未漂洗魚糜凍藏過程中晚期糖化終末產(chǎn)物形成及機(jī)制

李佳藝，蘇婕，王發(fā)祥*，李向紅，俞健，劉永樂

（1 長沙理工大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心 長沙410114 2 山東華宇工學(xué)院 山東德州 253034）

魚糜是一種基于魚肉凝膠的精加工魚類產(chǎn)品，由于營養(yǎng)好、味道鮮美、成本低和易于生產(chǎn)、儲存和運(yùn)輸?shù)忍攸c(diǎn)，因此在世界各地深受歡迎[1]。漂洗是傳統(tǒng)魚糜加工技術(shù)的重要工序，通過漂洗純化和濃縮魚肌纖維蛋白，使其具有良好的凝膠形成能力[2]。同時漂洗還可去除多余的脂肪、血液和色素，從而提高魚糜的感官質(zhì)量，并減緩其氧化劣變[3]。然而，漂洗過程不僅帶來額外的水消耗和廢物處理問題，還導(dǎo)致營養(yǎng)和風(fēng)味物質(zhì)的巨大損失[4]。此外，漂洗過程中丟失的水溶性蛋白質(zhì)對延緩魚糜冷凍收縮和蛋白質(zhì)交聯(lián)具有重要作用[5]。為解決這些問題，研究未漂洗魚糜成為一個替代方案，然而其加工技術(shù)目前在基礎(chǔ)理論研究和實(shí)際應(yīng)用中仍存在諸多問題，如凝膠形成能力較差，貯藏過程中易氧化劣變、潛在危害物形成等[6]，有待進(jìn)一步研究解決。

近年來，隨著淡水魚養(yǎng)殖產(chǎn)量的增加以及海洋漁業(yè)資源的不斷減少，淡水魚逐漸成為魚糜加工的主要原料之一。鰱魚價格低廉，每年養(yǎng)殖產(chǎn)量約400 萬t，是最典型的大宗低值淡水魚，加工成魚糜是其最有競爭力的利用途徑[7]。利用鰱魚為原料加工未漂洗魚糜已有一些研究報(bào)道，主要集中在其制作工藝[8]、凝膠增強(qiáng)技術(shù)[9]、抗凍和抗氧化[10]等方面，而關(guān)于其加工和凍藏過程中潛在危害物的形成規(guī)律的研究比較缺乏。

晚期糖化終末產(chǎn)物（advanced glycation endproducts，AGEs）是一組廣泛存在于肉類食品的潛在危害物質(zhì)，長期攝入會對人體產(chǎn)生傷害，增加多種慢性疾病的發(fā)生率[11]。食品中AGEs 形成的途徑和影響因素復(fù)雜，主要在美拉德反應(yīng)的初期和末期通過多種途徑產(chǎn)生，也與食品中蛋白質(zhì)、脂肪等組分的氧化反應(yīng)有關(guān)[12]。AGEs 種類多樣，其中Nε-羧甲基 賴氨酸（Nε-carboxymethylysine，CML）、Nε-羧乙基賴氨酸（Nε-carboxyethylysine，CEL）被認(rèn)為是最典型的兩種AGEs。未漂洗鰱魚魚糜中含有豐富的蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸，其在斬拌、加熱和凍藏過程中易發(fā)生氧化等化學(xué)反應(yīng)[13]，十分有利于AGEs 的形成。然而，盡管存在高AGEs 含量的潛在安全隱患，目前關(guān)于未漂洗魚糜產(chǎn)品AGEs 的基礎(chǔ)研究還十分薄弱，尤其是有關(guān)凍藏溫度和凍藏過程對AGEs 形成的影響研究接近空白。本研究探討不同溫度（-18，-60 ℃）下未漂洗鰱魚魚糜凍藏過程中AGEs 含量與其蛋白質(zhì)、脂肪氧化的關(guān)系，揭示AGEs 的形成機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鰱魚：購于長沙本地菜市場，每尾重（2.0±0.2）kg。

