高壓熱滅菌中乳化劑吐溫80 的應(yīng)用研究

張變飛，楊 杰，畢 可，劉 月，辛偉山，張攀峰，章中

（寧夏大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 銀川 750021）

食品乳狀液中微生物的生長會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)企業(yè)的重大經(jīng)濟(jì)損失，其原因是食品在保質(zhì)期內(nèi)因細(xì)菌、酵母和霉菌的生長而引起食物中毒或變質(zhì)[1]。食品中最常見的乳劑有兩種形式：水包油（如牛奶、乳脂或蛋黃醬）和油包水（如黃油或低脂醬）[2]。乳劑是由兩種不相溶的液體形成的亞穩(wěn)態(tài)膠體體系。在食品加工或儲(chǔ)存過程中，乳液是熱力學(xué)不穩(wěn)定的體系，經(jīng)常會(huì)發(fā)生絮凝、聚結(jié)和相分離（如乳化）的現(xiàn)象[3]。由于食品中蛋白質(zhì)、脂類和乳化劑等各種成分的作用，系統(tǒng)中相鄰液滴之間存在排斥力，因此它們可以在動(dòng)力學(xué)上保持平衡。在這種復(fù)雜的食品乳劑中，許多因素都可能對(duì)微生物產(chǎn)生影響。在乳液中，水相通常被認(rèn)為是微生物生長的場(chǎng)所[4]。在食品滅菌中，芽孢是最難以被滅活的物體[5]。高壓熱殺菌（HPTS）可使芽孢失活，對(duì)食品品質(zhì)影響不大，與傳統(tǒng)的熱滅菌相比，HPTS 實(shí)現(xiàn)商業(yè)滅菌所需時(shí)間短。高壓熱滅菌為靜態(tài)超高壓和熱結(jié)合，通常壓力為400～900 MPa，溫度50～100℃，保持15～20 min。吐溫80 作為一種表面活性劑和乳化劑，對(duì)芽孢萌發(fā)和生長有一定的抑制作用，并具有抗菌活性，對(duì)界面現(xiàn)象也有很大的影響[6]。本試驗(yàn)設(shè)置不同的壓力和溫度，探討HPTS 結(jié)合不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的吐溫80 處理對(duì)枯草桿菌芽孢的殺滅效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC），編號(hào)As1.433[7]。

硫酸錳（分析純），天津市大茂化學(xué)試劑廠；吐溫80（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ATP 酶試劑盒、考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。營養(yǎng)瓊脂，天津市大茂化學(xué)試劑廠；TSA-YE 培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204 型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PL202-L 型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DSX-280B 型高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；LRH 系列生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器公司；DZ-500/2G 型落地式真空包裝機(jī)，西安星火包裝機(jī)械有限公司；HPP-600 MPa/5L 超高壓滅菌裝置，包頭科發(fā)高壓科技有限公司；TG16-W 型臺(tái)式高速離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；TGL-10B 型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-9000S 型紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；Milli-Q/Gradient 超純水儀，美國MilliPore 公司；754PC 型紫外-可見分光光度儀，上海菁華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枯草桿菌芽孢的培養(yǎng)及菌懸液制備 芽孢的制備參照章中等[7]的方法，將活化至少3 代以上的枯草芽孢桿菌在已滅菌的促芽孢生長錳鹽營養(yǎng)瓊脂（營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基33 g 加入硫酸錳0.1538 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7，加熱煮沸3 次，分裝試管內(nèi)，121 ℃滅菌15 min）試管斜面進(jìn)行劃線接種，于37 ℃恒溫培養(yǎng)7 d 后，向每支試管斜面中加入2 mL 無菌蒸餾水洗滌并收集菌體，合并菌懸液，在4 ℃以9 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心15 min，棄上清液，重復(fù)上述步驟再洗滌3 次后，于80 ℃水浴10 min，保證懸浮液中營養(yǎng)體被完全殺滅。離心濃縮并重懸無菌蒸餾水中的芽孢，測(cè)定菌液吸光度并調(diào)節(jié)芽孢濃度約為1.5×109CFU/mL，4 ℃保存，有效期為3 個(gè)月。使用時(shí)經(jīng)無菌蒸餾水稀釋芽孢濃度至5×107CFU/mL，1 個(gè)月內(nèi)使用。

