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    肌苷對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長及生物膜形成的影響

    2023-11-26 09:28:04胡文靜劉小雪焦凌霞
    中國食品學(xué)報(bào) 2023年9期
    關(guān)鍵詞:肌苷環(huán)酸橙汁

    胡文靜,劉小雪,梁 棟,焦凌霞

    (河南科技學(xué)院食品學(xué)院 河南新鄉(xiāng) 453003)

    酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterristris)主要存在于酸性土壤及蘋果汁、番茄汁等酸性果汁中,是一種革蘭氏陽性細(xì)菌,具有嗜酸耐熱特性,好氧、無致病性,由該菌污染引起的果汁營養(yǎng)損失、風(fēng)味劣變、出現(xiàn)沉淀等質(zhì)量問題已成為制約果蔬加工及出口貿(mào)易的瓶頸[1-3]。據(jù)報(bào)道,35%的果汁產(chǎn)品變質(zhì)問題都是因酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌污染引起的。該菌在不利條件下可形成抗逆性極強(qiáng)的芽孢,條件適宜時(shí)芽孢便會(huì)萌發(fā)生長,產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚、2,6-二溴苯酚和2,6-二氯苯酚等代謝產(chǎn)物,散發(fā)出難聞氣味并引起產(chǎn)品沉淀,是果汁加工行業(yè)比較棘手的問題[4-6]。作為果汁產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵質(zhì)量因子,關(guān)于酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的控制研究已有30 多年。在已報(bào)道的滅菌方法中,物理法控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌污染的能源及經(jīng)濟(jì)消耗較大[7]。高溫處理是生產(chǎn)中常用的控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌污染的方法,熱處理雖具有殺菌時(shí)間短、滅菌效果好的優(yōu)點(diǎn),但對(duì)果汁的營養(yǎng)成分和感官品質(zhì)破壞嚴(yán)重[8]。新型滅菌技術(shù)中超高壓滅菌法對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的殺滅效果較好,能較好地保存果汁產(chǎn)品的營養(yǎng)成分,然而對(duì)儀器的要求較高,經(jīng)濟(jì)耗費(fèi)較大[9]。化學(xué)法對(duì)抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌也有一定的效果,生產(chǎn)上常用苯甲酸、亞氯酸、次氯酸鈉等來抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌,然而苯甲酸含有刺激性氣味,會(huì)影響果汁口感,亞氯酸在室溫下不穩(wěn)定,極易分解,在使用過程中對(duì)操作技術(shù)的要求較高[10-11]。隨著人們健康意識(shí)的增強(qiáng),具有抑菌性能的天然物質(zhì)及其衍生物逐漸被開發(fā)并應(yīng)用到食品工業(yè)中[12]。有研究報(bào)道天然化合物如石榴提取物、葡萄籽提取物、胡椒提取物等對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌有一定的抑菌效果,但多數(shù)植物提取物含有葉綠素、花色素、黃酮類色素等或者具有不良?xì)馕兜膿]發(fā)性氣體,而且達(dá)到生產(chǎn)要求的抑菌效果的使用劑量較大,往往會(huì)影響產(chǎn)品的色澤、口感及風(fēng)味等感官品質(zhì)[13]。因此,果汁工業(yè)急需開創(chuàng)新型高效的有利于保存果汁營養(yǎng)成分的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌控制技術(shù)。

    肌苷,又稱次黃苷,屬于人體的正常成分,無色、無味,目前常用于食品加工和制藥行業(yè)[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn),肌苷可以促進(jìn)細(xì)菌芽孢的復(fù)蘇,對(duì)蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌的芽孢復(fù)蘇均有促進(jìn)的效果[16-17]。然而,課題組在研究肌苷對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢萌發(fā)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),它不僅不能促進(jìn)該菌芽孢的萌發(fā),反而能延緩其芽孢萌發(fā)并導(dǎo)致萌發(fā)后的營養(yǎng)菌體死亡。鑒于酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌具有獨(dú)特的嗜酸耐熱生理特性,推測(cè)肌苷在酸性條件下對(duì)該菌可能有特異性抑菌作用。本文通過測(cè)定肌苷處理前、后的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長和生存情況,形態(tài)變化及生物膜形成能力來檢測(cè)肌苷對(duì)該菌的抑制效果,研究較好抑菌效果的肌苷添加量對(duì)橙汁酸度、糖度、色度及口感的影響,為開發(fā)控制酸性果蔬制品中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌污染的新型綠色高效抑菌劑提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterristris DSM 3922T),購于德國菌種保藏中心;肌苷、戊二醛、無水乙醇均為分析純,天津市德恩化學(xué)試劑有限公司;橙子為市售鮮果。

