系統(tǒng)代謝工程改造谷氨酸棒桿菌高產(chǎn)L-丙氨酸

吳晨,王澤婷,趙桂紅,呂庚承,王非傲,劉月香,陳寧,2,3,李燕軍,2,3*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津,300457)2(天津科技大學(xué) 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室,天津,300457) 3(天津科技大學(xué) 代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室,天津,300457)

L-丙氨酸(L-α-丙氨酸)是一種重要的天然氨基酸,是人體血液中含量最多的氨基酸,與糖代謝密切相關(guān),是轉(zhuǎn)氨反應(yīng)中重要的氨基供體,具有重要的生理功能。此外,其還具有防止其他氨基酸褐變、緩沖酸堿以及螯合重金屬的作用[1]。L-丙氨酸被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料等領(lǐng)域。在食品領(lǐng)域,L-丙氨酸是甜味最強(qiáng)的氨基酸,甜味約為蔗糖的70%,是甘氨酸甜度的1.6倍[2]。除作甜味劑外,L-丙氨酸還可以增強(qiáng)鮮味,調(diào)和食品的咸味、酸味,緩和辣味、苦味、澀味等刺激性味道[3]。L-丙氨酸能夠被細(xì)胞直接吸收,有利于提高在食品和飲料中的蛋白利用率,而且與其他調(diào)味劑相比,它的獨特優(yōu)勢在于國家標(biāo)準(zhǔn)中并未限定L-丙氨酸的用量[4]。在醫(yī)藥領(lǐng)域,L-丙氨酸是合成氨基丙醇的重要原料,也是組成復(fù)合氨基酸注射液和口服液的原料;還是潛在的胰高血糖素分泌刺激劑,已用于急性和慢性胰腺炎患者的高血糖素的研究中。另外,L-丙氨酸可以緩解酒精對肝臟的傷害,且具有減肥的功效。在飼料領(lǐng)域,L-丙氨酸對一些幼畜內(nèi)臟的氮循環(huán)具有一定的生理作用和積極意義,例如在實驗小鼠糖代謝方面起到重要的作用[5]。飼料中添加一定量的L-丙氨酸,可以促進(jìn)動物生長、緩解應(yīng)激、預(yù)防疾病,具有增強(qiáng)免疫的作用[6]。L-丙氨酸在工業(yè)上主要發(fā)揮螯合作用,以L-丙氨酸為原料生產(chǎn)的二羧甲基丙氨酸(N,N-dicarboxymethyl alanine, MGDA),具有高效的螯合能力[7]。MGDA對人類和環(huán)境無危害,可用于農(nóng)業(yè)、紡織業(yè)、化妝品等行業(yè)的清洗工序,其良好的生態(tài)和毒理學(xué)特性、高效的清潔能力、對皮膚的無刺激性將引領(lǐng)新型螯合劑的發(fā)展[8]。

目前,L-丙氨酸的工業(yè)生產(chǎn)主要采用微生物發(fā)酵法,和其他方法相比,微生物發(fā)酵法反應(yīng)條件溫和、成本較低、可實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。生產(chǎn)效率主要取決于所應(yīng)用的工程菌株,L-丙氨酸的生產(chǎn)菌株主要為大腸桿菌(Escherichiacoli)。為了提高L-丙氨酸直接前體物丙酮酸的供應(yīng),LEE等[9]將表達(dá)球形芽孢桿菌(Bacillussphaericus)丙氨酸脫氫酶基因alaD的質(zhì)粒導(dǎo)入aceF和ldhA雙突變的大腸桿菌宿主,來生產(chǎn)L-丙氨酸。該菌株需要乙酸作為額外碳源,通過先好氧、后限氧兩階段發(fā)酵27 h,L-丙氨酸產(chǎn)量達(dá)到32 g/L。隨后,他們進(jìn)一步敲除了宿主丙酮酸代謝相關(guān)基因pfl、pps和poxB,優(yōu)化發(fā)酵控制工藝后,通過兩階段發(fā)酵30 h,L-丙氨酸產(chǎn)量達(dá)到88 g/L[10]。ZHANG等[11]以大腸桿菌W菌株出發(fā),敲除了mgsA和dadX基因,在ldhA位點表達(dá)來源于嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus)的丙氨酸脫氫酶基因,該菌株L-丙氨酸合成過程中,NADH的氧化與ATP再生和細(xì)胞生長相耦聯(lián),因此采用適應(yīng)性進(jìn)化篩選生長加快的菌株即為L-丙氨酸合成能力提高的菌株,最終進(jìn)化菌株XZ132發(fā)酵48 h時產(chǎn)生113.8 g/LL-丙氨酸。與大腸桿菌相比,谷氨酸棒桿菌在工業(yè)發(fā)酵領(lǐng)域具有特殊優(yōu)點:不產(chǎn)生內(nèi)毒素,為食品安全級菌株,對碳源及目標(biāo)產(chǎn)物具有高濃度耐受性,缺乏限制修飾系統(tǒng),具有較強(qiáng)的遺傳穩(wěn)定性,不易污染噬菌體[12-13]。近年來,隨著谷氨酸棒桿菌全基因組測序的完成[14]和基因編輯技術(shù)的成熟[15-16],利用代謝工程技術(shù)改造谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)氨基酸等產(chǎn)品受到越來越多的關(guān)注。

