病原靶向二代測(cè)序在下呼吸道感染病原體診斷中應(yīng)用價(jià)值研究進(jìn)展*

徐偉玲 綜述,于少飛審校

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué),內(nèi)蒙古呼和浩特 010000;2.內(nèi)蒙古內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院兒科,內(nèi)蒙古呼和浩特 010000

病原靶向二代測(cè)序(tNGS)是使用特異性探針或引物捕獲特定DNA,通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)這些DNA片段進(jìn)行測(cè)序,實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體的鑒定,與全基因組測(cè)序(WGS)、宏基因NGS(mNGS)比較,其可減少無(wú)關(guān)序列的測(cè)序,提高對(duì)靶向區(qū)域的覆蓋度和深度,對(duì)下呼吸道感染(LRTI)病原體的診斷具有較高應(yīng)用價(jià)值,既能鑒定病原體,又能區(qū)分病原體亞型、檢測(cè)耐藥和毒力基因,成本大幅縮減,具有高效、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、可精準(zhǔn)分型等優(yōu)點(diǎn)。本文簡(jiǎn)要回顧了目前為止關(guān)于tNGS在LRTI病原體鑒定中的應(yīng)用價(jià)值。

1 tNGS概況

tNGS是基于多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和二代測(cè)序技術(shù)的新型病原微生物檢測(cè)方法,主要分為兩種,即基于引物PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增子測(cè)序和基于探針雜交的雜交捕獲測(cè)序。多重PCR擴(kuò)增子測(cè)序常用于富集基因組較小的病毒基因組,只在一定程度上檢出病毒變異的類(lèi)型,很難滿足不斷變異的病毒分型;而雜交捕獲測(cè)序中探針與隨機(jī)斷裂的片段雜交,捕獲到的序列不限于探針本身所對(duì)應(yīng)的區(qū)域,相鄰探針互相補(bǔ)充,對(duì)病毒的多態(tài)性具有更高的寬容度,不僅可以顯著富集病毒序列提升病毒基因組覆蓋,而且可在一定范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)新病毒。mNGS和tNGS最大的區(qū)別在于測(cè)序前的PCR擴(kuò)增是否是特異的,tNGS為特異的,mNGS為非特異的。DAI等[1]動(dòng)態(tài)隨訪100例早產(chǎn)兒,比較常規(guī)培養(yǎng)和tNGS對(duì)LRTI患者標(biāo)本病原體的鑒定發(fā)現(xiàn),tNGS與常規(guī)培養(yǎng)有90.9%的完全或部分一致性,檢出率提高了105.9%。LI等[2]采用tNGS技術(shù),對(duì)102例成人肺炎患者同時(shí)行mNGS和tNGS,靶標(biāo)僅檢測(cè)到153種病原體,但對(duì)臨床上常見(jiàn)呼吸道感染病原體的覆蓋率高達(dá)95%以上,結(jié)果顯示,tNGS和mNGS總體微生物檢出率分別為82.17%和86.51%,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但過(guò)程中tNGS的成本僅為mNGS的1/4,可見(jiàn)tNGS在呼吸道感染性疾病病原體鑒定中具有出色的表現(xiàn)及較高的性價(jià)比。GASTON等[3]對(duì)mNGS和tNGS從肺泡灌洗液(BALF)中檢測(cè)呼吸道病原體的工作流程進(jìn)行了評(píng)估,分析檢測(cè)的準(zhǔn)確度及可重復(fù)性,結(jié)果顯示,tNGS工作流程總體準(zhǔn)確度為65.6%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為45.9%,陰性預(yù)測(cè)值為85.7%;mNGS工作流程的總體準(zhǔn)確度為67.1%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為56.6%,陰性預(yù)測(cè)值為77.2%,總體來(lái)說(shuō)mNGS和tNGS對(duì)細(xì)菌、真菌和病毒的檢測(cè)范圍相當(dāng),在各自的檢測(cè)限內(nèi),重現(xiàn)率為100.0%。目前,tNGS已成為呼吸道感染病原體診斷的研究熱點(diǎn),也可應(yīng)用于其他系統(tǒng)感染,如中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染[4-5]、關(guān)節(jié)感染[6]等。