    ZQTY-70F 全溫振蕩培養(yǎng)箱,常州普天儀器制造有限公司;TGL-16B 臺(tái)式高速離心機(jī),湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司;ES-315 全自動(dòng)高壓滅菌器,上海民儀電子有限公司;H1987 手持糖度折光儀,邢臺(tái)德延科技有限公司;CR400 便攜式色差儀,深圳市百誠欣電子科技有限公司;環(huán)境掃描電子顯微鏡,北京普瑞賽司有限公司;Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀,賽默飛世爾科技公司;MJBL80Y21 美的榨汁機(jī),河南省萱格商貿(mào)有限公司。

    1.2 培養(yǎng)基的制備

    AAM 液體培養(yǎng)基:葡萄糖2.0 g,酵母浸粉2.0 g,氯化鈣0.38 g,磷酸二氫鉀1.2 g,七水硫酸鎂1.0 g,一水硫酸錳0.38 g,硫酸銨0.4 g,加滅菌水定容至1 L,調(diào)pH 值至4.0,121 ℃高壓滅菌15 min;

    AAM 固體培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.5%~1.8%的瓊脂。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 菌株培養(yǎng)條件 將冷凍保藏的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌接種于AAM 液體培養(yǎng)基中,在45 ℃、250 r/min 條件下活化培養(yǎng)12 h,然后按1%接種量再轉(zhuǎn)接至AAM 培養(yǎng)基中,45 ℃、250 r/min 振蕩培養(yǎng)。

    1.3.2 光密度法測(cè)定酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長曲線 將活化12 h 的菌液按1%的接種量分別接種于含肌苷濃度為0,1,5,10,20,30 mmol/L 的AAM液體培養(yǎng)基中,45 ℃、250 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h,每2 h 測(cè)定一次菌液吸光值(OD600nm)。以時(shí)間為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),制作不同濃度肌苷處理下酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長曲線。

    1.3.3 結(jié)晶紫染色法測(cè)定生物膜形成量 根據(jù)朱軍莉等[18]采用的96 孔板定量法,取20 μL 106CFU/mL 菌懸液置于96 孔板中,每孔分別加入200 μL 含0,1,5,10,20,30 mmol/L 肌苷濃度的AAM 培養(yǎng)液。然后將96 孔板置于45 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h,使細(xì)菌完全附著在孔板表面。培養(yǎng)結(jié)束后,每孔中加入0.01 mol/L 的無菌PBS 緩沖液清洗3 次。待96 孔板風(fēng)干后,加入無水甲醇固定15 min,棄去孔中廢液后風(fēng)干。然后加入1%的結(jié)晶紫溶液,置于室溫下染色15 min 后,用流動(dòng)去離子水洗去孔板中殘余的結(jié)晶紫染料后風(fēng)干,再加入200 μL 33%的冰乙酸溶液進(jìn)行脫色。脫色完成后,用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的OD600nm值,分析生物被膜形成量。

    1.3.4 環(huán)境掃描電子顯微鏡檢測(cè)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌形態(tài) 根據(jù)潘旭遲等[19]描述的方法,將活化至對(duì)數(shù)期的菌液以1%接種量分別加入肌苷濃度為0 mmol/L 和5 mmol/L 的培養(yǎng)液中,45 ℃、250 r/min 振蕩培養(yǎng),分別取培養(yǎng)6,12,18,24 h 的菌液,離心收集菌體,用預(yù)冷的無菌水反復(fù)清洗3~5 次,加入體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液,置于4 ℃環(huán)境下固定2 h 以上。將固定好的樣品用預(yù)冷的無菌水反復(fù)清洗后,利用35%,50%,70%,80%,90%和100%體積分?jǐn)?shù)的乙醇進(jìn)行梯度脫水后再用無水乙醇重懸。取適量菌懸液滴加于玻片上,自然風(fēng)干后噴金,利用環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)。

