離子色譜-脈沖積分安培法同時測定甘薯中10 種可溶性糖組分

石彩玲，田 俠，孫一鳴，劉慶

（青島農業(yè)大學資源與環(huán)境學院 山東青島 266109）

甘薯【Ipomoea batatas（L.）Lam.】含有 豐富的淀粉、可溶性糖、維生素和礦質元素等，是一種兼具營養(yǎng)和保健功能的農產(chǎn)品[1]，可加工成薯片、薯條或經(jīng)蒸、煮、烤后直接食用。甘薯中可溶性糖的組成及含量是影響其甜度、黏度、薯香味等食味指標的重要因子[2-3]，常作為評價甘薯食味品質和加工性能的重要指標[4]。由于受測試方法所限，研究者僅對其中的葡萄糖、果糖、蔗糖等含量較高的糖分有較為詳細的分析，而對含量相對較低的其它單糖或低聚糖并未關注[5-6]，然而，這些糖組分對甘薯保健功能的發(fā)揮同樣具有重要作用[7-8]。

目前可溶性糖含量的測定方法主要有分光光度法、毛細管電泳法、氣相色譜法、液相色譜法、離子色譜法等[9-14]。比色法測定樣品的可溶性總糖含量，無法對可溶性糖分的組成進行測定[15]；毛細管電泳法則需要對糖類進行衍生后才能通過紫外吸收進行測定，由于糖類的紫外吸收一般較弱，因此該方法測定的精度沒有保證[16]；由于糖類的揮發(fā)性差，利用氣相色譜法同樣需經(jīng)過衍生后才能實現(xiàn)色譜分離，操作步驟繁瑣且精度不高[17]；液相色譜法雖然不需衍生，但是常規(guī)的液相色譜一般選用蒸發(fā)光散射檢測器或示差折光檢測器檢測，檢出限高，對一些含量偏低的糖組分無法檢出[13]；離子色譜可利用其陰離子交換色譜柱對可溶性糖組分進行分離，無需衍生，并且離子色譜法還搭配了脈沖安培檢測器進行檢測，方法的靈敏度高，可實現(xiàn)對較低含量糖組分的定量檢測[18]。然而，對甘薯來講，由于其營養(yǎng)成分復雜，加之不同糖組分在提取液中的溶解性差別較大，導致測定過程中干擾較多，影響測試精度。

在總結前人經(jīng)驗及存在問題的基礎上，針對甘薯塊根中基質組成的特點，本文采用80%乙醇水溶液超聲振蕩提取其中可溶性糖組分，通過活化的RP 柱去除疏水有機物雜質，最后采用離子色譜-脈沖積分安培檢測法（IC-PAD）對提取液中10種可溶性糖組分進行同時測定。

1 材料與方法

1.1 設備與材料

ICS-5000 離子色譜儀，美國Thermo Dionex公司；Carbo Pac PA20 色譜柱和保護柱，美國Thermo Dionex 公司；RP 前處理柱，美國Thermo Dionex 公司；Milli-Q 超純水機，美國Millipore公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，天津萊玻特瑞公司；冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

10 種糖（葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、棉子糖和水蘇糖）標準品，Sigma 公司。甘薯樣品取自青島農業(yè)大學現(xiàn)代農業(yè)高科技示范園（膠州）試驗基地。

1.2 標準溶液配制

分別稱取10 種糖標準品各100 mg 于三角瓶中，加適量水溶解后無損轉移至100.0 mL 容量瓶并定容至刻度，配制成質量濃度為1 000 mg/L 的單一標準儲備液。使用前根據(jù)需要用超純水稀釋配制成不同質量濃度的混合標準液。

1.3 儀器配置與色譜條件

Carbo Pac PA20（3 mm×150 mm）陰離子交換色譜柱和Carbo Pac PA20（3 mm×50 mm）保護柱，RP 前處理 柱。流動相：18.2 MΩ 超純水、250 mmol/L NaOH、1.0 mol/L CH3COONa。樣品進樣體積10 μL，柱溫30 ℃，ED5000 脈沖安培檢測器，AS-AP 自動進樣器，Au 工作電極，糖測定標準四電位波形。色譜柱梯度淋洗分離程序如表1?；旌蠘藴室焊骺扇苄蕴墙M分譜圖見圖1。

圖1 10 種糖組分混合標準液譜圖Fig.1 Spectrogram of mixed standard solution of 10 soluble sugar constituents