1.3.2 HPTS 結(jié)合吐溫80 處理芽孢懸浮液 吸取30 mL 芽孢懸浮液至50 mL 無菌聚四氟乙烯離心管（經(jīng)121 ℃高壓滅菌）中，以9 000 r/min 離心15 min，棄上清液，分別加入50 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，1%，2%的吐溫80 溶液，充分渦旋混勻后，轉(zhuǎn)移至無菌聚乙烯塑封袋（紫外照射殺菌30 min），使用真空包裝機(jī)熱封，放置于HPTS 處理倉內(nèi)，待處理。設(shè)置保壓時(shí)間為20 min，超高壓處理壓力為200，600 MPa，處理溫度為75 ℃。在HPTS處理前，將樣品分別預(yù)熱到所需的初始溫度75℃，由于處理過程中溫度下降幅度較小，所示溫度（75±2）℃近似為HPTS 處理期間計(jì)算出的樣品溫度的平均值[9]。此外，由于所有樣品在處理過程中都浸在水中，水量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過吐溫80 含量，所以吐溫80 對(duì)壓縮加熱的影響可以忽略不計(jì)，處理結(jié)束后立即放入冰水冷卻，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。

1.3.3 枯草桿菌芽孢懸浮液的HPTS 動(dòng)力學(xué)處理及滅活的動(dòng)力學(xué)模型 取10 mL 芽孢懸浮液于無菌聚乙烯塑料袋中，菌懸液中的吐溫80 質(zhì)量分?jǐn)?shù)調(diào)整為0.5%，1%。將菌懸液真空包裝，熱封口后置于超高壓處理釜中，于200，600 MPa 結(jié)合75 ℃溫度下處理0，5，10，15，20，25 min。處理后立即將一部分樣品置于冰水中冷卻，測(cè)定芽孢存活數(shù)。將另一部分樣品在37 ℃培養(yǎng)3 h，測(cè)定菌落總數(shù)。本試驗(yàn)不考慮升壓、泄壓過程中樣品的溫度變化[10-12]。

1.3.3.1 一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型 這個(gè)模型假定熱壓處理下芽孢的存活符合線性關(guān)系，可用下式表示[13-14]：

N0——達(dá)到目標(biāo)壓力后芽孢的數(shù)量，CFU/mL；Nt——在壓力處理時(shí)間t 后芽孢的存活數(shù)量，CFU/mL；D——使90%的芽孢失活所需的時(shí)間。

1.3.3.2 Weibull 模型 Weibull 模型是將微生物的殺滅作為Weibull 模型概率事件，這與微生物群體中種群的異質(zhì)性有關(guān)[15]。這個(gè)模型假定營養(yǎng)體和芽孢具有不同的耐壓性，b 和n 分別為比例因子和形狀參數(shù)，它們與溫度和壓力的大小有關(guān)[16-17]。當(dāng)存活曲線向下凹時(shí)（n<1），芽孢群體中對(duì)適溫適壓敏感芽孢以較快速度被殺滅，而一些超級(jí)深度休眠芽孢仍存活。而向上凸的曲線（n>1），表明深度休眠的芽孢在所處環(huán)境下減少[18]。其表達(dá)式為：

Nt——時(shí)間t 時(shí)芽孢菌落數(shù)量，CFU/mL；N0——初始芽孢菌落數(shù)量，CFU/mL；b——比例因子；n——形狀系數(shù)；t——時(shí)間，min。

1.3.4 流式細(xì)胞法測(cè)定芽孢的膜通透性 取處理前后的枯草桿菌芽孢懸浮液1 mL，離心后棄去上清液，加入0.75 μL 的20 mmol 碘化吡啶（PI）染色，并在室溫下暗處孵育15 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)前向散射光（FSC）、側(cè)向散射光（SSC）、熒光通道FL2。每個(gè)樣品檢測(cè)約30 000 個(gè)細(xì)胞。采用488 nm 激發(fā)光，PI 標(biāo)記細(xì)胞在615 nm 處發(fā)紅色熒光（FL2通道），采集數(shù)據(jù)[19]。

