短鏈脂肪酸氣相色譜-質(zhì)譜測定方法的建立

卜子晨，鄭詩琪，王 佳，夏永軍，艾連中，王光強

（上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院 上海食品微生物工程技術(shù)研究中心 上海 200093）

短鏈脂肪酸（SCFA）是腸道微生物的重要代謝產(chǎn)物。它們主要由厭氧微生物的多糖、寡糖、蛋白質(zhì)、多肽和糖蛋白前體形成[1]。短鏈脂肪酸是飽和脂肪酸的一個子集，含有6 個或更少的碳分子，包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸[2]。在人體中，乙酸、丙酸和丁酸是腸道發(fā)酵產(chǎn)生的3 種主要短鏈脂肪酸，占腸道短鏈脂肪酸含量的95%，宿主產(chǎn)生短鏈脂肪酸的主要部位是結(jié)腸和盲腸[3]。其中SCFAs 的濃度在近端結(jié)腸較高，在遠端結(jié)腸較低。SCFAs 參與人體代謝，在肝臟、骨骼肌、脂肪組織和胰島等不同器官中具有重要功能，可以直接影響碳水化合物代謝和脂質(zhì)利用，并通過副交感神經(jīng)系統(tǒng)間接調(diào)節(jié)能量代謝[4]。SCFAs 被報道可以緩解肥胖、糖尿病，抑制炎癥和腫瘤細胞生長[5-7]。近年SCFAs 的測量已被用于研究許多疾病。糞便標本是研究SCFAs 濃度與疾病之間相關(guān)性的最常用標本，它能夠反映結(jié)腸中SCFAs 的產(chǎn)生與吸收之間的平衡[8]。為了分析飲食、腸道微生物群和宿主健康之間的關(guān)系，需要可靠、方便、靈敏的方法來準確測定短鏈脂肪酸的含量。

生物樣品中SCFAs 的分析方法多種多樣，其中包括高效液相色譜（HPLC）聯(lián)合紫外檢測[9]、固相微萃取氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（SPME-GCMS）[10]、核磁共振（NMR）[11]、毛細管電泳（CE）[12]等。由于SCFAs 具有較強的揮發(fā)性，在所有用于測定短鏈脂肪酸的設(shè)備中，氣相色譜是最廣泛用于短鏈脂肪酸分析的設(shè)備，并且與質(zhì)譜聯(lián)用具有更好的靈敏度和選擇性[13]。然而，直接進樣分析回收率較低，并存在雜質(zhì)污染氣相色譜柱的現(xiàn)象[14]。由于丙酸峰面積比較小，因此直接進樣也很難使其明顯出峰。為了提高檢測靈敏度和對柱子較少的損害，衍生化方法是更好的選擇。由于揮發(fā)性酸物質(zhì)較難檢測，且峰很難分離，因此硅烷化方法是氣相色譜分離揮發(fā)性酸的一種常用方法。硅烷化試劑有很多種，其中N，O-雙（三甲基硅基）乙酰胺（BSA）、N，O-雙（三甲基硅基）-三氟乙酰胺（BSTFA）和N-甲基-N-（三甲基硅基）-三氟乙酰胺（MSTFA）是GC/MS 分析中最常用的試劑[15]。這些衍生化劑通過三甲基硅基取代酸、醇、硫醇、胺、酰胺、酮和醛中的活性氫，與生物有機分子具有良好而廣泛的反應(yīng)活性[16]。相比較而言，很少用BSA 來檢測揮發(fā)性較強或分子質(zhì)量很低的化合物，而BSTFA 雖與BSA 相似，但由它生成的副產(chǎn)物揮發(fā)性優(yōu)于BSA，且更容易與衍生物分離，從而達到更好的出峰效果。常規(guī)的硅烷化試劑在檢測器中能形成SiO2，污染指數(shù)高并且會增加基線的噪音，BSTFA 分子中含有3 個氟原子，在檢測過程中可使SiO2進一步轉(zhuǎn)化為SiF4，從而有效降低污染情況[17]。與MSTFA 相比，BSTFA 氯甲酸鹽運行時間更短，受空間位阻的影響更小，丁酸的分離效果更好，且操作時間較短，具有更好的衍生化效率和靈敏度[18]。最終選用GC-MS 聯(lián)合BSTFA 衍生化試劑，旨在建立一種可以高效定量分析短鏈脂肪酸的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境