d4-CML 和d4-CEL 標(biāo)樣（純度>98%），購自加拿大TRC 公司；氯化鈉、三氯乙酸、EDTA、2，4-二硝基苯肼（DNPH）、5，5′-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、2-硫代巴比妥酸（TBA）、鹽酸胍均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZB-20 型斬拌機(jī)，山東省諸城市華鋼機(jī)械有限公司；TU-1901 紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；T10-BASIC 手持式均質(zhì)機(jī)，德國IKA 儀器有限公司；Altus A-30 UPLC 色譜儀和Qtrap 4500 三重四級桿質(zhì)譜儀，德國PerkinElmer 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 未漂洗生魚糜樣品制備 參考暴伊芮等[14]的方法，將新鮮鰱魚宰殺后采背部肌肉，放入斬拌機(jī)中于0～4 ℃條件下預(yù)斬1 min，按每100 g 魚肉加入2.5 g 食鹽繼續(xù)斬拌5 min，即為生魚糜。將生魚糜分裝于若干帶蓋塑料盒中，每盒25 g，分別置于-18 ℃和-60 ℃冰箱凍藏，在第0，15，30，45，60 d 取出，于4 ℃解凍12 h 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 未漂洗熟魚糜樣品制備 生魚糜樣品解凍后，稱取12.5 g 置于特制鋁盒中，加蓋密封后于90 ℃水浴加熱30 min，立即取出后冰水冷卻15 min，即為熟魚糜樣品。

1.3.3 AGEs 含量測定 生/熟魚糜樣品中的兩種AGEs（CML 和CEL）參照Niu等[15]的方法提取和HPLC-MS/MS 分析。不同凍藏周期的魚糜樣品真空干燥成粉末，取一定量用0.2 mol/L 的硼酸緩沖液（pH 9.2）和2 mol/L 的硼氫化鈉還原8 h，然后與甲醇-氯仿（體積比2∶1）混合，離心脫脂沉淀蛋白質(zhì)。在沉淀中加入6 mol/L HCl，110 ℃水解24 h，水解液稀釋后加入內(nèi)標(biāo)（d4-CML 和d4-CEL），真空干燥后以超純水重懸浮，SPE 固相萃取純化，洗脫液在60 ℃下氮吹干燥，并溶解在80%甲醇水溶液中；最后經(jīng)0.22 μm 膜過濾后進(jìn)行HPLC-MS/MS 分析[15]，最終含量換算為每kg 魚糜濕重中CML 和CEL 的含量。

1.3.4 魚糜蛋白質(zhì)樣品制備 參照Shen等[16]的方法，稱取2 g 解凍后生魚糜樣品，加入40 mL 磷酸緩沖液（pH 為7.0，含0.5 mol/L NaCl-15.6 mmol/L NaH2PO4），充分勻漿后于4 ℃靜置提取1 h，4℃、6 000 r/min 離心10 min，上清液即為魚糜蛋白質(zhì)提取液，以福林酚試劑法測定其蛋白含量。

1.3.5 蛋白質(zhì)羰基含量測定 羰基含量參照Pan等[17]的方法以DNPH 法測定。

1.3.6 Ca2+-ATPase 活性測定 參照Benjakul等[18]的方法，取2 mL 的魚糜蛋白樣品與0.5 mL Tris-HCl 緩沖液（0.5 mol/L，pH 7.0），8 mL CaCl2溶液（10 mmol/L）和0.5 mL ATP（20 mmol/L，pH 7.0）反應(yīng)8 min；立即加入5 mL 15%三氯乙酸（TCA，4℃）終止反應(yīng)，混合物以6 000 r/min 離心5 min，通過鉬酸銨比色法測量上清液中的無機(jī)磷含量。

1.3.7 總巰基和活性巰基的測定 采用Ellman's試劑法，參照Olver等[19]的方法稍作修改。0.5 mL魚糜蛋白樣品與2.5 mL Tris-Gly 緩沖液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L 甘氨酸、8 mol/L尿素、4 mmol/L EDTA，pH 8.0）和0.02 mL DTNB 混合，25℃下保溫1 h 后，在412 nm 處測定溶液吸光度，使用13 600 L/mol/cm 的消光系數(shù)計(jì)算總巰基含量；測定活性巰基時Tris-Gly 緩沖液除不含8 mol/L尿素外，其余操作與總巰基測定相同。

1.3.8 硫代巴比妥酸（TBA 值）的測定 生/熟魚糜樣品中的脂肪氧化情況以TBA 監(jiān)測，TBA 值參照Witte等[20]的方法測定，以每克魚糜樣品中丙二醛（MDA）的毫克數(shù)表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，使用SPSS 23 軟件進(jìn)行方差分析和Pearson 相關(guān)性分析，均值在α=0.05 水平進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果分析

