于菌株中相關(guān)水解酶將復(fù)雜的酚類(lèi)化合物水解成更簡(jiǎn)單的形式[8],例如將糖基化的酚類(lèi)物質(zhì)脫糖,并從植物細(xì)胞壁上釋放出游離的酚類(lèi)化合物[9],而乳酸菌發(fā)酵后體外抗氧化力的增強(qiáng)可以歸于游離多酚類(lèi)物質(zhì)的變化[10]。

因此,進(jìn)一步研究提取游離酚類(lèi)化合物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè),可以看出紅棗汁及其乳酸菌發(fā)酵液中游離酚類(lèi)化合物主要是沒(méi)食子酸、阿魏酸、綠原酸等。紅棗汁被乳酸菌發(fā)酵后原兒茶酸含量的下降可能是由于脫羧基反應(yīng),通過(guò)該反應(yīng)被代謝為兒茶酚,對(duì)香豆酸含量降低的原因是其脫羧基生成對(duì)乙烯基苯酚,然后酚酸還原酶把其還原為4-乙基苯酚[11]。此外,糖、有機(jī)酸和氨基酸的代謝,即乳酸菌的能量代謝,也會(huì)影響酚酸的脫羧基和還原反應(yīng)[12]。酚類(lèi)化合物的生物轉(zhuǎn)化已被證明是與脫羧酶或還原酶活性有關(guān)[13]。

2.2.3 紅棗飲料感官品評(píng)

采用“描述性感官分析”方法對(duì)紅棗發(fā)酵液的感官特征進(jìn)行了評(píng)價(jià)[14],表3顯示了各菌株發(fā)酵所得發(fā)酵紅棗汁感官品評(píng)得分結(jié)果。由表3可知,未經(jīng)處理的紅棗汁的澀味和膩味分別可達(dá)到8.2和7.1分,不同菌種發(fā)酵后,酸味和花香明顯增加,并占主導(dǎo)地位。香氣指標(biāo)下各菌株具有一定差異,其中菌株MY-12,MY-41發(fā)酵紅棗汁香氣較馥郁,花香果香感官得分最高,而MY-17酸味最強(qiáng)并紅棗典型性強(qiáng),MY-23和YM-51發(fā)酵紅棗香氣愉悅度低,有輕微異雜味,整體香味不足,M-48的發(fā)酵液酸臭味明顯,氣味比較刺鼻,令人不悅。在口味上,MY-12和MY-23酸甜適中,酸味分別為6.3和5.0分;MY-41和YM-51偏甜而酸味不足,酸味為3.4和4.0分;MY-17和M-48酸味太過(guò)突出,酸味達(dá)到9.0和9.1分。

表3 紅棗飲料感官得分Table 3 Organoleptic evaluation of jujube beverage

2.2.4 紅棗飲料非揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定

紅棗乳酸菌飲料中的非揮發(fā)性成分主要由糖和有機(jī)酸組成,不同菌種發(fā)酵紅棗汁的測(cè)定結(jié)果如表4所示。就對(duì)于糖利用而言,這些菌株可以?xún)?yōu)先利用葡萄糖和蔗糖,而同時(shí)有研究表明乳酸菌的水解酶也可以代謝低聚果糖[15]。甘油和山梨糖醇因其對(duì)光滑度、甜度和復(fù)雜性的影響而成為飲料中的感官化合物[16]。發(fā)酵后的甘油含量均降低,這是因?yàn)槿樗峋鷷?huì)代謝甘油生成醛類(lèi)物質(zhì)[17],而山梨糖醇除M-48外其他組較對(duì)照組無(wú)顯著變化。

表4 紅棗飲料中非揮發(fā)性物質(zhì)組成 單位:g/L

紅棗飲料中有機(jī)酸種類(lèi)豐富,共檢出有機(jī)酸7種,其中含量最高的有機(jī)酸為乳酸。有機(jī)酸有助于中和紅棗甜膩口感,豐富飲料層次,提高整體品質(zhì),但含量過(guò)高則表現(xiàn)酸感突出、口感粗糙。乳酸口感柔和,增加酒體醇厚度[18],MY-12和MY-17發(fā)酵的紅棗汁乳酸含量最高,達(dá)8.92和9.04 g/L,作為一種溫和有機(jī)酸,更高濃度乳酸可能使飲料更柔滑。但MY-17的檸檬酸和蘋(píng)果酸相較更高,檸檬酸酸味較長(zhǎng),口感圓潤(rùn)清爽,但過(guò)量則有辛辣感[19],蘋(píng)果酸酸感清爽,呈味持久且略帶刺激性。