    1.3.5 平板計(jì)數(shù)法測(cè)定酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生存情況 將菌體濃度為107CFU/mL 的菌液分別接種至含0,1,5,10,20,30 mmol/L 濃度肌苷的AAM培養(yǎng)液中,調(diào)整該菌液的初始菌濃度分別為105CFU/mL 和106CFU/mL,45 ℃,250 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)72 h。每6 h 取100 μL 菌液梯度稀釋后涂布于AAM 固體平板上,45 ℃,倒置培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),檢測(cè)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的存活情況。

    1.3.6 鮮榨橙汁制備 選取成熟、飽滿的新鮮橙子,清洗干凈后加入適量純水,使用榨汁機(jī)制汁,用干凈的紗布過濾3~4 次,90 ℃,5 min 殺菌備用。

    3.播種田間濕度 田間土壤持水量為70%—80%播種最佳,即田間土壤能手捏成團(tuán),但不能擠壓出水。如果田間土壤含水量大,則播種后不急于蓋膜,待田間土壤水分適當(dāng)蒸發(fā)后再蓋膜。如果田間土壤干燥,則播種后每窩適當(dāng)灌水0.3—0.5公斤左右后再蓋膜。

    1.3.7 果汁理化指標(biāo)測(cè)定 在鮮榨橙汁中分別加入終濃度為0,1,5,10,20,30 mmol/L 的肌苷,按照鄧紅等[20]所述檢測(cè)方法,利用pH 儀、手持式糖度折光儀、便攜式色差儀測(cè)定橙汁的酸度、糖度(可溶性固形物含量,TSS)、顏色參數(shù)等理化指標(biāo)。樣品總色差計(jì)算公式為:

    式中L*代表明暗度,a*代表紅綠色值,b*代表黃藍(lán)色值。

    1.3.8 果汁感官評(píng)定 參考崔燕等[21]對(duì)果汁感官鑒定的方法,制訂表1 中鮮榨橙汁的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),選擇10 名食品專業(yè)的學(xué)生分別從氣味、色澤、口感、狀態(tài)4 個(gè)方面對(duì)橙汁進(jìn)行感官評(píng)價(jià),總分為100分。

    表1 鮮榨橙汁的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory scoring standard for fresh orange juice

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    所有試驗(yàn)重復(fù)3 次,采用Origin9.0 進(jìn)行繪圖,運(yùn)用SPSS 23 軟件Duncan 進(jìn)行方差分析(ANOVA)(P<0.05),試驗(yàn)結(jié)果以表示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 肌苷對(duì)低濃度的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的抑制效果

    將過夜活化的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌以1%接種量接種于含不同濃度肌苷的AAM 液體培養(yǎng)基中,經(jīng)平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定,菌液的初始菌體濃度為104CFU/mL。如圖1 所示,在不含肌苷的對(duì)照組AAM 培養(yǎng)液中,酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長良好,培養(yǎng)2 h 后開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期,培養(yǎng)至12 h 時(shí)菌體密度最高,OD600nm值達(dá)到1.36,12 h 后菌體密度略有下降,菌株生長進(jìn)入穩(wěn)定期,培養(yǎng)24 h 時(shí)其OD600nm值為1.057,這和課題組前期研究中測(cè)定的同一培養(yǎng)條件下的生長曲線保持一致[22]。在含1 mmol/L 肌苷的AAM 培養(yǎng)液中,菌體生長稍慢,培養(yǎng)至12 h 時(shí),菌體密度最高,OD600nm值僅為0.57,是對(duì)照組的0.42 倍。培養(yǎng)24 h 后,菌體的OD600nm值為0.342,是對(duì)照組的0.32 倍。培養(yǎng)液中肌苷濃度升至5 mmol/L 時(shí),酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長明顯被抑制,培養(yǎng)12 h 時(shí)的菌液OD600nm值僅為0.40,是對(duì)照組的0.29 倍。培養(yǎng)至24 h,菌液OD600nm值降至0.17,是對(duì)照組的0.16 倍。隨著肌苷濃度的繼續(xù)增加,對(duì)該菌的抑制效果也有所增強(qiáng)。肌苷濃度分別為10,20,30 mmol/L 的AAM 培養(yǎng)液中,菌液最高OD600nm值分別為0.337,0.328 和0.315。表明肌苷濃度高于5 mmol/L 時(shí),抑菌效果并沒有明顯提升。因此,對(duì)初始污染菌含量不高于104CFU/mL 時(shí),5 mmol/L 的肌苷濃度即能達(dá)到較好的抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長繁殖的效果。