本研究以谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC 13032 strpR[17]為出發(fā)菌株,首先,篩選不同來源的丙氨酸脫氫酶并多拷貝整合到基因組中來促進(jìn)L-丙氨酸的合成;然后,在敲除ldhA的同時整合大腸桿菌來源的丙氨酸輸出蛋白基因alaE,引入非磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(phosphotransferase system, PTS)來促進(jìn)葡萄糖的吸收和細(xì)胞的生長;最后,對比研究強(qiáng)化糖酵解關(guān)鍵基因和引入Entner-Doudoroff(ED)途徑來促進(jìn)前體物丙酮酸的供應(yīng)。L-丙氨酸在谷氨酸棒桿菌中的合成路徑和上述代謝工程改造策略見圖1。工程菌株在5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵48 h,L-丙氨酸產(chǎn)量達(dá)到104 g/L。

圖1 谷氨酸棒桿菌中L-丙氨酸合成途徑及代謝工程改造策略Fig.1 L-Alanine biosynthetic pathway in Corynebacterium glutamicum and metabolic engineering strategies注:藍(lán)色代表基因過表達(dá);紅色代表敲除;綠色代表引入外源基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究所用菌株與質(zhì)粒見表1。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 5,pH 7.0,121 ℃滅菌20 min。

腦心浸液液體(brain heart infusion broth,BHIB)培養(yǎng)基(g/L):腦心浸液38.5,121 ℃滅菌20 min。

腦心浸液瓊脂(brain heart infusion agar,BHIA)固體培養(yǎng)基(g/L):腦心浸液38.5,瓊脂粉2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),121 ℃滅菌20 min。

BHIS(brain heart infusion supplemented)復(fù)蘇液(g/L):腦心浸液38.5,葡萄糖5,115 ℃滅菌15 min。

搖瓶種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40,(NH4)2SO41,KH2PO41.5,MgSO4·7H2O 0.4,FeSO4·7H2O 10 mg/L,MnSO4·H2O 10 mg/L,維生素B1、維生素B3、維生素B5、維生素B12各0.4 mg/L,生物素0.1 mg/L,酵母粉5,蛋氨酸0.3,谷氨酸1,絲肽粉2,苯酚紅2%(體積分?jǐn)?shù)),消泡劑少許,pH 7.0～7.2,115 ℃滅菌15 min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖80,(NH4)2SO43,KH2PO42.5,MgSO4·7H2O 1.6,FeSO4·7H2O 10 mg/L,MnSO4·H2O 10 mg/L,維生素B1、維生素B3、維生素B5、維生素B12各0.3 mg/L,酵母粉2,蛋氨酸0.2,谷氨酸2,絲肽粉5,苯酚紅2%,消泡劑少許,pH 7.0～7.2,115 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40,KH2PO42,MgSO4·7H2O 1.2,MnSO4·H2O 10 mg/L,FeSO410 mg/L,維生素B10.5 mg/L,生物素0.1 mg/L,酵母粉5,蛋氨酸0.3,玉米漿30(121 ℃、20 min單獨滅菌),豆粕水解液20 mL/L,消泡劑少許,pH 7.0～7.2,115 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖60,KH2PO42.5,MgSO4·7H2O 1.6,MnSO4·H2O 10 mg/L,FeSO410 mg/L,維生素B10.5 mg/L,生物素0.05 mg/L,谷氨酸2,蛋氨酸0.4,玉米漿35(121 ℃、20 min單獨滅菌),豆粕水解液30 mL/L,消泡劑少許,pH 7.0～7.2,115 ℃滅菌15 min。