1.3.5 枯草桿菌芽孢菌落平板計(jì)數(shù) 將處理前后的芽孢懸浮液分別進(jìn)行梯度稀釋，用移液槍吸取1 mL 稀釋液，用TSA-YE 培養(yǎng)基進(jìn)行傾注平板計(jì)數(shù)。每個(gè)平板中倒入1 mL 稀釋菌液和15～20 mL TSA-YE 培養(yǎng)基，混合均勻后靜置，每個(gè)樣品傾倒兩個(gè)平板，在37 ℃下培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果處理參照GB 4789.2-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[20]執(zhí)行。

1.3.6 芽孢懸浮液中DPA 的測(cè)定 芽孢在萌發(fā)、水解過程中會(huì)釋放出DPA，試驗(yàn)采用比色法進(jìn)行DPA 含量檢測(cè)。測(cè)量步驟如下：

DPA 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：配制10，20，40，80，120，160 和200 μg/mL DPA 溶液5 mL，其中含1 mL DPA 色測(cè)反應(yīng)劑。1～2 h 內(nèi)，于440 nm 下測(cè)定吸光度值，繪制出DPA 含量對(duì)吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

DPA 色測(cè)反應(yīng)劑：0.5 mol/L 乙酸鈉緩沖液100 mL，抗壞血酸、硫酸亞鐵銨各1 g。

將處理后的枯草桿菌芽孢懸浮液離心（4 ℃、9 000 r/min、15 min），取4 mL 上清液加1 mL 的DPA 色測(cè)反應(yīng)劑，在1～2 h 內(nèi)于440 nm 下測(cè)定吸光度值。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線算出DPA 的含量。

1.3.7 芽孢傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析 取處理前后的枯草桿菌芽孢懸浮液5 mL，以9 000 r/min 離心10 min，棄去上清液，用去離子無菌水反復(fù)洗去殘余的吐溫80 溶液后，冷凍干燥，將粉末與樣品質(zhì)量50～100 倍的溴化鉀（120 ℃干燥10 h）混合并進(jìn)行研磨、壓片，以空白溴化鉀為對(duì)照。放置在傅里葉紅外光譜儀樣品槽中，在4 000～400 cm-1波數(shù)范圍進(jìn)行掃描，掃描次數(shù)為64 次，分辨率為2 cm-1。

1.3.8 吐溫80 結(jié)合HPTS 處理后枯草桿菌芽孢ATP 酶活力的測(cè)定 取10 mL 處理前后的芽孢懸浮液，于4 ℃以8 000×g 離心10 min，取上清液，按照Na+/K+-ATP、Ca2+/Mg2+-ATP 酶活性測(cè)定試劑盒說明依次加入各試劑進(jìn)行反應(yīng)，定磷后于室溫25℃靜置30 min，使用酶標(biāo)儀在660 nm 處比色測(cè)定。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)分析 所有試驗(yàn)都至少重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)通過SPSS 22.0 進(jìn)行分析，以P<0.05 表示差異性顯著。用Origin 2020.0 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPTS 結(jié)合不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的吐溫80 處理后對(duì)枯草桿菌芽孢滅活效果的影響

如圖1 所示，HPTS（處理?xiàng)l件：200，600 MPa結(jié)合75 ℃，保壓時(shí)間：20 min）結(jié)合不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的吐溫80（0.5%，1%，2%）處理下枯草桿菌芽孢的存活情況。結(jié)果表明200 MPa，75 ℃時(shí)結(jié)合不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的吐溫80 處理后，芽孢存活量依次為3.2，5.3，4.76，4.77 lg（CFU/mL），與不添加吐溫80 相比，0.5%，1%，2%吐溫80 均對(duì)芽孢產(chǎn)生協(xié)同保護(hù)作用，其中，200 MPa，75 ℃，0.5%吐溫80 處理對(duì)芽孢的保護(hù)效果最強(qiáng)，芽孢存活量增加了2.1 lg（CFU/mL）；而當(dāng)壓力提升至600 MPa 時(shí)，HPTS 結(jié)合吐溫80 處理對(duì)芽孢的滅活效果明顯增強(qiáng)，說明高壓、高溫會(huì)增加對(duì)芽孢的破壞作用。Leonard-Akkari等[21]發(fā)現(xiàn)，吐溫80 溶液會(huì)抑制芽孢的萌發(fā)和生長。Krsta等[22]研究發(fā)現(xiàn)吐溫80 溶液可以降低抗生素對(duì)無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌的影響。Christina等[23]發(fā)現(xiàn)表面活性劑吐溫80 通常用于食物的分散油中，阻礙異丁香酚的抗菌性能。由此可見，吐溫80 溶液能夠影響微生物的萌發(fā)生長并抑制滅菌效果。為了闡明它的這種保護(hù)機(jī)理，需要我們進(jìn)一步研究。

