柿果實形狀形成的關(guān)鍵時期

張 悅，張嘉嘉，李華威，羅 穎，黃 琳，樊雄飛，張 祎，孫 鵬，李芳東

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟林研究所，河南 鄭州 450003；2.經(jīng)濟林種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室，河南 鄭州 450003）

柿Diospyroskaki屬于柿科柿屬，是柿屬植物中果樹栽培的代表種。中國是世界上柿樹栽培歷史最悠久的國家[1-2]，柿樹栽培品種約有1 000多個[3-4]。柿果實營養(yǎng)豐富，既可以鮮食，也可以加工成柿餅、柿脯、柿醋和柿酒等。柿果實可溶性固形物和單寧含量高，在食品、保健和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有很大的開發(fā)價值和應(yīng)用潛力，因此柿果相關(guān)研究越來越受到重視[2,5]。

果實形狀是評價果實外觀品質(zhì)的重要指標(biāo)[6-8]。與桃、蘋果等其他果樹相比，柿果實形狀多樣性最豐富[6-16]。綜合柿果實縱切面與橫切面形狀，柿果實形狀分為圓、橢圓、卵圓及圓錐等17種[9]，可充分滿足消費者的個性化需求。柿果實形狀對柿餅加工影響很大，不同柿果實形狀所用的削皮機械不同，晾曬方式也不同。柿果實形狀對果品儲運也有顯著影響，果頂凹陷的品種比果頂凸尖的品種更耐儲運。

理想的柿果實形狀應(yīng)兼具以下優(yōu)點：既適合機械化采收、便于貯運，又具有良好的外觀品質(zhì)，受到消費者青睞[15-16]。已有的育種工作重點關(guān)注柿果的自然脫澀能力、果實風(fēng)味、口感以及良種與砧木的親和性和生長適應(yīng)性等性狀[17-20]，而對柿果形等外觀品質(zhì)缺乏關(guān)注。這一現(xiàn)狀致使目前柿良種的果形變異豐富，缺乏優(yōu)化導(dǎo)向，還未能培育出一個外觀品質(zhì)綜合表現(xiàn)更優(yōu)的品種。要開展柿果實形狀改良的必要前提是：鑒定果形形成的形態(tài)學(xué)關(guān)鍵時期并揭示果形形成的調(diào)控機理。Maeda等[10]對柿果實形狀進行了初步評價，但并未對果實整體發(fā)育過程進行系統(tǒng)評價，目前柿果實形狀形成的形態(tài)學(xué)關(guān)鍵時期依然不明。柿果實形狀形成調(diào)控機理研究取得了一定進展，但仍需深化[6,10]。例如，Maeda等[6]發(fā)現(xiàn)KNOX家族基因和SEEDSTICK基因與一些細胞激素相關(guān)基因協(xié)同調(diào)控果實形態(tài)多樣性；控制番茄果實形狀的OVATE家族基因，在柿果實形狀多樣性研究中同樣具有調(diào)控作用。以上研究雖然挖掘出了一些柿果實形狀形成的關(guān)鍵候選調(diào)控基因，但仍存在以下改進空間：1）缺乏對大量柿種質(zhì)果形的系統(tǒng)評價，因此所選樣品的典型性和代表性不強；2）缺乏對果實完整生長期內(nèi)果形的系統(tǒng)評價，因此取樣關(guān)鍵時間點的選擇缺乏依據(jù)；3）對挖掘出的基因未做功能驗證，也沒有通過外施植物生長調(diào)節(jié)劑等生理調(diào)控方式進行驗證。

近年來其他植物的果形形成調(diào)控研究進展主要包括以下方面：栽培番茄果實形狀變異的調(diào)控基因主要有LC[21]、FAS[22]、OVATE[23]、SUN[24]和FS8.1[25-26]等。LC和FAS基因通過增加番茄果實的心室數(shù)量使果實變扁，而OVATE、SUN和FS8.1基因主要調(diào)控番茄果實的伸長生長[27-30]。其中，OVATE編碼與果實伸長相關(guān)的一個負調(diào)控因子，該基因突變會導(dǎo)致圓形品種的番茄果實發(fā)育成梨形[23]。Cao等[31-32]篩選出調(diào)控桃果實形狀的基因ppa003772m并命名為PpCAD1，該基因位于scaffold d_6(25 060 196 bp)，PpCAD1基因的第5個內(nèi)含子上，PpCAD1檢測到的單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism,SNP）的A/T變異與桃果實形狀變異高度相關(guān)。