SPF 級雌性C57BL/6 小鼠，購于南京模式動物有限公司。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境條件為溫度（23±2）℃、相對濕度控制在（50±5）%、12 h 光照和12 h 黑夜的環(huán)境中，自由取食、進水，適應(yīng)1 周后進行實驗。

1.2 材料與試劑

乙酸、丙酸、丁酸（純度≥99%）購自源葉生物；無水乙醚，鹽酸，均為分析級，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；N，O-三甲硅烷基三氟乙酰胺（BSTFA），無水Na2SO4，購自Sigma 公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

Thermo 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；漩渦振蕩儀；3-18K 型離心機，德國Sigma 公司；PL2002 型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；GT200 研磨儀，北京格瑞德曼儀器設(shè)備有限公司。

1.4 氣相色譜條件

色譜柱：TG-5MS 毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。初始溫度40 ℃，保持2 min，以15 ℃/min 升至150 ℃，保持1 min，再以30 ℃/min 升至300 ℃，保持5 min。進樣口溫度：260 ℃；載氣：氮氣（純度≥99.999%）；分流比：10∶1；柱流速：1 mL/min；進樣量：1 μL；溶劑延遲時間：3 min。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源：EI 源（70 eV）；離子源溫度：230 ℃。定性時掃描方式為全掃描（m/z 40～400），采集頻率為每秒12.8 次，定量時掃描方式為選擇性離子掃描，乙酸、丙酸、丁酸掃描離子為（m/z）：117，131，145。采用外標法計算短鏈脂肪酸的含量。

1.6 試驗方法

1.6.1 樣品前處理 小鼠排便后立即用鑷子收集糞便樣本0.05 g 左右并與500 μL 純水混合，用研磨儀快速研磨至形成勻漿狀態(tài)，然后低速振蕩30 min。隨后放入冷凍離心機13 000 r/min 的條件下離心30 min。將100 μL 的上清液轉(zhuǎn)移到離心管中，并加入10 μL 5 mol/L HCl 使糞便溶液pH 值在2 左右。酸化后的糞便勻漿加入100 μL 無水乙醚，漩渦振蕩混勻，10 000 r/min 的條件下離心5 min。取上清轉(zhuǎn)移至含無水Na2SO4的離心管中，從而去除多余水分。重復(fù)萃取2 次。

衍生化過程：將100 μL 無水乙醚層轉(zhuǎn)移至內(nèi)插管中，加入5 μL 的BSTFA，漩渦振蕩后保存在氣相小瓶中。70 ℃孵育20 min，37 ℃孵育2 h。最后將樣品上機處理。

1.6.2 回收率和精密度 將小鼠糞便樣品加入3種不同水平（10，50 和250 μmol/L）的混合SCFAs標準品，按上述方法衍生化并進行GC-MS 分析，計數(shù)出回收率。并采用相同濃度的糞便SCFAs 提取物測定精密度。

1.6.3 小鼠糞便、盲腸、結(jié)腸中SCFAs 的含量比較 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，收取0.05 g 左右糞便。脫頸椎處死后，分別取0.05 g 左右盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物。并為加入無菌水按上述衍生化方法處理。隨后對3 種SCFAs 進行含量測定和比例分布統(tǒng)計。

1.6.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 本試驗中得到的結(jié)果進行統(tǒng)計分析，利用Origin 9.0 軟件處理數(shù)據(jù)并作圖，采用SPSS 22.0 數(shù)據(jù)分析軟件進行顯著性差異分析。所有數(shù)據(jù)均用“平均值±標準差”（mean±SD）表示。P>0.05 無顯著性差異，P<0.05 有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