1.1.3 主要試劑

限制性內(nèi)切酶XbaI、KpnI、Hind III、BamH I、Primer STAR HS DNA Polymerase、Solution I連接酶,TaKaRa公司;2×Taq Master Mix、ClonExpress II(重組酶),諾唯贊生物科技有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒、DNA直接回收試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒,美國Omega Bio-Tek公司;1 kb DNA Marker,北京博邁德科技發(fā)展有限公司;硫酸卡那霉素、硫酸鏈霉素、氯霉素,美國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

本研究所用引物見電子增強(qiáng)出版附件(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034924)。過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建:分別以需鈉弧菌ATCC 14048、枯草芽孢桿菌168、格氏嗜鹽堿桿菌ATCC 43098和干酪乳桿菌BL23基因組為模板,擴(kuò)增編碼丙氨酸脫氫酶基因alaD的目的片段,并在上下游引物中設(shè)計攜帶與pXtuf酶切后線性載體兩端同源的序列。用限制性核酸內(nèi)切酶Hind III和BamH I酶切線性化pXtuf載體。利用同源重組的方法將目的基因和線性化載體連接,獲得過表達(dá)質(zhì)粒pXtuf-alaDVna、pXtuf-alaDBsu、pXtuf-alaDNge和pXtuf-alaDLcb。采用類似的方法,分別以大腸桿菌W3110、需鈉弧菌ATCC 14048和野油菜黃單胞菌ATCC 33913基因組為模板克隆eddeda操縱子序列,通過同源重組方法與線性化載體連接,獲得過表達(dá)質(zhì)粒pXtuf-eddedaEco、pXtuf-eddedaVna和pXtuf-eddedaXcc。

基因組編輯質(zhì)粒的構(gòu)建:首先擴(kuò)增基因組上靶基因位點的上下游同源臂、啟動子片段、目的基因片段,將以上片段通過重疊PCR方法連接起來。用限制性核酸內(nèi)切酶XbaI和KpnI雙酶切pK18mobrpsL進(jìn)行載體線性化。利用同源重組的方法將重疊片段和線性載體進(jìn)行連接,獲得一系列用于基因組編輯的pK18mobrpsL衍生質(zhì)粒。

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備采用CaCl2介導(dǎo)的方法。將同源重組連接體系轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,于氯霉素或卡那霉素抗性平板培養(yǎng),篩選轉(zhuǎn)化子驗證正確的接入LB培養(yǎng)基37 ℃過夜培養(yǎng),抽提質(zhì)粒并送至金唯智公司測序以確認(rèn)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

1.2.2 菌株構(gòu)建

過表達(dá)菌株的構(gòu)建:將上述構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入谷氨酸棒桿菌感受態(tài)細(xì)胞,驗證正確的菌株并培養(yǎng)保存。

基因組編輯采用基于自殺型質(zhì)粒的2次同源重組方法,第1次同源重組采用卡那霉素篩選,為了提高第2次重組的篩選效率,前期研究中將蔗糖篩選標(biāo)記替換為鏈霉素篩選標(biāo)記[15]。將pK18mobrpsL衍生質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入谷氨酸棒桿菌感受態(tài)細(xì)胞,通過2次同源重組篩選,將PCR驗證正確的菌株送至金唯智公司測序以確認(rèn)構(gòu)建成功。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵

首先利用BHIA斜面培養(yǎng)基將菌體傳代2次,完成菌種活化。用接種環(huán)從二代斜面劃取2環(huán)接到裝液量為30 mL種子培養(yǎng)基的500 mL圓底三角瓶中,于200 r/min、32 ℃培養(yǎng)12～14 h,測定OD600值。將搖瓶種子液按10%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接入裝液量為30 mL的500 mL擋板三角瓶中,于200 r/min、32 ℃進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)48 h,取樣檢測發(fā)酵液中L-丙氨酸的含量。

1.2.4 發(fā)酵罐發(fā)酵

種子培養(yǎng):將茄形瓶斜面上活化好的二代菌種通過無菌水洗脫下來,接種到5 L發(fā)酵罐進(jìn)行種子培養(yǎng),培養(yǎng)液定容至3 L,溫度控制在32～34 ℃,自動流加氨水控制發(fā)酵液pH值在6.7～7.2,控制初始通氣量為2 L/min,初始攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min,溶氧維持在10%～40%。