柿果實形狀形成時期的確定對于果形形成機理研究至關(guān)重要。本研究前期對260份具有代表性的柿種質(zhì)資源的果實進行果實形狀多樣性評價，發(fā)現(xiàn)扁橢球形果實（扁果）種質(zhì)占59.6%，長橢球形果實（長果）種質(zhì)占18.5%[16]。本研究基于以上研究結(jié)果，選出8個典型的長果柿品種和9個典型的扁果柿品種，從5月中旬花冠完全脫落到9月底果實達到商熟期，對果實形狀形成的表型變化深入觀察分析，以期揭示柿果實形狀形成的形態(tài)學(xué)關(guān)鍵時期，為后續(xù)通過生理和分子生物學(xué)手段研究果形形成調(diào)控機理的關(guān)鍵采樣期確定提供依據(jù)，同時為人工調(diào)控柿果實形狀的關(guān)鍵處理期選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及其處理

本研究在前期對260份柿種質(zhì)資源果實形態(tài)多樣性評價的基礎(chǔ)上[16]，選取17份柿D.kaki栽培品種，包括8個典型的長果柿品種和9個典型的扁果柿品種（表1），分階段進行果形評價。所有供試樣品均保存于中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟林研究所原陽試驗基地柿資源圃（34°55′18′′～34°56′27′′N，113°46′14′′～113°47′35′′E），該資源圃是“北方主要名優(yōu)經(jīng)濟林樹種國家林木種質(zhì)資源庫”的重要組成部分，由中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟林研究所柿屬植物團隊管理。所有樣品的立地條件和管理措施一致。

表1 試驗材料類型、來源及采集地Table 1 Material type,origins and collecting zones

1.2 測定項目及測定方法

1.2.1 果實形態(tài)測定

2021—2022年連續(xù)對17份柿栽培品種（表1）的果實大小和形態(tài)相關(guān)的數(shù)量性狀進行測定。每個品種選取5株樹勢中等、樹體健康的植株，從樹體中部各方向結(jié)果枝上隨機采收5～10個果實用于測定。從5月16日花冠完全脫落到9月27日果實達到商熟期（圖1），分別在5月16日、5月28日、6月14日、6月22日、7月3日、7月14日、7月19日、7月27日、7月31日、8月14日、8月27日、9月10日、9月27日共13個時間點取樣（圖2為其中10個階段的長、扁果對比），對柿果的縱徑、橫徑、單果鮮質(zhì)量、果形指數(shù)進行測定，確定柿果實形狀形成的關(guān)鍵時期。柿果實已充分完成從綠色向橙黃或橙紅的轉(zhuǎn)色，但果實尚未變軟，澀柿需經(jīng)CO2脫澀處理才能具有鮮食的商品性[33]。柿果縱徑、橫徑和單果鮮質(zhì)量等性狀參照《柿種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[9]進行測定，并根據(jù)測定數(shù)據(jù)計算果形指數(shù)（果實縱徑/果實橫徑）。

圖1 8個典型長果品種商熟期果實示意（編號對應(yīng)的品種名稱見表1）Fig.1 Fruit diagram of eight typical long fruit cultivars at ripening stage (the cultivar names represented by the numbers were shown in table 1)

圖2 9個典型扁果品種商熟期果實示意圖（編號對應(yīng)的品種名稱見表1）Fig.2 Fruit diagram of nine typical flat fruit cultivars at ripening stage (the cultivar names represented by the numbers were shown in table 1)

圖3 長果的‘黃邊小雞心柿’（72號）和扁果的‘臨潼方柿’（132號）果實在不同發(fā)育階段的果形比較Fig.3 Comparison of fruit shape between ‘Huangbian Xiaojixin’(No.72) for long fruit and ‘Lintong Fangshi’ (No.132)for flat fruit at different developmental stages

1.2.2 果實形態(tài)多樣性分析

利用SPSS 23.0軟件的獨立樣本t檢驗比較同一品種的相同指標(biāo)在相同發(fā)育階段上不同年份間的差異，利用SPSS 23.0軟件的單因素方差分析進行各品種的各指標(biāo)在不同發(fā)育階段上的差異比較，使用WPS 2019軟件繪制觀察期內(nèi)果實各項數(shù)量性狀均值變化的二維散點圖。