    圖1 酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌在添加不同濃度肌苷的AAM 培養(yǎng)液中的生長曲線Fig.1 Growth curve of A.acidoterristris in AAM medium with different concentrations of inosine

    2.2 肌苷對(duì)高初始菌體濃度的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的抑制效果

    實(shí)際生產(chǎn)上常用的抑菌劑在產(chǎn)品初始污染菌含量高時(shí)便會(huì)失去防腐效果。為檢測(cè)肌苷對(duì)高初始菌體濃度的抑制效果,本文檢測(cè)了初始菌體濃度分別為105CFU/mL 和106CFU/mL 的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌在不同濃度肌苷作用下的存活情況。如圖2a 所示,初始菌體濃度為105CFU/mL 的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌營養(yǎng)菌體在不含肌苷的培養(yǎng)液中,隨培養(yǎng)時(shí)間延長,菌落數(shù)也穩(wěn)定增長,12 h 后達(dá)到最高,為7.41 lg(CFU/mL)。在1 mmol/L 肌苷培養(yǎng)液中,培養(yǎng)初期,菌落數(shù)呈上升趨勢(shì),作用12 h 后,菌體數(shù)量逐漸下降,最高菌落數(shù)達(dá)6.9 lg(CFU/mL)。隨著肌苷濃度增大,菌體生長受到了明顯的抑制,在5,10,20,30 mmol/L 的肌苷培養(yǎng)液中,最高菌落數(shù)分別為4.53,4.30,4.20,4.17 lg(CFU/mL),與初始菌體量相比,菌體數(shù)量下降了1個(gè)數(shù)量級(jí)。

    圖2 肌苷對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌體的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of inosine on A.acidoterristris

    當(dāng)初始菌體密度為106CFU/mL 時(shí),在不含肌苷的培養(yǎng)液中,菌落數(shù)最高可達(dá)7.49 lg(CFU/mL)。在含在1,5,10,20,30 mmol/L 的肌苷培養(yǎng)液中,菌落數(shù)最高分別為6.94,6.10,6.03,5.82,5.66 lg(CFU/mL),與初始菌體量相比,菌體數(shù)量沒有增加。結(jié)果表明,5 mmol/L 的肌苷濃度在初始污染菌含量高達(dá)105CFU/mL 和106CFU/mL 時(shí),仍具有較好的抑菌效果。

    2.3 肌苷對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌體形態(tài)的影響

    掃描電子顯微鏡檢測(cè)結(jié)果如圖3 所示,不添加肌苷的對(duì)照組的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌在培養(yǎng)至6 h 時(shí),菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)完整,表面光滑飽滿,菌體呈長桿狀,處于分裂增殖階段;12 h 時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期,菌體呈正常的桿狀;18 h 時(shí),菌體頂端膨大,大部分菌體變短變圓,開始形成芽孢;24 h 時(shí),絕大部分營養(yǎng)菌體已形成芽孢。5 mmol/L 肌苷處理的試驗(yàn)組中,肌苷作用6 h 時(shí),與同時(shí)段對(duì)照組的菌體形態(tài)相比,菌體形態(tài)較完整,飽滿度稍差,但也存在分裂增殖現(xiàn)象;作用12 h 時(shí),大部分菌體細(xì)胞壁受損,表面凹陷;作用時(shí)間增至18 h 和24 h 時(shí),細(xì)胞壁受損加重,菌體干癟皺縮,表面粗糙,出現(xiàn)嚴(yán)重的破裂和孔洞,而且菌體顏色逐漸加深,可能是由于細(xì)胞裂解、細(xì)胞內(nèi)容物泄露導(dǎo)致菌體的導(dǎo)電性降低造成的。結(jié)果表明,肌苷能夠破壞和損傷酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。