圖1 HPTS 結(jié)合不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)吐溫80 處理對(duì)芽孢滅活效果的影響Fig.1 Spore-inactivation effects of different mass fraction of tween 80 combined with HPTS

2.2 HPTS 結(jié)合吐溫80 處理對(duì)枯草桿菌芽孢動(dòng)力學(xué)殺菌效果動(dòng)力學(xué)模型擬合

在600 MPa，75 ℃條件下結(jié)合吐溫80 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，1%，處理時(shí)間0，5，10，15，20，25 min，分析處理前后對(duì)枯草桿菌芽孢的動(dòng)力學(xué)失活效果的影響情況。如圖2 所示。HPTS 結(jié)合吐溫80 處理后，芽孢存活數(shù)明顯高于單獨(dú)HPTS 處理，說明吐溫80 溶液對(duì)芽孢具有一定的保護(hù)效果。而芽孢的滅菌效果與處理時(shí)間呈正比例相關(guān)，處理時(shí)間越長，芽孢的殺滅效果越強(qiáng)。

圖2 HPTS 結(jié)合吐溫80 處理對(duì)枯草桿菌芽孢動(dòng)力學(xué)殺滅效果的影響Fig.2 Effects of HPTS combined with tween 80 treatment on the kinetic inactivating effect of Bacillus subtilis

為了進(jìn)一步闡明芽孢的動(dòng)力學(xué)滅菌效果，采用線型、Weibull 模型對(duì)芽孢的殺滅效果進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，并選擇合適的動(dòng)力學(xué)模型，主要從一級(jí)動(dòng)力學(xué)角度分析HPTS 結(jié)合吐溫80 處理對(duì)芽孢殺菌效果的影響。如圖3 所示：600 MPa，75 ℃結(jié)合質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%，0.5%，1%吐溫80 處理下枯草桿菌芽孢線性與Weibull 模型擬合圖，由表1 可知，Weibull 模型的R2均大于0.92，線性模型的R2為0.738，0.526 和0.616，說明HPTS 結(jié)合吐溫80 的殺菌過程符合Weibull 模型。與單獨(dú)HPTS 相比，添加吐溫80 后Weibull 模型的參數(shù)b 值、n 值均減?。╪<1），且隨著處理時(shí)間的延長，芽孢群體對(duì)溫度與壓力敏感的芽孢很快被殺滅，而一些超級(jí)深度休眠芽孢仍存活。

表1 模型參數(shù)Table 1 Model parameters of linear，Weibull

圖3 600 MPa，75 ℃結(jié)合不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的吐溫80 處理下枯草桿菌芽孢的致死曲線Fig.3 Death curve of Bacillus subtilis under different mass fraction of tween 80 combined with 600 MPa，75 ℃treatment

圖4 DPA 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of DPA

2.3 HPTS 結(jié)合吐溫80 處理對(duì)芽孢的DPA 泄漏影響

DPA（2，6-吡啶二羧酸）是細(xì)菌芽孢的重要物質(zhì)，在芽孢核內(nèi)，DPA 與無水二價(jià)陽離子（如Ca2+）形成復(fù)合物，提升了芽孢的熱抗性。當(dāng)芽孢萌發(fā)或結(jié)構(gòu)完整性受到化學(xué)物質(zhì)、熱或高壓的破壞時(shí)，DPA 就會(huì)被釋放出來[24-26]。DPA 釋放是孢子萌發(fā)的早期過程，會(huì)刺激孢子萌發(fā)，成為孢子萌發(fā)的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。而HPTS 可增加DPA 的釋放，刺激芽孢萌發(fā)，芽孢萌發(fā)后就喪失了對(duì)外界脅迫的抵抗力[27]，進(jìn)一步對(duì)芽孢內(nèi)膜造成不可逆的損傷。因此，利用DPA 的釋放來評(píng)價(jià)芽孢內(nèi)膜的受損情況。