發(fā)酵培養(yǎng):種子培養(yǎng)至OD600為20～30時,按照20%(體積分?jǐn)?shù))的接種量,將培養(yǎng)好的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,將初始發(fā)酵液體積定容至3 L,溫度控制在32～34 ℃,通過自動流加氨水控制培養(yǎng)基pH在6.7～7.2,通過攪拌和通風(fēng)控制溶氧在10%～40%,當(dāng)葡萄糖濃度降至5 g/L以內(nèi)時流加80%的葡萄糖溶液。定期取樣并測定OD600值,發(fā)酵48 h時測定L-丙氨酸含量。

1.3 分析方法

對發(fā)酵液進(jìn)行適當(dāng)稀釋,用紫外可見分光光度計測定在600 nm處的吸光值。葡萄糖的濃度采用生物傳感分析儀SBA-40E測定。采用HPLC測定L-丙氨酸的濃度,所用儀器為島津LC-20A高效液相色譜儀,色譜柱為ZORBAX Eclipse AAA(150 mm×3.0 mm,美國安捷倫公司);流動相為50%(體積分?jǐn)?shù))的乙腈溶液和50 mmol/L乙酸鈉溶液;柱溫33 ℃;檢測波長360 nm;流速1.0 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選和強(qiáng)化丙氨酸脫氫酶的表達(dá)

2.1.1 優(yōu)化不同來源的丙氨酸脫氫酶

多數(shù)微生物(包括谷氨酸棒桿菌)通過轉(zhuǎn)氨反應(yīng)生成L-丙氨酸,轉(zhuǎn)氨酶以磷酸吡哆醛為輔酶,需要谷氨酸或纈氨酸作為氨基供體[18]。自然界存在一些微生物利用NADH依賴的丙氨酸脫氫酶直接催化丙酮酸和氨合成L-丙氨酸[19-21]。為了構(gòu)建高效合成L-丙氨酸的谷氨酸棒桿菌菌株,本研究首先比較了不同來源丙氨酸脫氫酶對L-丙氨酸合成的影響。將過表達(dá)來源于需鈉弧菌、枯草芽胞桿菌、格氏嗜鹽堿桿菌和干酪乳桿菌的丙氨酸脫氫酶基因的載體,同空質(zhì)粒pXtuf一起轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌ATCC 13032 strpR[17]中,得到菌株Ala1-1、Ala1-2、Ala1-3、Ala1-4和Ala1-5。將這些菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵48 h,測定L-丙氨酸產(chǎn)量(圖2-a)。對照菌株Ala1-1產(chǎn)生4.28 g/LL-丙氨酸,Ala1-5的L-丙氨酸產(chǎn)量與之相當(dāng),其他3株菌產(chǎn)量顯著提升,尤其Ala1-3的產(chǎn)量達(dá)到60 g/L,說明來自枯草芽孢桿菌的alaD基因效果最佳。

圖2 質(zhì)粒過表達(dá)不同來源丙氨酸脫氫酶基因(a)和基因組整合不同拷貝數(shù)枯草芽胞桿菌丙氨酸脫氫酶基因菌株(b)的L-丙氨酸產(chǎn)量Fig.2 L-Alanine production by strains with plasmid-borne expressing of different alanine dehydrogenase (alaD) genes(a) and those with genomic integration of alaD with different copies(b)

2.1.2 多拷貝整合丙氨酸脫氫酶基因

WADA等[22]發(fā)現(xiàn)以質(zhì)粒為載體過表達(dá)基因會影響菌體生長,將關(guān)鍵基因多拷貝整合到大腸桿菌基因組上,可以有效提高L-丙氨酸的產(chǎn)量。為了方便后續(xù)基因操作和保證菌株的遺傳穩(wěn)定性,將枯草芽胞桿菌來源的alaD基因逐次在谷氨酸棒桿菌基因組上整合至3個拷貝,得到菌株Ala2-1、Ala2-2和Ala2-3。搖瓶結(jié)果表明,單拷貝整合菌株Ala2-1產(chǎn)生37.58 g/LL-丙氨酸,隨著拷貝數(shù)的增加,L-丙氨酸的產(chǎn)量也逐漸提高,Ala2-3的產(chǎn)量達(dá)到54.89 g/L(圖2-b),已經(jīng)接近質(zhì)粒過表達(dá)的水平。