各階段長扁果果形指數(shù)比值：分別計算各個階段長果所有品種和扁果所有品種果形指數(shù)平均值，然后各個階段長果果形指數(shù)與扁果果形指數(shù)的比值，并用WPS 2019軟件繪制變化趨勢圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同年份柿果實形態(tài)發(fā)育差異性分析

選取長果代表性品種38、72和107，扁果代表性品種31、105和132，生長期內(nèi)每月選取一個時間點分別對其表型數(shù)量性狀進行年份間差異性比較。結(jié)果表明，在選取的5個時間點上，每個品種縱徑、橫徑、單果鮮質(zhì)量及果形指數(shù)在年份間無顯著差異（表2）。因此，將2年數(shù)據(jù)作為生物學(xué)重復(fù)用于后續(xù)分析。

表2 表型性狀差異性比較?Table 2 Comparison of differences of phenotypic characters

2.2 不同發(fā)育階段果實表型差異比較

為了全面、綜合地對柿果實表型數(shù)據(jù)進行歸納，利用長果和扁果所有品種在各發(fā)育階段的表型數(shù)據(jù)繪制復(fù)式條形圖。從圖4～5可以看出，所有品種在不同階段的變化趨勢相似。由于各品種在各階段間的表型值差異極顯著（表3～4），且特定品種在特定階段測定的表型值的標(biāo)準(zhǔn)誤差值相對于均值很小，因此，為了便于觀察數(shù)據(jù)的變化趨勢，后續(xù)將利用均值繪制變化趨勢圖。（圖4～5）。

圖4 長果各品種在不同發(fā)育階段上的縱徑、橫徑、單果鮮質(zhì)量和果形指數(shù)比較分析Fig.4 Comparative analysis of vertical diameter,transverse diameter,single fruit fresh mass and fruit shape index of long fruit cultivars at different developmental stages

圖5 扁果各品種在不同發(fā)育階段上的縱徑、橫徑、單果鮮質(zhì)量和果形指數(shù)比較分析Fig.5 Comparative analysis of vertical diameter,transverse diameter,single fruit fresh mass and fruit shape index of flat fruit cultivars at different developmental stages

表3 長果各品種的表型指標(biāo)在各階段間差異性比較?Table 3 Comparison of differences in morphological characters of each cultivars with long fruits among developmental stages

表4 扁果各品種的表型指標(biāo)在各階段間的差異性比較Table 4 Comparison of differences in morphological characters of each cultivars with flat fruits among developmental stages

2.3 不同發(fā)育階段果實表型變化趨勢分析

2.3.1 長果和扁果表型數(shù)量性狀生長變化趨勢

整個采樣時期從5月16日—9月27日，長果和扁果各品種的縱徑、橫徑、單果鮮質(zhì)量均呈快—慢—快的生長模式。從5月16日—7月14日，縱徑、橫徑、單果鮮質(zhì)量等性狀迅速增加；從7月14日—8月14日柿果生長速度減緩，整體小幅增長；從8月14日—9月27日，縱徑、橫徑、單果鮮質(zhì)量等性狀快速增加，單果鮮質(zhì)量增加尤為明顯。

長果和扁果品種的果形指數(shù)變化趨勢各有不同。從5月16日—7月14日長果品種的果形指數(shù)快速增加，果實呈長球形發(fā)展，增加到一定數(shù)值，果實基本定形，而后果形指數(shù)小幅動態(tài)變化（圖6）；扁果品種的果形指數(shù)最低值基本都出現(xiàn)在5月16日—7月3日這個時期，扁果果形呈扁平狀發(fā)展的動態(tài)變化，而后果實基本定形，果形指數(shù)小幅動態(tài)變化（圖7）。

圖6 長果各品種在不同發(fā)育階段上的縱徑、橫徑、單果鮮質(zhì)量和果形指數(shù)變化趨勢Fig.6 Trends of vertical diameter,transverse diameter,fresh mass per fruit and fruit shape index of long fruit cultivars at different developmental stages

圖7 扁果各品種在不同發(fā)育階段上的縱徑、橫徑、單果鮮質(zhì)量和果形指數(shù)變化趨勢Fig.7 Trends of vertical diameter,transverse diameter,fresh mass per fruit and fruit shape index of flat fruit cultivars at different developmental stages

2.3.2 所有長果果形指數(shù)均值與所有扁果果形指數(shù)均值在不同發(fā)育階段的比率

由圖8可以看出，從5月16日—7月3日，所有長果品種的果形指數(shù)均值與所有扁果品種的果形指數(shù)均值對比最明顯，數(shù)值呈直線上升趨勢，7月3日后各個階段長果果形指數(shù)均值與扁果果形指數(shù)均值比率變化幅度不大，基本趨于穩(wěn)定。