2.1 凍藏過程對魚糜AGEs 形成的影響

CML 和CEL 是食品中最典型的兩種AGEs，魚糜中在不同溫度下凍藏及熱處理后CML 和CEL 的含量變化如圖1 所示?？梢?，無論是在常規(guī)溫度（-18 ℃）還是超低溫（-60 ℃）凍藏，兩種AGEs 的含量均隨著凍藏時間的延長而顯著增加（P<0.05），說明凍藏過程對魚糜中AGEs 的形成有較大影響。研究表明，食品中AGEs 主要是在美拉德反應(yīng)過程中形成的，而脂肪氧化、蛋白質(zhì)氧化等反應(yīng)也會產(chǎn)生AGEs 的前體物，如具有很強(qiáng)活性的乙二醛和丙酮醛[29]，這些α-二羰基前體物與游離氨基酸或蛋白質(zhì)以共價鍵形式結(jié)合，形成游離態(tài)或結(jié)合態(tài)AGEs（如CML、CEL 等）[21]。在相同凍藏周期，-18 ℃凍藏組樣品中的CML 和CEL 含量均明顯高于-60 ℃凍藏組，如生魚糜在-18 ℃凍藏60 d 后，CML 和CEL 的含量分別由12.53 mg/kg和5.78 mg/kg 增加至21.51 mg/kg 和10.88 mg/kg，顯著高于-60 ℃凍藏組的20.0 mg/kg 和9.37 mg/kg。這可能是因?yàn)樵?18 ℃凍藏過程中發(fā)生了更多的蛋白質(zhì)變性和脂質(zhì)氧化，從而促進(jìn)了AGEs 形成，在其它食品的研究中也有類似的結(jié)果[22]。

圖1 不同凍藏溫度下凍藏過程中未漂洗魚糜中CML 和CEL 的變化Fig.1 Changes in the content of CML and CEL of unwashed surimi during frozen storage at different freezing temperatures

此外，熟魚糜樣品中CML 和CEL 含量隨凍藏時間的變化趨勢與生魚糜樣品一致，但其含量分別達(dá)到14.83～24.31 mg/kg 和6.52～12.99 mg/kg，較其相應(yīng)的生魚糜樣品增加了約1.05～1.23 倍，表明熱處理促進(jìn)了魚糜中AGEs 的生成。這與Niu等[15]的研究結(jié)果相似。在高溫條件下，魚糜中的美拉德反應(yīng)、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化反應(yīng)加速，促進(jìn)了活性前體物質(zhì)的生成，從而增加了AGEs 的含量[23-24]。

2.2 凍藏過程對魚糜脂肪氧化影響

未漂洗魚糜中含有較高含量的不飽和脂肪酸，在加熱和貯藏過程中易發(fā)生氧化反應(yīng)。TBA 值反映了脂質(zhì)氧化過氧化物降解產(chǎn)物丙二醛（MDA）的水平，是表征食品脂肪氧化程度的常用指標(biāo)[25]，未漂洗魚糜樣品在凍藏過程中TBA 值的變化如圖2 所示。隨著凍藏時間的延長，生魚糜樣品的TBA 值均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，這與蔡秋杏等[26]研究廈門白姑魚腌制加工過程中TBA 值的變化趨勢類似。凍藏前期TBA 值上升主要是因?yàn)轸~糜凍藏過程中脂肪氧化程度不斷加劇導(dǎo)致產(chǎn)生了更多的氫過氧化物降解產(chǎn)物（如MDA）；-18 ℃凍藏組樣品的TBA 值顯著高于-60 ℃凍藏組，說明超低溫凍藏可以有效抑制脂質(zhì)氧化，與武華等[27]的研究結(jié)論一致。凍藏后期TBA 值下降可能是由于魚糜中脂肪氧化速率接近峰值但其次級氧化產(chǎn)物醛、酮類物質(zhì)進(jìn)一步降解成了揮發(fā)性物質(zhì)[28]，也可能是醛類與魚糜中其它成分（如蛋白質(zhì)）結(jié)合導(dǎo)致其與TBA 反應(yīng)的量減少[29]。熟魚糜樣品的TBA 值變化趨勢與生魚糜一致，但全部-60 ℃凍藏組以及-18 ℃凍藏組30 d 前樣品的TBA 值明顯高于其對應(yīng)的生魚糜樣品，說明熱處理促進(jìn)了魚糜中的脂肪氧化反應(yīng)，這與李曉燕等[30]的研究結(jié)果相符。

圖2 不同凍藏溫度下凍藏過程中未漂洗魚糜中TBA 值的變化Fig.2 Changes in the TBA value of unwashed surimi during frozen storage at different freezing temperatures