2.2 增強(qiáng)葡萄糖的攝取途徑

為了阻斷丙酮酸到乳酸的代謝以及增強(qiáng)L-丙氨酸的輸出,在菌株Ala2-3乳酸脫氫酶基因ldhA位點整合了來源于大腸桿菌的丙氨酸輸出蛋白基因alaE,得到菌株Ala3-1。搖瓶培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株的生長和L-丙氨酸的產(chǎn)量受到顯著影響(圖3)。為了探究原因,進(jìn)行了ldhA的單獨敲除,所得菌株(Ala3-2)與Ala3-1的生長一致(圖3-a),說明敲除ldhA確實影響了菌株的生長?？赡艿脑蚴侨樗岬纳上牧薔ADH,促進(jìn)了NAD+的再生,有利于糖酵解的進(jìn)行。菌株Ala2-3搖瓶培養(yǎng)產(chǎn)生了1.67 g/L乳酸,敲除ldhA后菌株Ala3-1的培養(yǎng)液中檢測不到乳酸的積累。考慮到去除乳酸副產(chǎn)物是必需的,我們保留了ldhA的敲除,試圖在Ala3-1菌株基礎(chǔ)上通過加強(qiáng)葡萄糖的攝取和糖酵解(Embden-Meyerhof-Parnas, EMP)途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞的生長和提高L-丙氨酸的產(chǎn)量。

a-生長曲線;b-L-丙氨酸產(chǎn)量圖3 不同菌株搖瓶發(fā)酵的生長曲線和L-丙氨酸產(chǎn)量Fig.3 Cell growth and L-alanine production by different engineered strains

2.2.1 激活非PTS葡萄糖攝取途徑

谷氨酸棒桿菌主要通過磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP)介導(dǎo)的PTS途徑來攝取葡萄糖。此外,葡萄糖也可以通過非PTS的肌醇透性酶IolT1和IolT2來運(yùn)輸[23]。一個DeoR類轉(zhuǎn)錄因子IolR抑制了iolT1基因的表達(dá),甚至可能還抑制葡萄糖激酶基因(包括glk1、glk2和ppgk)的表達(dá)[24]。非PTS系統(tǒng)已經(jīng)在谷氨酸棒桿菌中被廣泛應(yīng)用,主要是用來生產(chǎn)賴氨酸、亮氨酸、鳥氨酸、琥珀酸和透明質(zhì)酸等。本研究在Ala3-1菌株iolR基因位點整合了Psod啟動子驅(qū)動的glk1,減除iolT1轉(zhuǎn)錄阻遏的同時增強(qiáng)了葡萄糖激酶的表達(dá),得到菌株Ala4。搖瓶培養(yǎng)結(jié)果表面,菌株Ala4的生物量比Ala3-1顯著提高,恢復(fù)到ldhA敲除前(Ala2-3)的水平(圖3-a)。L-丙氨酸的產(chǎn)量也達(dá)到57.44 g/L,比Ala2-3提高4.6%(圖3-b)。

2.2.2 過表達(dá)PTS葡萄糖攝取途徑

由于增強(qiáng)非PTS葡萄糖攝取途徑顯著提高了細(xì)胞的生長和L-丙氨酸的產(chǎn)量,進(jìn)一步探索增強(qiáng)PTS系統(tǒng)的影響。為此,在菌株Ala4的基礎(chǔ)上整合了Ptrc啟動子驅(qū)動的ptsG基因,得到菌株Ala5,其L-丙氨酸產(chǎn)量進(jìn)一步提高到59.00 g/L(圖3-b)。

2.3 增強(qiáng)前體物丙酮酸的供應(yīng)

2.3.1 強(qiáng)化EMP途徑關(guān)鍵酶的表達(dá)