表1 離子色譜梯度淋洗分離程序Table 1 Gradient conditions of ion chromatography column

1.4 提取液制備

隨機選擇形狀類似紡錘形、質量為400 g 左右薯塊5 個，去皮切絲后，分別放入105 ℃鼓風烘箱和冷凍干燥機干燥至恒重，磨細過篩后備用。取不同干燥方式的樣品各0.5 g（精確至0.0001 g），分別置于50 mL 離心管中，加入40 mL 80%的乙醇水溶液（乙醇∶水=8∶2），超聲萃取60 min 后（超聲時加自來水循環(huán)控制水溫不超過15 ℃），再放入振蕩器繼續(xù)振蕩提取2 h，放置澄清。取上清液2 mL 于冷凍離心機中10 000 r/min 冷凍離心5 min，取1 mL 上清液用超純水稀釋100 倍，取一定量的溶液過0.22 μm 濾膜及已活化的RP 柱，棄去前約0.5 mL 樣品，收集后續(xù)樣品上機測定其中葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、蔗糖、麥芽糖、棉子糖和水蘇糖等不同組分含量。每個樣品做3 次重復。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010 進行數(shù)據(jù)整理和圖表繪制。利用DPS14.0 軟件進行統(tǒng)計分析，用Duncan 法進行平均數(shù)間的顯著性檢驗，顯著性水平取P<0.05。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

本試驗中采用80%乙醇水溶液提取樣品中的可溶性糖組分，主要因為甘薯中淀粉含量相對較高，若單純用超純水提取，容易造成樣品中的其它基質成分溶解過多對測定干擾過大[19]；同時，還可以減少提取過程中淀粉的水解。而采用超聲+振蕩提取則可提高提取效果，并且在超聲過程中控制水溫在15 ℃，主要是為防止超聲過程易使溫度升高，而溫度的升高會增加淀粉酶的活性，加速樣品中淀粉分解為可溶性糖[20]，給試驗結果帶來誤差。為此，本試驗在超聲提取過程中，通過接入循環(huán)水以控制水溫，以降低淀粉酶活性，減少淀粉水解給試驗帶來的誤差。采用超聲+振蕩方式進行提取，確保對樣品中可溶性糖組分提取更加完全，增加測定結果的準確性。

2.2 色譜柱選擇和淋洗條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱選擇 目前用于小分子可溶性糖分離的陰離子交換色譜柱有：CarboPac MA1、CarboPac PA1、CarboPac PA10 和CarboPac PA20。根據(jù)各色譜柱在分離不同糖組分時的特點，本試驗選擇使用CarboPac PA20 色譜柱對各糖組分進行分離。主要因為CarboPac PA20 色譜柱延續(xù)了CarboPac 型色譜柱的特點，采用無孔基球附聚雙官能季銨功能基填料，柱容量較低，分離速度快，分離效果好[21]。而CarboPac MA1 色譜柱因柱容量偏大，對溶劑消耗量大，且各成分保留時間延長，在對可溶性糖各組分分離時效率低，而更適合于弱電離的糖醇類化合物的檢測[17]；CarboPac PA1色譜柱基質粒徑較大，柱效低，且其在弱堿性條件下工作時，存在較為明顯的溶解氧負峰干擾，降低了各糖組分檢測的靈敏度[17]；CarboPac PA10 色譜柱雖然克服了CarboPac PA1 存在的問題，在不同濃度的OH-1濃度下均具有較高的靈敏度，但其柱效仍低于CarboPac PA20[17]。

2.2.2 淋洗條件優(yōu)化 糖類分子具有電化學活性，在OH－存在的條件下，它們會部分或全部以陰離子形式存在，可以在陰離子交換色譜柱上實現(xiàn)分離[22]。此時，淋洗液中的OH－有兩個作用：一是作為淋洗離子，OH－濃度增大，糖在色譜柱上的保留時間縮短，二是提供糖解離所需的堿性環(huán)境，OH－濃度增大，糖分子的離子化程度提高，其在色譜柱上的保留時間延長。因此，糖分在色譜柱中的保留時間是上述兩種作用共同影響的結果[23]。因此，本試驗在對甘薯中10 種可溶性糖組分進行分離時，選用NaOH 和NaOAc 組合淋洗液進行梯度淋洗，在開始的前30 min 采用逐漸增加NaOH 溶液濃度、30～35 min 采用氫氧化鈉和乙酸鈉組合溶液進行梯度洗脫，不僅可以有效提高各糖組分的分離效果，同時可以提高響應的靈敏度。