2.3 凍藏過程中魚糜蛋白質(zhì)羰基含量的變化

蛋白羰基含量是蛋白質(zhì)氧化損傷的敏感指標(biāo)，羰基的形成是蛋白質(zhì)分子被機(jī)體產(chǎn)生的氧自由基修飾的重要產(chǎn)物，是判斷蛋白質(zhì)氧化程度的重要指標(biāo)之一[31]。生魚糜凍藏過程中蛋白質(zhì)羰基含量的變化如圖3 所示。可見，無論在-18 ℃還是-60 ℃條件下凍藏，魚糜蛋白質(zhì)羰基含量均隨凍藏時間增加而顯著上升（P＜0.05），表明凍藏過程中魚糜蛋白質(zhì)持續(xù)發(fā)生了不同程度的氧化。在相同的凍藏周期，-18 ℃凍藏組樣品的羰基含量均高于-60 ℃組，表明凍藏溫度也對魚糜蛋白質(zhì)氧化有重要影響，超低溫凍藏能一定程度上抑制蛋白質(zhì)氧化，這可能是由于傳統(tǒng)凍藏溫度（-18 ℃）誘導(dǎo)了更多的蛋白質(zhì)變性或去折疊[32]，與-60 ℃相比更有利于形成席夫堿等反應(yīng)，從而使胺與羰基之間的反應(yīng)速度更快[33]。

圖3 不同凍藏溫度下凍藏過程中未漂洗魚糜蛋白質(zhì)羰基含量的變化Fig.3 Changes in the protein carbonyl content of unwashed surimi during frozen storage at different freezing temperatures

2.4 凍藏過程中魚糜蛋白質(zhì)Ca2+-ATPase 活性的變化

Ca2+-ATPase 活性通常可作為蛋白質(zhì)分子完整性的指標(biāo)，其活性下降被視為是肌球蛋白頭部巰基氧化和蛋白交聯(lián)引起的蛋白質(zhì)變性[7]。由圖4可知，兩種凍藏溫度下的魚糜蛋白質(zhì)Ca2+-ATPase活性均隨凍藏時間的延長呈下降趨勢，表明凍藏過程中蛋白質(zhì)變性程度不斷增加；魚糜在-18 ℃凍藏條件 下15 d，Ca2+-ATPase 活性為0.040 μmol Pi/mg/min，較第0 天樣品（0.129 μmol Pi/mg/min）顯著下降了69.0%，而-60 ℃組樣品仍為0.125 μmol Pi/mg/min，變化不顯著；凍藏60 d 后，-18 ℃凍藏組樣品的Ca2+-ATPase 活性降低了84.9%至0.019 μmol Pi/mg/min，而-60 ℃組（0.093 μmol Pi/mg/min）僅降低了27.9%。說明-18 ℃凍藏條件下魚糜蛋白質(zhì)發(fā)生了較多的變性或去折疊[34]，從而更容易被氧化，這與其羰基含量檢測的結(jié)果一致（圖3）。柴智等[35]研究也發(fā)現(xiàn)鱖魚在不同凍藏溫度下凍藏過程中Ca2+-ATPase 活性逐漸降低，且凍藏溫度越高，下降趨勢越明顯。

圖4 不同凍藏溫度下凍藏過程中未漂洗魚糜蛋白質(zhì)Ca2+-ATPase 活性的變化Fig.4 Changes in Ca2+-ATPase activity of unwashed surimi during frozen storage at different freezing temperatures

2.5 凍藏過程中魚糜蛋白質(zhì)巰基含量的變化

肌肉食品中蛋白質(zhì)氧化的另一個標(biāo)志是SH基團(tuán)的丟失，因?yàn)樗鼈兒苋菀淄ㄟ^脫氫形成二硫鍵。由圖5 可知，隨著凍藏時間的延長，魚糜蛋白質(zhì)的總巰基含量呈下降趨勢，而活性巰基含量呈上升趨勢。活性巰基含量上升可能是因?yàn)閮霾剡^程中蛋白質(zhì)變性和去折疊導(dǎo)致原來包埋在分子內(nèi)部的巰基暴露出來，而總巰基含量下降則可能是因?yàn)榛钚詭€基對氧化反應(yīng)敏感，導(dǎo)致形成了分子內(nèi)或分子間二硫鍵[22]；有研究表明，肌紅蛋白氧化、脂肪氧化和冰晶形成對組織的損傷是巰基向二硫鍵轉(zhuǎn)化的重要原因[36]。凍藏60 d 后，-60 ℃凍藏組樣品的活性巰基和總巰基含量分別較第0 天時（28.5 μmol/g）上升和下降了21.5%和10.0%，顯著低于-18 ℃凍藏組的38.3%和21.9%（P＜0.05），說明-60 ℃凍藏對魚糜蛋白質(zhì)巰基變化影響較小，可能是因?yàn)槌蜏貤l件下產(chǎn)生的冰晶較小，對魚糜蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)的破壞較小，從而減輕了其變性和氧化程度。