將3 種短鏈脂肪酸進樣后獲得各自的出峰時間，它們的出峰順序為乙酸、丙酸和丁酸。色譜圖見圖1，3 種SCFAs 的色譜峰得到很好的分離。根據(jù)峰面積，繪制出標準曲線，并以峰面積對不同濃度進行線性回歸，結(jié)果見表1。根據(jù)線性回歸方程和R2可知乙酸、丙酸、丁酸在25～400 μmol/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 不同SCFAs 線性關(guān)系考察Table 1 The linear relationship of different SCFAs

圖1 混合SCFAs 的GC-MS 色譜圖Fig.1 The chromatogram of mixed SCFAs

2.2 精密度

糞便樣品中SCFAs 分析方法精密度分析結(jié)果見表2。對同一糞便樣品進行5 次平行進樣測定，試驗結(jié)果顯示，峰面積和保留時間的RSD 均小于4%，表明儀器的精密度良好。

表2 精密度測定結(jié)果Table 2 The precision of the method for the determination of mixed SCFAs

2.3 回收率

糞便樣品 GC-MS 回收率分析結(jié)果見表3。對糞便樣品進行回收率試驗，按照上述色譜條件進行測試，結(jié)果顯示，加樣回收率達到了86%～96%之間，各組分加樣回收率的RSD 均小于4%，說明本試驗的分析條件下測定短鏈脂肪酸的方法可靠。

表3 添加不同含量SCFAs 的糞便樣本回收率測定結(jié)果Table 3 Determination results of fecal sample recovery with different SCFAs content

2.4 小鼠糞便、盲腸、結(jié)腸中SCFAs 的含量

體內(nèi)的腸道菌群通過發(fā)酵難以消化的碳水化合物來產(chǎn)生SCFAs，它們會顯著參與多種代謝功能，并且對機體系統(tǒng)產(chǎn)生有益的影響。SCFAs 不但可以調(diào)節(jié)肝臟中的脂肪生成和膽固醇生物合成等機制，并通過刺激腸道內(nèi)分泌細胞調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)[19]。因此本試驗通過對小鼠糞便的衍生化處理，來確定小鼠中SCFAs 的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過該GC-MS 方法均能檢測到乙酸、丙酸和丁酸的含量。由圖2a 的比例分布圖所示糞便中含量最多的就是乙酸，高達73.9%，其次是丙酸（17.6%）和丁酸（8.5%）。這樣的含量分布順序與之前報道的文獻基本吻合[20-21]。由圖2b 可知，SCFAs 在糞便、盲腸和結(jié)腸中均有分布。其中盲腸中SCFAs 最高，糞便次之，結(jié)腸中最少。且盲腸中的乙酸、丙酸、丁酸含量均與結(jié)腸有顯著性差異（P<0.05）。

圖2 SCFAs 占比和不同部位SCFAs 的含量Fig.2 Proportion of SCFAs and content of SCFAs in different parts

3 結(jié)論

本試驗中采用BSTFA 作為硅烷化試劑，可以有效解決SCFAs 分離效果差，揮發(fā)性太高從而不出峰等問題。利用無水乙醚作為廣泛提取SCFAs的常用試劑，結(jié)合無水硫酸鈉的使用可以更有效的把多余的水分去除，使得結(jié)果更準確，而且對機器的損傷也降到最低。從而建立了一種線性關(guān)系良好，回收率高，精密度達標的檢測SCFAs 的方法。并且該方法可以準確的測出糞便中乙酸、丙酸和丁酸這3 種最常見的SCFAs，沒有明顯的雜峰和干擾峰。并通過試驗檢測出小鼠腸道內(nèi)盲腸中SCFAs 含量最多，并且乙酸、丙酸和丁酸的分布情況是：乙酸＞丙酸＞丁酸。