2.3 色譜柱柱溫和淋洗液流速

色譜柱溫度主要通過影響柱內填料的活性，影響系統(tǒng)壓力從而影響色譜峰的分離效果[24]。由于多數(shù)單糖和低聚糖均為具有極性帶電物質，它們與色譜柱的作用力主要是庫侖力[25]，因此，溫度對其分離效果影響不大。淋洗液流速主要通過改變各成分在分離柱中的保留時間，從而影響分離效果。流速越低保留時間越長，流速越高分離度越差[26]。根據(jù)以往經(jīng)驗，選擇色譜柱溫30 ℃，淋洗液流速0.4 mL/min，既保證色譜峰峰形，又能保證較好的分離效果。

2.4 標準曲線、精密度與檢出限

配制了質量濃度為100 mg/L 的10 種糖組分的混合標準溶液，并分別稀釋其濃度至0.02～20 mg/L 的10 個濃度的標準系列，利用以上選定的方法對混合標準液進行離子色譜分析，并利用10種糖的峰面積（y）與其相應的濃度（x）之間關系進行線性擬合，得到10 種糖分濃度與峰面積之間的線性方程，其線性相關系數(shù)在0.9904～0.9987 之間。然后，取1 mg/L 的混合標準液樣品，利用以上選定的方法重復測定5 次，計算出平行樣品間的相對標準偏差在0.57%～1.89%之間。然后，根據(jù)3倍信噪比分別計算出10 種糖的檢出限為16.73～57.96 μg/L。以上所有測試結果見表2。從以上試驗結果可以看出，本方法測定結果重現(xiàn)性好、精密度高，線性范圍和檢出限均滿足樣品檢測需求。

表2 標準曲線的線性范圍、檢出限Table 2 Linear range，limits of detection for every soluble sugar

2.5 回收率與實際樣品測定

選擇105 ℃下鼓風烘干的甘薯樣品提取液，向待測液樣品中添加2.0 mg/L 的標準溶液，和待測樣品一起利用選定的方法進行測定，檢測甘薯樣品中各種可溶性糖組分的含量。并根據(jù)原樣品中各糖組分濃度、添加濃度和添加后的測定濃度計算回收率，結果見表3。從表3 可以看出，樣品中不同糖組分的回收率在94.5%～106.5%之間。

表3 回收率與樣品測試結果Table 3 Recovery and results of real samples

從實際樣品測定結果看，熱風干燥處理的各可溶性糖組分及其總量均高于冷凍干燥處理，葡萄糖、果糖和蔗糖在兩種干燥方式樣品中含量均較高，而熱風干燥樣品中麥芽糖含量為冷凍干燥樣品中的12.9 倍，說明熱風干燥過程使淀粉酶活性提高從而促進淀粉分解成麥芽糖。另外，在熱風干燥樣品中還檢測出冷凍干燥樣品未檢出的棉子糖和水蘇糖，說明這兩種糖分可能并非在甘薯生產(chǎn)中形成，而是樣品干燥處理過程中由其它糖分轉化而來。

3 結論

本研究建立了低溫超聲振蕩提取、離子色譜-脈沖積分安培檢測（IC-PAD）同時測定甘薯中10種可溶性糖組分的方法。結果表明，樣品經(jīng)80%的乙醇水溶液低溫超聲振蕩提取，不僅提高了提取效率，還降低了雜質溶出率。再經(jīng)濾膜過濾和RP柱凈化，極大的減少了色譜分離時的雜質干擾。通過調節(jié)淋洗液組合濃度、柱溫和淋洗液流速，使不同糖組分實現(xiàn)良好分離，且可保證在35 min 內完成10 種糖的分離測定。經(jīng)對標準曲線系列樣品的多次重復測定和加標回收率計算，6 種單糖線性范圍為0.02～10 mg/L，其它4 種糖線性范圍為0.02～20 mg/L。10 種糖組分加標回收率94.5%～106.5%，相對標準偏差0.57%～1.89%。本方法線性范圍廣、操作簡單、分析速度快、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于對甘薯提取液中多種可溶性糖組分的同時測定。

樣品測定結果表明，熱風干燥處理可使甘薯樣品可溶性糖含量增加，尤其是麥芽糖增加最為明顯。另外，熱風干燥還可以促進棉子糖和水蘇糖的生成，由于這兩種功能性低聚糖在冷凍干燥樣品中并未檢出，因此推斷其并非在甘薯生長過程中合成，而是在熱風干燥過程中由其它糖分轉化而來。