    2.4 肌苷對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生物膜形成的影響

    如圖4 所示,肌苷處理后,酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生物被膜形成量與對(duì)照組相比明顯降低(P<0.05)。隨著肌苷濃度的增加,生物被膜的含量逐漸減小。經(jīng)1,5,10,20,30 mmol/L 肌苷作用的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生物被膜形成量在OD600nm的吸光值 由0.57 分別下降至0.51,0.30,0.29,0.26和0.25,表明肌苷對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生物被膜的形成有顯著的抑制作用(P<0.05)。

    圖4 不同濃度肌苷處理酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌后生物膜的形成量Fig.4 Biofilm formation treated with different concentrations of inosine

    2.5 肌苷對(duì)橙汁理化特性及感官品質(zhì)的影響

    果汁的酸度、糖度及色澤是影響果汁品質(zhì)的主要指標(biāo)。肌苷無色無味,推測(cè)其對(duì)果汁的品質(zhì)應(yīng)該不產(chǎn)生影響。經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)(表2),相同處理時(shí)間下肌苷添加量高低對(duì)橙汁的酸度、糖度(TSS 含量)及色澤均無顯著影響(P<0.05);但是隨著處理時(shí)間延長,不添加肌苷的對(duì)照組和添加不同濃度肌苷的試驗(yàn)組中,橙汁的糖度(TSS 含量)和L*值(明暗度)都有所增加。這可能是由于取樣測(cè)定過程中有空氣混入導(dǎo)致果汁營養(yǎng)成分發(fā)生氧化所致。在24 h 的肌苷處理過程中,添加不同肌苷濃度的橙汁的總色差(ΔE)最大值為1.86,一般ΔE>3 時(shí),才能肉眼觀察出顏色的變化[23]。因此,肌苷對(duì)橙汁色澤的影響是肉眼覺察不到的。在相同處理時(shí)間下,肌苷添加量低于5 mmol/L 的試驗(yàn)組果汁的酸度、糖度(TSS 含量)及色澤均與對(duì)照組無顯著差異(P<0.05)。

    表2 肌苷對(duì)橙汁理化特性的影響Table 2 Effects of inosine on physicochemical properties of orange juice

    感官鑒定可更直觀的分析果汁的品質(zhì)。由表3 可知,添加不同濃度肌苷的橙汁,在相同放置時(shí)間下,與不添加肌苷的對(duì)照組相比,果汁原有的香味、口感、色澤、狀態(tài)等均無明顯變化(P<0.05)。隨放置時(shí)間延長,果汁的口感和香味略有降低,可能由于取樣時(shí)的空氣混入導(dǎo)致橙汁中的醛類及酚類物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng),從而影響果汁的香氣和口感[24]。

    表3 添加不同肌苷濃度的橙汁的感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 3 Sensory evaluation of orange juice with different inosin concentration

    3 討論與結(jié)論

    酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌廣泛存在于自然界和土壤中,其菌體和芽孢可附著在水果表面,在加工過程中不可避免地會(huì)導(dǎo)致果汁生產(chǎn)設(shè)備和產(chǎn)品被污染。尤其是濃縮果汁生產(chǎn)中,一般會(huì)利用回收果汁濃縮時(shí)蒸發(fā)的水分清洗設(shè)備,由于回收的冷凝水溫度較高且呈微酸性,給酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長繁殖提供了良好的環(huán)境。該菌在設(shè)備表面能形成致密的生物被膜[25],形成生物被膜的細(xì)菌內(nèi)部有致密的三維空間結(jié)構(gòu),使細(xì)菌可以大量繁殖、擴(kuò)散,對(duì)環(huán)境的耐受性也增強(qiáng),導(dǎo)致其難以從加工設(shè)備的表面被清除[26]。因此,酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌往往通過污染生產(chǎn)設(shè)備、生產(chǎn)材料(加工水果)及半成品(濃縮果汁)等導(dǎo)致水果加工產(chǎn)品污染,對(duì)酸性果蔬產(chǎn)品的加工和保藏造成了嚴(yán)重危害,再加上該菌嗜酸耐熱的特性及其芽孢的高抗逆性,也對(duì)酸性果蔬制品的滅菌工藝提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。鑒于果蔬汁中熱敏性營養(yǎng)成分豐富,果汁加工中尤為重視殺菌工藝對(duì)果汁品質(zhì)的影響,如何采用溫和的方式控制該菌污染一直是食品殺菌領(lǐng)域亟待解決的問題。