2 tNGS在LRTI不同病原體診斷中的應(yīng)用價(jià)值

2.1細(xì)菌 呼吸道細(xì)菌感染的病原菌以G+球菌為主,以金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌和肺炎克雷伯菌常見(jiàn)。LRTI病原學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)菌培養(yǎng)和涂片鏡檢,培養(yǎng)所需時(shí)間較長(zhǎng),且敏感性有限。tNGS 為L(zhǎng)RTI病原體診斷提供了新方法。有學(xué)者利用tNGS對(duì)西藏高原地區(qū)社區(qū)獲得性肺炎(CAP)的病原學(xué)分布特征進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)G+球菌中檢出率最多的是肺炎鏈球菌,G-桿菌中檢出最多的為嗜血桿菌屬[7]。鄭凱文等[8]自主設(shè)計(jì)了40對(duì)特異性引物,聯(lián)合多重 PCR與二代高通量測(cè)序?qū)崿F(xiàn)了對(duì)肺炎克雷伯菌、化膿性鏈球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、卡他莫拉菌等20 種LRTI常見(jiàn)病原體的高通量、快速檢測(cè),至少覆蓋了臨床上90%的下呼吸道病原體,結(jié)果顯示,tNGS檢出率明顯高于常規(guī)培養(yǎng)法,靈敏度達(dá)100%,標(biāo)本周轉(zhuǎn)時(shí)間(TAT)比常規(guī)培養(yǎng)法明顯縮短,由此可見(jiàn),tNGS可以在不損失靈敏度情況下快速明確病原體,對(duì)呼吸道感染病原體早期鑒定有較高的應(yīng)用價(jià)值。另有研究采用高通量靶向擴(kuò)增子測(cè)序(TAS)對(duì)重癥CAP患兒行BALF病原體檢測(cè),結(jié)果與常規(guī)檢查、多重PCR比較,TAS的靈敏度和特異度均較高,檢測(cè)BALF中細(xì)菌和病毒具有較好的效果[9]。有研究利用tNGS從1例患者的腦脊液中檢出皮特不動(dòng)桿菌,此前各項(xiàng)常規(guī)檢查均為陰性,根據(jù)tNGS檢測(cè)結(jié)果給予針對(duì)性治療后,患者病情好轉(zhuǎn)。由此說(shuō)明,tNGS可能是一種很好的病原體檢測(cè)技術(shù),有利于精準(zhǔn)診療的臨床實(shí)施[4]。綜上所述,在鑒定下呼吸道細(xì)菌感染中tNGS明顯優(yōu)于常規(guī)培養(yǎng)法,對(duì)絕大多數(shù)細(xì)菌(除外新型、罕見(jiàn)菌)的檢測(cè)能力與mNGS相當(dāng),并且可明顯縮短TAT。此外,tNGS單個(gè)標(biāo)本庫(kù)所需數(shù)據(jù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于mNGS,大大提高檢測(cè)吞吐量,降低測(cè)序成本[4]。然而,tNGS也有不足之處,有研究表明,tNGS在LRTI細(xì)菌檢測(cè)中,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值在檢測(cè)限介于103～104CFU/mL時(shí)降低,從而阻止了低豐度生物體的檢測(cè),認(rèn)為tNGS不能可靠地從臨床標(biāo)本中檢測(cè)出≤103CFU/mL標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)中定量的細(xì)菌[3]。此外,tNGS目前缺乏解釋結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn),不能用于確定病原體的診斷,只能作為篩查的輔助方法[6];檢測(cè)過(guò)程中所使用的生物信息學(xué)方法和數(shù)據(jù)庫(kù)也會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生直接影響[3]。