2.2.5 紅棗飲料揮發(fā)性物質(zhì)組成分析

通過(guò)GC-MS檢測(cè)到紅棗飲料中31種不同的香氣化合物,包括醇、醛、酮、酯、揮發(fā)酚和酸等。在這些化合物中,確定了11個(gè)酸類(lèi)、4個(gè)醇類(lèi)、5個(gè)醛類(lèi)、5個(gè)酮類(lèi)和6個(gè)酯類(lèi)化合物,總體而言,乳酸菌發(fā)酵的樣品的香氣化合物總量均高于發(fā)酵前的對(duì)照樣品,而酸類(lèi)化合物含量最高,占所有揮發(fā)性物質(zhì)的53.84%～81.18%。由電子增強(qiáng)出版附件圖1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034909),菌株MY-12發(fā)酵的樣品提高了異戊醇、苯甲醇、己醛、辛酸乙酯和乙酸乙酯等揮發(fā)性物質(zhì)含量,菌株MY-23發(fā)酵的樣品2-甲基丁酸、己酸、壬酸和十二烷酸乙酯等物質(zhì)的含量得到提升,菌株M-48發(fā)酵樣品的丁酸、糠醛、乙酸和仲辛酮等含量最高。綜上,乳酸菌發(fā)酵后整體酸類(lèi)物質(zhì)得到提升,而醛被認(rèn)為是通過(guò)與氨基酸的反應(yīng)或不飽和脂肪酸的β-氧化形成的,而發(fā)酵會(huì)促進(jìn)這些反應(yīng)[20],同時(shí)研究表明,醛類(lèi)化合物在微生物作用下是不穩(wěn)定的,在食物基質(zhì)中很容易被還原為醇或氧化為酸[21]。此外,發(fā)酵過(guò)程增加了酮的形成,這些酮類(lèi)物質(zhì)被認(rèn)為具有草藥、水果甚至是花的芳香,可能為棗汁提供更宜人的香氣,醇被認(rèn)為是由乳糖代謝、脂肪酸降解、氨基酸代謝和酮類(lèi)物質(zhì)還原形成的[14]。某些酯類(lèi)的降低可能通過(guò)發(fā)酵過(guò)程降解為相應(yīng)的酸和醇[22]。并不是所有揮發(fā)物都對(duì)棗汁的感官特征有顯著影響,可能與某些強(qiáng)效微量揮發(fā)物閾值較低有關(guān)。

a-揮發(fā)性化合物;b-菌株產(chǎn)品樣本圖1 紅棗飲料主成分分析Fig.1 Principal component analysis of jujube beverage

2.2.6 紅棗飲料主要揮發(fā)性化合物的香氣活力值(odor activity value,OAV)

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)每種揮發(fā)物的風(fēng)味作用,對(duì)菌株發(fā)酵和未處理樣品進(jìn)行定量分析和OAV計(jì)算。OAV用來(lái)表征化合物對(duì)樣品香氣的貢獻(xiàn)程度,通過(guò)該揮發(fā)性風(fēng)味化合物在樣品中濃度與該化合物氣味閾值比值計(jì)算[23],OAV>1則表示該化合物對(duì)整體香氣具有顯著貢獻(xiàn)[24]。由電子增強(qiáng)出版附件表2(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034909)可知,紅棗飲料25種揮發(fā)性化合物中共有14種化合物OAV>1,為關(guān)鍵香氣化合物。其中苯甲醇和苯乙醇是各種風(fēng)味優(yōu)秀的果汁和具有花香的葡萄酒中的成分,是苯丙氨酸分解代謝的結(jié)果[25],己醛具有青草和水果的清香,乙酸乙酯有著水果的特征香氣,這些化合物可給酒體貢獻(xiàn)積極的果香味和花香。MY-12發(fā)酵液樣品中以上幾種化合物OAV相較最高,分別為1.29、3.61和1.23,這也是表3中感官品評(píng)結(jié)果中MY-12發(fā)酵液具有更強(qiáng)烈的花香水果氣味的重要原因。酸類(lèi)物質(zhì)是飲料中重要呈味物質(zhì),可賦予酒體協(xié)調(diào)的口感,但高濃度下產(chǎn)生脂肪、腐臭等異味,給產(chǎn)品帶來(lái)負(fù)面影響。十二烷酸乙酯、肉豆蔻酸甲酯和月桂酸乙酯具有脂肪和奶油等負(fù)面膩味,而通過(guò)乳酸菌的發(fā)酵將其分解為酸和醇,故大多樣品發(fā)酵后含量均下降,發(fā)酵前紅棗汁和M-48樣品的含量最高?？啡?、苯甲醛和苯甲酸甲酯具有杏仁和堅(jiān)果味道,其含量過(guò)高時(shí)會(huì)有焦糊味和酸澀味等不悅風(fēng)味,原棗汁中上述物質(zhì)含量較高,為棗汁澀味的來(lái)源,MY-41樣品中上述化合物濃度更高,在感官結(jié)果可以得到證實(shí)。