如表2 所示，隨著溫度壓力的增加，DPA 釋放顯著增加（P<0.5），表明高溫、高壓會(huì)使芽孢DPA迅速釋放，促進(jìn)芽孢萌發(fā)，對(duì)芽孢內(nèi)膜具有很強(qiáng)的破壞作用。但加入吐溫80 處理后，與單獨(dú)HPTS處理相比，DPA 釋放顯著降低（P<0.05），說明吐溫80 溶液可降低DPA 的釋放。在HPTS 結(jié)合吐溫80 處理過程中，芽孢的萌發(fā)機(jī)制不同，壓力在200 MPa 時(shí)，吐溫80 溶液首先抑制營養(yǎng)受體的激活，減少DPA 釋放，抑制芽孢萌發(fā)，削弱了HPTS 對(duì)芽孢的滅活效應(yīng)。當(dāng)壓力上升到600 MPa 時(shí)，高溫壓力直接導(dǎo)致了DPA 的釋放，促進(jìn)了芽孢的萌發(fā)，增加了HPTS 對(duì)芽孢的滅活效果，但整體而言，吐溫80 溶液降低了DPA 的釋放，對(duì)芽孢內(nèi)膜產(chǎn)生保護(hù)作用。

表2 HPTS 結(jié)合不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的吐溫80 處理中芽孢DPA 的釋放量（μg/mL）Table 2 DPA release of spores treated with different mass fraction of tween 80 and HPTS（μg/mL）

2.4 HPTS 結(jié)合吐溫80 處理對(duì)芽孢內(nèi)膜通透性的影響

流式細(xì)胞技術(shù)以激光技術(shù)為基礎(chǔ)，能夠分析光源通過的細(xì)胞或顆粒的物理、化學(xué)特性。使用熒光染料標(biāo)記微生物后，根據(jù)染料被激光照射后激發(fā)的熒光強(qiáng)度可計(jì)算特定細(xì)胞成分的含量和不同處理的變化，可用于測(cè)定芽孢的大小、折光性等形態(tài)學(xué)指標(biāo)和膜滲透性、代謝活動(dòng)等生理指標(biāo)[28-30]。PI 是一種核酸熒光染色劑，能夠滲透失去完整性細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)并與DNA 結(jié)合[31]。經(jīng)PI 染料標(biāo)記，采用流式細(xì)胞技術(shù)研究微生物內(nèi)膜通透性的變化已較為成熟[32-33]。HPTS 結(jié)合吐溫80 處理后的芽孢內(nèi)膜通透性變化見圖5。

圖5 600 MPa-75 ℃時(shí)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)吐溫80 處理對(duì)枯草桿菌芽孢內(nèi)膜通透性的影響Fig.5 Effect of different mass fraction tween 80 treatment at 600 MPa-75 ℃on inner membrane permeability of Bacillus subtilis

如圖5 所示，在SSC-FSC 通道的流式圖中圈選PI 染料的熒光陽性區(qū)，并根據(jù)門的偏移情況分析處理后芽孢內(nèi)膜的通透性變化。在600 MPa-75℃時(shí)，不添加吐溫80 使陽性區(qū)域偏移值為34.31%，隨著吐溫80 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，依次減小至20.08%，28.70%和30.11%，表明本試驗(yàn)中加入吐溫80 質(zhì)量分?jǐn)?shù)后均能降低對(duì)芽孢內(nèi)膜通透性的改變，其中，0.5%吐溫80 對(duì)芽孢內(nèi)膜通透性保護(hù)效果最好。