作為L-丙氨酸合成的直接前體物,增強(qiáng)丙酮酸的合成代謝流對L-丙氨酸的生產(chǎn)至關(guān)重要。在谷氨酸棒桿菌中,EMP途徑經(jīng)過10步反應(yīng)產(chǎn)生終產(chǎn)物丙酮酸。其中,甘油醛3-磷酸脫氫酶(gapA基因編碼)是EMP途徑唯一生成輔酶NADH的關(guān)鍵酶,KOGURE等[25]發(fā)現(xiàn)其催化的反應(yīng)為莽草酸生產(chǎn)的限速步驟,同時他們觀察到在利用非PTS攝糖的谷氨酸棒桿菌中,1,3-二羥基丙酮(1,3-dihydroxyacetone, DHA)和甘油作為主要副產(chǎn)物被積累。因此,在菌株Ala5的dphA(編碼DHAP磷酸酶,催化DHA的生成)位點整合了Ptuf啟動子驅(qū)動的gapA基因,得到菌株Ala6。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明,其L-丙氨酸產(chǎn)量比Ala5有小幅提高,達(dá)到60.45 g/L(圖4-a)。

a-基因組整合EMP和ED途徑關(guān)鍵基因;b-質(zhì)粒過表達(dá)不同來源ED途徑基因圖4 增強(qiáng)丙酮酸供應(yīng)對L-丙氨酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of enhancing pyruvate supply by overexpressing key genes in EMP and ED pathways on the production of L-alanine

2.3.2 引入ED途徑

由于EMP途徑步驟多,強(qiáng)化糖酵解反應(yīng)的代謝流相對較為困難。一些微生物天然具有一條替代糖分解途徑:ED途徑,其只經(jīng)過4步反應(yīng)即可產(chǎn)生丙酮酸。ED途徑的關(guān)鍵酶包括6-磷酸葡糖酸脫水酶(edd基因編碼)和2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸醛縮酶(eda基因編碼)[26],關(guān)鍵步驟是2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡糖酸裂解為丙酮酸和3-磷酸甘油醛,其中3-磷酸甘油醛會繼續(xù)通過EMP途徑生成丙酮酸。近年來,已有報道在谷氨酸棒桿菌中引入ED途徑能夠促進(jìn)葡萄糖消耗和乙醇、異丁醇等的生產(chǎn)[27-28]。

擬通過引入ED途徑來促進(jìn)丙酮酸的供應(yīng)和提高L-丙氨酸的生產(chǎn)。首先,在菌株Ala2-3的基礎(chǔ)上,引入過表達(dá)來源于大腸桿菌、需鈉弧菌和野油菜黃單胞菌eddeda操縱子的質(zhì)粒,菌株分別命名為Ala7-2、Ala7-3和Ala7-4,攜帶pXtuf空質(zhì)粒的菌株為Ala7-1。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明,過表達(dá)ED途徑菌株的L-丙氨酸產(chǎn)量均有提高,其中Ala7-2產(chǎn)量最高,達(dá)到65.84 g/L(圖4-b),說明表達(dá)大腸桿菌eddeda操縱子的效果最佳。于是將大腸桿菌eddeda操縱子整合到Ala6基因組上,獲得菌株Ala7。其搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生64.31 g/LL-丙氨酸,比Ala6產(chǎn)量提高6.4%(圖4-a)。

2.4 工程菌株5 L發(fā)酵罐發(fā)酵測試

將菌株Ala7進(jìn)行5 L發(fā)酵罐發(fā)酵,L-丙氨酸產(chǎn)量幾乎呈線性增長趨勢,在48 h達(dá)到104 g/L,最大OD值接近300(圖5)。發(fā)酵液中基本檢測不到其他氨基酸和有機(jī)酸(乙酸、乳酸和琥珀酸)。

3 結(jié)論

本文以具有鏈霉素抗性的野生型谷氨酸棒桿菌ATCC 13032出發(fā),通過優(yōu)化和過表達(dá)外源丙氨酸脫氫酶,增強(qiáng)葡萄糖攝取途徑,引入ED途徑強(qiáng)化前體物丙酮酸的供應(yīng),最終獲得高產(chǎn)L-丙氨酸的工程菌株。該菌株不含質(zhì)粒、遺傳穩(wěn)定、生長良好。5 L發(fā)酵罐測試L-丙氨酸產(chǎn)量達(dá)到104 g/L,且檢測不到有明顯副產(chǎn)物積累,為高純度L-丙氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)的非PTS葡萄糖攝取途徑可以顯著提高谷氨酸棒桿菌的細(xì)胞生長,引入ED途徑可以有效促進(jìn)丙酮酸供應(yīng)和L-丙氨酸合成,為谷氨酸棒桿菌其他代謝工程研究提供了參考。