    肌苷是芽孢桿菌屬細(xì)菌的細(xì)胞代謝產(chǎn)物,可用做食品、藥品和藥物中間體等,具有改善腎功能,加速肝細(xì)胞的修復(fù)等多種醫(yī)療和保健功能[27]。目前,與肌苷有關(guān)的細(xì)菌方面的研究一方面是肌苷生產(chǎn)細(xì)菌的選育,另一方面是對(duì)細(xì)菌芽孢萌發(fā)的促進(jìn)作用[28],尚無其抑制細(xì)菌生長繁殖的研究和報(bào)道。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),肌苷對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢萌發(fā)的作用與現(xiàn)有報(bào)道截然相反,不僅延緩該菌芽孢萌發(fā)且導(dǎo)致營養(yǎng)菌體死亡。由于酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌具有嗜酸耐熱的獨(dú)特生理特性,推測(cè)原因可能與該菌在酸性條件下具有特殊的代謝機(jī)制有關(guān)。大部分抑菌物質(zhì)主要從破壞胞內(nèi)蛋白和遺傳物質(zhì)、損傷菌體細(xì)胞壁及抑制呼吸這三方面來發(fā)揮作用[29]。本研究發(fā)現(xiàn),5 mmol/L濃度的肌苷就對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜具有明顯的損傷作用,并導(dǎo)致菌體死亡。肌苷作為細(xì)胞內(nèi)ATP、輔酶A、核糖核酸及脫氧核糖核酸的組成部分,能直接透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞,參與細(xì)胞的核酸代謝、物質(zhì)代謝和能量代謝,并參與蛋白質(zhì)的合成[30-31],因此,推測(cè)肌苷對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的破壞作用可能與肌苷進(jìn)入菌體后對(duì)該菌的正常代謝功能造成了影響,進(jìn)而導(dǎo)致菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜合成受到影響而死亡,其分子機(jī)制有待深入研究。有研究報(bào)道,在橙汁和非碳酸飲料中,當(dāng)該菌的菌體濃度達(dá)到105~106CFU/mL 時(shí),產(chǎn)生的愈創(chuàng)木酚量就能達(dá)到嗅覺的感官閾值[32]。本研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)初始污染菌含量高達(dá)105CFU/mL 和106CFU/mL 時(shí),5 mmol/L 的肌苷添加量仍能將105CFU/mL 的初始菌體的數(shù)量降低1 個(gè)數(shù)量級(jí),控制營養(yǎng)菌體的數(shù)量使之不能產(chǎn)生達(dá)到嗅覺閾值的愈創(chuàng)木酚量,抑制106CFU/mL的初始菌體數(shù)量不再增加,且對(duì)果汁的理化特性和感官品質(zhì)均無顯著影響。因此,鑒于肌苷對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌具有抑制芽孢萌發(fā)和低劑量高效抑殺營養(yǎng)菌體的雙重效果,不失為理想的控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌污染的高效綠色特異性抑菌劑。

    在檢測(cè)肌苷對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生物被膜形成能力的影響時(shí),發(fā)現(xiàn)較低濃度的肌苷便可對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生物被膜量發(fā)揮抑制作用。推測(cè)肌苷可能一方面抑制了酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長而影響其生物被膜的形成量[33],另一方面可能是由于肌苷影響了酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌細(xì)胞代謝,導(dǎo)致其胞外蛋白或多糖分泌減少,降低了菌體的黏附性,干擾了生物被膜的形成[34]。細(xì)菌的生物被膜形成力與多種因素有關(guān),如營養(yǎng)條件、環(huán)境等,因此肌苷對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生物膜形成的影響機(jī)制需要進(jìn)一步探討。菌體生物被膜含量的減少可以使菌體的活力以及抗性減弱[35],這為肌苷協(xié)同其它抑菌劑或殺菌技術(shù)發(fā)揮更好的控制該菌污染的作用提供了試驗(yàn)和理論依據(jù),肌苷有望成為酸性果汁生產(chǎn)中抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌污染的新型高效防腐殺菌劑。研究結(jié)果為開發(fā)能最大程度保存果汁營養(yǎng)成分和感官品質(zhì)的新型酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的控制技術(shù)提供了試驗(yàn)和理論依據(jù)。

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