圖5 不同凍藏溫度下凍藏過程中魚糜中（a）活性巰基和（b）總巰基含量變化Fig.5 Changes in the content of（a）reactive sulfhydryl and（b）total sulfhydryl groups of unwashed surimi during frozen storage at different freezing temperatures

2.6 AGE 形成與脂肪、蛋白質(zhì)氧化的相關(guān)性

研究表明，食品中的AGEs 主要通過美拉德反應(yīng)途徑產(chǎn)生，也可以在蛋白質(zhì)、脂肪等組分的氧化反應(yīng)過程中形成[12]。分析凍藏過程中未漂洗魚糜中AGEs（CML 和CEL）含量與魚糜蛋白質(zhì)和脂肪氧化指標(biāo)之間的相關(guān)性，結(jié)果見表1?？梢?，無論是生魚糜還是熟魚糜樣品，其兩種AGEs 含量均與凍藏時間呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），說明凍藏過程是影響未漂洗魚糜AGEs 形成的重要因素，這與Niu等[15]和Yu等[33]的結(jié)論一致。羰基、活性巰基、總巰基含量和Ca2+-ATPase 活力均是能表征生魚糜蛋白質(zhì)氧化的指標(biāo)，其中羰基含量和活性巰基含量在凍藏過程中升高（圖3、圖5a），與魚糜AGEs 含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），而總巰基含量和Ca2+-ATPase 活力在凍藏過程中下降（圖5b、圖4），與魚糜AGEs 含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），表明蛋白質(zhì)氧化導(dǎo)致的蛋白結(jié)構(gòu)損傷、部分基團(tuán)暴露和氧化產(chǎn)物增加是未漂洗魚糜凍藏過程中AGEs 形成的主要原因。TBA 值是表征魚糜脂質(zhì)氧化的指標(biāo)，凍藏過程中生熟魚糜的TBA 值均呈先增加后降低趨勢（圖2），生魚糜的TBA 值與其CML 和CEL 含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），而與熟魚糜的CML 和CEL 含量也呈顯著正相關(guān)（r=0.408～0.526，P＜0.05），表明脂質(zhì)氧化也是促進(jìn)魚糜AGEs 形成的重要因素。Yu等[33]的研究結(jié)果表明脂質(zhì)氧化促進(jìn)了CML 和CEL 的生成，這與本研究的結(jié)果一致。然而，熟魚糜的TBA 值與所有樣品的CML 和CEL 含量均無顯著性相關(guān)性（P>0.05），可能與熱處理促進(jìn)了脂肪氧化產(chǎn)物進(jìn)一步降解或轉(zhuǎn)化有關(guān)[28]，而脂肪氧化進(jìn)一步影響蛋白質(zhì)氧化，從而間接影響AGEs 的生成?？傊?，未漂洗魚糜凍藏過程中AGEs 形成與其脂肪和蛋白質(zhì)密切相關(guān)，由于蛋白質(zhì)的冷凍變性和結(jié)構(gòu)損傷，導(dǎo)致氨基酸殘基的暴露[33]，加之脂質(zhì)氧化形成的醛酮類產(chǎn)物，不可避免地會誘發(fā)蛋白質(zhì)氧化，從而促進(jìn)了AGEs 的形成。

表1 未漂洗鰱魚魚糜AGEs 含量與脂肪和蛋白質(zhì)氧化指標(biāo)間的相關(guān)性Table 1 Correlation analysis of AGEs and oxidation indexes of fat and protein in unwashed silver carp surimi

3 結(jié)論

未漂洗鰱魚魚糜在凍藏過程中AGEs（CML和CEL）的含量顯著增加，超低溫（-60 ℃）凍藏有利于抑制AGEs 形成，而加熱促進(jìn)了AGEs 形成。凍藏過程中魚糜樣品的蛋白質(zhì)羰基和活性巰基含量逐漸上升，且與AGEs 含量顯著正相關(guān)；蛋白質(zhì)總巰基含量和Ca2+-ATPase 活性逐漸降低，且與AGEs 含量顯著負(fù)相關(guān)，說明蛋白質(zhì)的變性和氧化是魚糜凍藏過程AGEs 形成的重要原因。此外，超低溫凍藏有利于抑制脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化，從而抑制了AGEs 形成。