2.2病毒 根據(jù)中國(guó)CAP研究數(shù)據(jù)顯示,近年來(lái),CAP病原學(xué)特征發(fā)生改變,病毒性肺炎檢出率明顯增加,細(xì)菌性肺炎檢出率降低。LRTI病原體往往復(fù)雜多樣,病毒缺乏普遍保守的標(biāo)記,易突變,即使是單點(diǎn)突變,也會(huì)在宿主范圍、傳播性和致病性方面有所不同。因此,理想的病毒診斷平臺(tái)應(yīng)該對(duì)所有病毒及其變體進(jìn)行敏感的多路檢測(cè)?，F(xiàn)階段病毒診斷通?；卺槍?duì)一種或幾種特定試劑的PCR,可能無(wú)法檢測(cè)到病毒變異,只能提供有限的基因型信息。目前病毒靶向測(cè)序大多采取雜交捕獲測(cè)序。一種基于tNGS的高通量病毒靶向檢測(cè)和診斷技術(shù)(ViroCap)解決了目前PCR和高通量測(cè)序診斷、分析病毒組的諸多挑戰(zhàn)。ViroCap使用一組具有高特異度的DNA探針捕獲病毒基因組序列,然后進(jìn)行高通量測(cè)序,通過(guò)比對(duì)已知病毒基因組數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定檢測(cè)到的病毒,具有高度的靈敏度和特異度,可在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出多種病毒,提供更全面的病毒診斷和監(jiān)測(cè)信息,在病毒診斷、發(fā)病機(jī)制研究、流行病學(xué)調(diào)查等方面有廣泛的應(yīng)用前景,可幫助科學(xué)家更好地了解病毒的種類(lèi)、分布和傳播途徑,從而制訂針對(duì)性的防控措施。目前已有多個(gè)研究使用ViroCap進(jìn)行病毒檢測(cè)。不同于mNGS技術(shù),DNA和RNA檢測(cè)流程需分開(kāi)進(jìn)行,tNGS可實(shí)現(xiàn)DNA和RNA共檢。LI等[2]的研究中tNGS就檢出了鼻病毒A、B、C,而mNGS未檢測(cè)出,因?yàn)楸遣《緸镽NA病毒,而研究中mNGS只進(jìn)行了DNA過(guò)程,但mNGS在33例患者中檢出人皰疹病毒,而tNGS未檢測(cè)到。有研究指出,mNGS雖檢出較多人皰疹病毒,但多數(shù)患者未予治療病情好轉(zhuǎn),考慮定植可能性大[7]。WYLIE等[10]在研究中比較了ViroCap和宏基因鳥(niǎo)槍測(cè)序檢測(cè)病毒的效能,發(fā)現(xiàn)捕獲富集后,基因組代表性顯著增強(qiáng),病毒序列讀數(shù)百分比的中位數(shù)和中位覆蓋寬度明顯增加,且除檢測(cè)到所有預(yù)期的病毒外,還檢測(cè)到30個(gè)額外的病毒,其中大多數(shù)是臨床實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有檢測(cè)的病毒,或來(lái)自標(biāo)本上沒(méi)有被要求檢測(cè)的病毒。由此可見(jiàn),病毒捕獲測(cè)序不僅可以檢出病毒,還可以在一定范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)新病毒。但其也存在局限性,首先,探針捕獲與文庫(kù)雜交、測(cè)序及分析前的標(biāo)本處理都增加了檢測(cè)時(shí)間;其次,新病毒基因組可能不會(huì)與捕獲探針序列高度不同的病毒基因組富集;最后,若只檢測(cè)少量標(biāo)本,捕獲探針的成本可能會(huì)讓人望而卻步[10]。ViroCap通過(guò)雜交到較大基因組片段中的短保守序列檢測(cè)新病毒,降低宿主背景,提高了平均覆蓋率,幾乎獲得了所有病毒的全長(zhǎng)序列[11],提供更多關(guān)于病毒遺傳多樣性、基因分型和毒力的信息[12]。tNGS解決了病毒變異的問(wèn)題,增加病毒基因序列讀數(shù)、覆蓋的廣度及深度,對(duì)病毒感染的診斷具有明顯優(yōu)勢(shì),且基因序列可進(jìn)行病毒分型。