研究進(jìn)一步對(duì)OAV>1的14種揮發(fā)性化合物作主成分分析,結(jié)果如圖1所示。

由圖1-a可以看出,前2個(gè)主成分描述90.84%方差,其中第一主成分(PC1)占方差67.55%,與乙酸乙酯等呈正相關(guān),與己酸等呈負(fù)相關(guān)。第二主成分(PC2)占方差24.59%,與戊酸等呈正相關(guān),與月桂酸乙酯等呈負(fù)相關(guān)?；衔镏g主成分得分有重疊,表明其含量具有相似特征?；赑C1和PC2計(jì)算得到每個(gè)菌株發(fā)酵飲料樣本分?jǐn)?shù)FAC1和FAC2,分別對(duì)應(yīng)圖1-b中x和y軸,該圖顯示7個(gè)樣品在坐標(biāo)系中差異,樣品相距越遠(yuǎn)其差異值越大。

綜合上述研究,經(jīng)相同發(fā)酵時(shí)間,菌株MY-12發(fā)酵紅棗汁酸甜適中,對(duì)紅棗中游離多酚增強(qiáng)效果明顯,揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成較優(yōu),感官評(píng)價(jià)口感協(xié)調(diào),香氣馥郁,對(duì)紅棗甜膩和澀味口感改善明顯,具有發(fā)酵優(yōu)秀品質(zhì)功能性紅棗乳酸菌飲料的潛力。

2.3 菌株鑒定

對(duì)優(yōu)選菌株MY-12提取菌體DNA后,進(jìn)行16S rDNA測(cè)序分析,采用BLAST 方式將測(cè)定的16S rDNA 序列與GenBank中序列作比對(duì),生成系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果,如圖2所示?？梢钥闯?所篩選菌株為植物乳植桿菌(Lactiplantibacillusplantarum)。

3 主要結(jié)論與展望

用乳酸菌發(fā)酵紅棗汁可以通過(guò)一定數(shù)量的乳酸菌活菌數(shù)(>6 lg CFU/mL)到達(dá)腸道以實(shí)現(xiàn)益生作用,同時(shí)植物飲料所能提供的多酚等多種功能因子可以對(duì)人體有多種益處,通過(guò)乳酸菌發(fā)酵可以增強(qiáng)體外抗氧化力和游離多酚含量,同時(shí)利用功能性食品原料—紅棗作為植物基,通過(guò)乳酸菌發(fā)酵不僅可以提升食品質(zhì)量,還可以增加感官表達(dá)提高其營(yíng)養(yǎng)特性。

本試驗(yàn)以水果自然發(fā)酵液和實(shí)驗(yàn)室保藏菌株為篩選源,基于產(chǎn)酸能力、耐酸能力、耐膽鹽能力、發(fā)酵性能試驗(yàn)和產(chǎn)品揮發(fā)性風(fēng)味化合物分析,篩選獲得優(yōu)良植物乳植桿菌菌株MY-12。該菌株產(chǎn)酸能力強(qiáng),有著益生菌特性,在含糖量140 g/L的紅棗汁中,37 ℃發(fā)酵48 h可產(chǎn)生的活菌數(shù)超過(guò)9 lg CFU/mL、糖酸比為20、口感協(xié)調(diào)的紅棗乳酸菌飲料。使用該菌株發(fā)酵所得紅棗飲料中多種揮發(fā)性風(fēng)味化合物如異戊醇、苯甲醇等均優(yōu)于其他菌株或處于較高水平,使得發(fā)酵后產(chǎn)品口感清爽,極大改善了紅棗汁原本甜膩的風(fēng)味,感官品評(píng)結(jié)果優(yōu)于其他菌株。目前,乳酸菌發(fā)酵植物飲料是近幾年的研究熱點(diǎn),但很少聚焦于紅棗深加工產(chǎn)品的解決辦法。研究乳酸菌在紅棗飲料中的發(fā)酵特性,提供系統(tǒng)的選育方法,并篩選得到具有優(yōu)良發(fā)酵品質(zhì)的乳酸菌菌株,對(duì)于未來(lái)發(fā)酵型植物益生飲料的研發(fā)具有較強(qiáng)的理論意義和工業(yè)應(yīng)用參考價(jià)值。