圖8 長果與扁果品種果形指數(shù)比值變化趨勢Fig.8 Variation trends of fruit shape index ratio between long fruit and flat fruit

3 結(jié)論與討論

本研究在前期對260份柿種質(zhì)資源果實形態(tài)進行多樣性評價的基礎(chǔ)上，選取17份柿D.kaki栽培品種，包括8個典型的長果柿品種和9個典型的扁果柿品種（表1）。本研究所有樣品均在2021年和2022年的相同時間點進行觀察測定，果實縱徑、橫徑和單果鮮質(zhì)量在不同年份間無顯著差異，說明試驗基地管理水平規(guī)范，不同年份的氣候、營養(yǎng)等因素對果實表型影響不明顯。此外，果形指數(shù)主要受基因型控制，環(huán)境因素影響極微[34]，因此不同年份間同一品種的果形指數(shù)無差異符合理論預(yù)期。

本研究取樣時間包括從花冠完全脫落到果實達到商熟期的完整發(fā)育過程（5月16日—9月27日）。根據(jù)果實體積和單果鮮質(zhì)量的變化速率可將整個發(fā)育過程可分為三個主要階段：第一階段（7月14日前），所有品種的縱徑、橫徑、單果鮮質(zhì)量快速增加；第二階段（7月14日—8月14日），果實進入緩慢生長階段；第三階段（8月14日—9月27日）果實生長進入快速膨大期，該階段單果鮮質(zhì)量增加尤為明顯。因此，在整個取樣期，果實生長呈現(xiàn)快—慢—快的增長模式。研究結(jié)果與王立英[34]和韓振誠等[35]關(guān)于柿果實生長發(fā)育趨勢的研究基本一致，但是在柿果發(fā)育階段劃分上略有不同，這可能是由于地域和品種差異所致。

本研究系統(tǒng)分析了柿果完整生長發(fā)育期的表型指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)從5月16日—7月3日扁果橫徑生長速率高于縱徑，果實趨于扁平；而長果與之相反，縱徑生長速率高于橫徑，果實向長橢球形發(fā)展。在這個時間段，長果和扁果果形指數(shù)比例逐漸上升，表明二者果形差異逐漸增加。而7月3日二者比值達到最高點后基本趨于穩(wěn)定，這表明長果和扁果的果形差異在7月3日以后不會再出現(xiàn)較大變化。因此判定從5月16日—7月3日是長果和扁果果實形狀形成的關(guān)鍵時期，由此也進一步說明柿果實形狀形成主要發(fā)生在第一個快速膨大期（5月16日—7月14日），而非第二個快速膨大期（8月14日—9月27日）。

已有報道認為柿子縱向果實形狀的多樣性可能由細胞增殖方向決定，而不是由細胞形狀或伸長模式?jīng)Q定[10]，且KNAT1、STK基因和細胞分裂素在柿果實形狀生長發(fā)育中可能發(fā)揮了重要作用[6]。果實形狀形成的分子和生理調(diào)控關(guān)鍵期均應(yīng)在形態(tài)學(xué)關(guān)鍵期或更早的時期。因此，本研究所確定的柿果實形狀形成的形態(tài)學(xué)關(guān)鍵時期為進一步開展果形形成機理研究的關(guān)鍵采樣期選擇提供了依據(jù)，也為人工調(diào)控果實形狀的關(guān)鍵處理期選擇提供了參考。

本研究對柿果實形狀的表型性狀進行了觀測與分析，最終確定了柿果實形態(tài)學(xué)關(guān)鍵時期。本研究未進行柿果實形狀的機理闡述，研究內(nèi)容具有一定的局限性。下面將進一步開展關(guān)鍵時期的果實內(nèi)源激素測定，通過比較長果與扁果內(nèi)源激素的含量變化，分析激素含量對柿果實形成的關(guān)系。果實形狀主要由遺傳上多基因控制，補充基因挖掘相關(guān)試驗，從而篩選出調(diào)控柿果實形狀的基因。目前的研究以廣西桂林地區(qū)的油柿自然群體中的62份果形多樣的油柿單株為材料，利用全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）技術(shù)，挖掘出油柿的果形形成關(guān)鍵候選調(diào)控基因LCAT3（未發(fā)表的結(jié)果），該研究可為柿果實性狀形成與調(diào)控提供參考。