2.3結(jié)核桿菌 有學(xué)者利用靶向DNA富集技術(shù)對(duì)43份痰標(biāo)本進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌測(cè)序,認(rèn)為痰測(cè)序比痰培養(yǎng)有潛力提供更綜合、快速的耐藥檢測(cè)[12]。WU等[13]對(duì)上海肺科醫(yī)院130例肺結(jié)核患者的BALF標(biāo)本進(jìn)行tNGS檢測(cè),結(jié)果顯示,tNGS的檢出率明顯高于抗酸桿菌涂片、培養(yǎng)和免疫檢測(cè),與抗酸桿菌涂片和培養(yǎng)相比,tNGS在涂片陰性和培養(yǎng)陰性病例中檢出率較高,而與結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥檢測(cè)比較,則顯示出幾乎相同的靈敏度;以表型藥敏試驗(yàn)作為參考標(biāo)準(zhǔn),tNGS檢測(cè)利福平耐藥性的靈敏度和特異度均為100%,檢測(cè)異煙肼耐藥性的靈敏度和特異度分別為80%和100%。由此可見(jiàn),tNGS可能是一種有前途的工具,可擴(kuò)大結(jié)核病檢測(cè)的技術(shù)儲(chǔ)備。有研究發(fā)現(xiàn),tNGS對(duì)不同耐藥譜結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)與WGS一致性相當(dāng),優(yōu)于Sanger測(cè)序的一致性,tNGS可在耐藥結(jié)核病中全面準(zhǔn)確預(yù)測(cè)耐藥性[14]。自WHO指南發(fā)布以來(lái),WGS和tNGS已用于預(yù)測(cè)結(jié)核病的耐藥性,特別是tNGS可為靶向耐藥基因提供覆蓋深度大的全長(zhǎng)序列信息,對(duì)預(yù)測(cè)耐藥非常重要[15]。tNGS的優(yōu)勢(shì)還在于可區(qū)分結(jié)核和其他抗酸桿菌,抗酸桿菌包括結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)桿菌和其他非結(jié)核分枝桿菌,痰涂片抗酸染色不能區(qū)分上述三者。LI等[2]采用多重PCR靶向測(cè)序鑒定10種涉及人類(lèi)疾病的主要分枝桿菌,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可特異地識(shí)別分枝桿菌物種,且不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng),同時(shí)檢測(cè)某些抗菌藥物耐藥基因型也是可行的。CHAE等[16]在研究中亦正確識(shí)別結(jié)核分枝桿菌和5種非結(jié)核分枝桿菌物種,包括M.膿桿菌亞種。tNGS 檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的靈敏度較高,可提高檢測(cè)效能,還可區(qū)分結(jié)核與其他抗酸桿菌,在區(qū)別亞型、檢測(cè)耐藥基因方面的優(yōu)勢(shì)顯著。

2.4真菌 下呼吸道真菌感染多繼發(fā)于免疫功能紊亂或低下、長(zhǎng)期使用抗菌藥物等情況,近年來(lái)肺部真菌感染的發(fā)病率及病死率逐年上升,但目前肺部真菌感染的診斷存在一些問(wèn)題,如耗時(shí)長(zhǎng)、特異度低、易污染等。姚璐[17]報(bào)道了1例經(jīng)DNA靶向測(cè)序明確診斷為M.暗色絲孢霉的播散性感染,根據(jù)測(cè)序結(jié)果給予針對(duì)性抗真菌治療后,患者病情明顯好轉(zhuǎn),查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),報(bào)道的9例人類(lèi)感染M.暗色絲孢霉均為個(gè)案報(bào)道,其中8例通過(guò)基因測(cè)序確診,僅1例通過(guò)常規(guī)培養(yǎng)確診,可見(jiàn)病原靶向測(cè)序可提高檢測(cè)的靈敏度。在一項(xiàng)關(guān)于102例成人肺炎的研究中tNGS真菌檢出率為12.56%,mNGS真菌檢出率為13.45%[2]。真菌細(xì)胞壁厚,細(xì)菌DNA的提取方法應(yīng)用于真菌核酸的提取很有可能會(huì)使提取效率降低,且不同真菌DNA檢測(cè)方法可能會(huì)產(chǎn)生不一樣的結(jié)果,因此,仍需繼續(xù)優(yōu)化相關(guān)配套技術(shù)和條件。鄭凱文[18]選擇屎腸球菌和白色念珠菌兩種厚壁、較難破碎的病原菌為代表進(jìn)行物理破壁條件的探索,結(jié)果破壁后靶向測(cè)序檢出5例屎腸球菌,未檢出白色念珠菌,常規(guī)培養(yǎng)對(duì)這兩種菌株均未檢出。由此可見(jiàn),若改善破壁條件可提升核酸提取率,tNGS對(duì)真菌的檢出很可能會(huì)優(yōu)于常規(guī)培養(yǎng)法。目前tNGS在呼吸道真菌感染鑒定中的研究較少,未來(lái)仍有很大探索空間。