2.5 枯草芽孢桿菌細(xì)胞膜酶活性的變化

如圖6 所示，HPTS 結(jié)合不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的吐溫80 處理后，單獨(dú)HPTS 處理，Na+/K+-ATP、Ca2+/Mg2+-ATP 酶活性呈下降趨勢(shì)，表明HPTS 處理會(huì)使得枯草桿菌芽孢孢內(nèi)的ATP 酶失活，導(dǎo)致孢內(nèi)外離子運(yùn)輸及能量供應(yīng)失衡，進(jìn)而使得孢內(nèi)生理代謝紊亂。當(dāng)加入吐溫80 處理后，隨著吐溫80 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提升，Na+/K+-ATP、Ca2+/Mg2+-ATP 酶活顯著增加（P＞0.05），說明吐溫80 會(huì)在一定程度上保護(hù)ATP 酶活，使得部分Na+/K+-ATP、Ca2+/Mg2+-ATP 酶能夠正常工作，維持芽孢酶活性的平衡和穩(wěn)定。

圖6 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的吐溫80 結(jié)合HPTS 處理后芽孢內(nèi)膜Na+/K+-ATP、Ca2+/Mg2+-ATP 酶活的變化Fig.6 Changes in Na+/K+-ATP，Ca2+/Mg2+-ATPase of spore inner membrane treated with different mass fraction of tween 80 combined with HPTS

一般認(rèn)為，溫度和壓力的脅迫均能導(dǎo)致ATP酶的活性降低，且溫度為主導(dǎo)因素[34]。即使在很高壓力下，一些酶仍能具有較高的構(gòu)象穩(wěn)定性，并保留固有活性，這與酶對(duì)壓力的敏感性有關(guān)[34-35]，孫國龍等[36]研究發(fā)現(xiàn)非離子表面活性劑對(duì)酶活性影響較小，甚至有激活作用；陰離子表面活性劑對(duì)酶活性影響大，主要起抑制作用。而吐溫80 是非離子表面活性劑，對(duì)酶具有激活效果，與該研究結(jié)論相一致[36-37]。

2.6 枯草桿菌芽孢酰胺I 帶（1 600～1 700 cm-1）紅外光譜擬合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果分析

位于1 600～1 700 cm-1范圍的酰胺I 帶與蛋白質(zhì)骨架構(gòu)象類型相關(guān)，其主要涉及肽鏈C=O 伸縮振動(dòng)和N-H 平面彎曲振動(dòng)等。α 螺旋集中于1 650～1 660 cm-1，β 折疊集中于1 610～1 640 cm-1，β 轉(zhuǎn)角集中于1 660～1 670 cm-1，無規(guī)卷曲集中于1 640～1 650 cm-1[38]。

由圖7 可以看出，未處理的枯草桿菌芽孢酰胺Ⅰ帶有大量的有序二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋與β-折疊。相比未處理的枯草桿菌芽孢，單獨(dú)HPTS 處理后，α-螺旋和β-折疊均減少，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量均增加，說明超高壓處理后枯草桿菌芽孢從有序狀態(tài)向無序狀態(tài)轉(zhuǎn)變。而加入吐溫80 處理后，與未處理樣品相比，枯草桿菌芽孢α-螺旋結(jié)構(gòu)均增加，β-折疊減少、β-轉(zhuǎn)角增加、無規(guī)卷曲含量減少，說明吐溫80 對(duì)蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性具有一定的保護(hù)作用；同時(shí)，有效地降低了蛋白無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的含量，說明經(jīng)過吐溫80 處理后能有效地維持蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的有序狀態(tài)，使蛋白質(zhì)穩(wěn)定性增加，降低了HPTS 對(duì)芽孢蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。

圖7 枯草桿菌芽孢蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Fig.7 Protein secondary structure content Bacillus subtilis spores

3 結(jié)論

本文研究發(fā)現(xiàn)吐溫80 能夠削弱HPTS 對(duì)枯草芽孢桿菌的滅活效果，低壓熱（200 MPa，75 ℃）結(jié)合0.5%吐溫80 對(duì)芽孢產(chǎn)生很好的保護(hù)作用。同時(shí)吐溫80 溶液能夠有效地保護(hù)芽孢的內(nèi)膜通透性，減少芽孢內(nèi)容物DPA 的釋放，有助于激活芽孢ATP 酶的活性，另外吐溫80 還可以有效地維持芽孢蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，對(duì)芽孢產(chǎn)生保護(hù)作用，因此，乳化劑吐溫80 不利于高壓滅菌技術(shù)，說明高壓熱滅菌技術(shù)對(duì)乳化食品的滅菌依舊需要進(jìn)一步探索。