2.5其他非典型病原體 引起LRTI的非典型病原體包括支原體、衣原體和立克次體等。在DUNLAP等[19]的1份病例報(bào)告中,1例患者經(jīng)tNGS發(fā)現(xiàn)為肺炎支原體感染,予針對(duì)性治療后,病情明顯改善,而此前血培養(yǎng)結(jié)果為壞死梭桿菌,可見(jiàn)下一代測(cè)序可早期建立病因診斷指導(dǎo)精準(zhǔn)抗菌藥物管理。肺炎支原體沒(méi)有細(xì)胞壁,主要定植于呼吸道黏膜表面,正確的采集方法和時(shí)機(jī)對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大。有研究指出,BALF中肺炎支原體的檢出率明顯高于痰標(biāo)本[7]。目前tNGS在肺炎支原體感染中的研究較少,有研究顯示tNGS在肺炎支原體中的檢出率較低[2],但因標(biāo)本來(lái)自成人,故不能以偏概全反映靶向測(cè)序在肺炎支原體感染中的實(shí)際診斷效能。就呼吸道感染的衣原體而言,肺炎衣原體感染的概率并不是很高,近年來(lái)鸚鵡熱衣原體感染有增加的趨勢(shì),不應(yīng)再單純檢測(cè)肺炎衣原體,而應(yīng)將鸚鵡熱、沙眼衣原體也加入到檢測(cè)項(xiàng)目中。目前已有多篇研究探討了mNGS在鸚鵡熱衣原體感染鑒定中的應(yīng)用,均表現(xiàn)出良好的檢測(cè)效能[20-21],但尚無(wú)tNGS應(yīng)用于衣原體檢測(cè)的報(bào)道,有待進(jìn)一步研究。立克次體病在急性期很難進(jìn)行病因診斷,因確診常需在康復(fù)后再次采血,比較急性期和恢復(fù)期的血清變化。HUANG等[6]報(bào)道了1例全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后發(fā)生假體移位和假體周?chē)侨芙獾牟±?通過(guò)mNGS和tNGS檢測(cè)到貝納柯克斯體,而此前微生物培養(yǎng)結(jié)果均為陰性。有研究通過(guò)分型培養(yǎng)的嗜肺軍團(tuán)菌驗(yàn)證了tNGS的實(shí)用性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在tNGS中,全部的基因分析得到了與全基因組數(shù)據(jù)分析相同的嗜肺軍團(tuán)菌株分類(lèi),并在隨后直接對(duì)患者呼吸道標(biāo)本進(jìn)行的嗜肺軍團(tuán)菌靶向檢測(cè)中,也可根據(jù)相應(yīng)的培養(yǎng)菌株正確對(duì)患者進(jìn)行分類(lèi),由此可見(jiàn),tNGS有潛力在肺炎軍團(tuán)菌感染鑒定中發(fā)揮重要作用[22]。目前,tNGS在非典型病原體中的應(yīng)用多集中在個(gè)案報(bào)道,期待未來(lái)有更多的研究體現(xiàn) tNGS 對(duì)非典型病原體的診斷價(jià)值。

2.6混合感染 LRTI具有病原譜復(fù)雜、多樣,且易混合感染的特點(diǎn),常規(guī)檢測(cè)手段難以在單一標(biāo)本中同時(shí)檢出多種病原體,而NGS可在鑒別混合感染中發(fā)揮重要作用。有研究表明,在混合標(biāo)本中病原靶向測(cè)序的基因組覆蓋率未受到影響,2份標(biāo)本中兩種病毒的基因組覆蓋率均達(dá)到95%～100%[23],TAS和多重PCR檢測(cè)在鑒別混合感染方面比常規(guī)培養(yǎng)法有明顯優(yōu)勢(shì)[24]。

3 總結(jié)與展望

LRTI是常見(jiàn)且多發(fā)的感染性疾病,也是導(dǎo)致患者病情加重、甚至死亡的重要原因。在靶標(biāo)范圍內(nèi),tNGS與mNGS的檢測(cè)效能相當(dāng),而對(duì)新型、罕見(jiàn)菌的檢測(cè),mNGS明顯優(yōu)于tNGS。相對(duì)于mNGS,tNGS去除了人源基因的影響,靈敏度提升,實(shí)現(xiàn)了DNA和RNA共檢,時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本大幅降低,更重要的是tNGS可在鑒定病原體的同時(shí),區(qū)分病原體的亞型、檢測(cè)耐藥性和毒力基因,這些都是臨床應(yīng)用中需要著重考慮的因素。目前,tNGS在非典型病原體感染中的研究較少,有待進(jìn)一步探索。tNGS的局限性:(1)缺乏統(tǒng)一的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范的測(cè)序流程[3];(2)無(wú)法鑒別污染、定植還是活動(dòng)性感染;(3)沒(méi)有解決對(duì)真菌、胞內(nèi)菌等檢出率低的問(wèn)題,相關(guān)配套技術(shù)和條件仍需繼續(xù)優(yōu)化;(4)tNGS只對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序,雖增加了靈敏度,但勢(shì)必會(huì)錯(cuò)過(guò)非靶向序列。未來(lái)tNGS技術(shù)仍需不斷改善,以提高其在LRTI中的診斷效能,從而更好地滿足臨床應(yīng)用需求。