蛋白激酶C 參與調(diào)控小鼠腦皮層神經(jīng)元神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1 表達(dá)的初步研究

田佳，陳晶，陸萍，張?jiān)剑汉橛?/p>

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（Neuregulin 1，NRG1，Nrg1）在神經(jīng)發(fā)育和突觸可塑性中發(fā)揮重要作用[1-3]，其異常表達(dá)也與許多神經(jīng)精神疾病有關(guān)[4]，如精神分裂癥[5-8]、中風(fēng)[9-10]、抑郁癥[11-12]、阿爾茨海默病[13-14]、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥[15-16]、雙相情感障礙[17-18]等。根據(jù)5'端調(diào)控序列和鉸鏈可變區(qū)可分為六種亞型（Ⅰ-Ⅵ），這些亞型在不同組織中的分布和表達(dá)水平不同（其中Ⅰ-Ⅲ型表達(dá)量較大），功能也不同[1，4，6，19-21]。Ⅰ亞型Nrg1在精神分裂癥患者的前額葉皮層增加，可影響工作記憶[22-23]。

研究表明，向小鼠體內(nèi)注射海人藻酸或強(qiáng)迫運(yùn)動時，小鼠腦皮層組織的Nrg1 表達(dá)增加[24-25]。用海人藻酸或高濃度氯化鉀刺激體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元可使Nrg1 表達(dá)增加[20]。然而，尚不清楚通過γ－氨基丁酸（GABA）受體阻斷劑荷包牡丹堿（bicuculine，bic）引起的神經(jīng)活動是否也能增加Nrg1 及其主要亞型的mRNA 表達(dá)。如果可以，它與氯化鉀誘發(fā)的神經(jīng)活動引起的Nrg1 及其主要亞型表達(dá)增加的機(jī)制是否相同，研究試圖解釋這些問題，這有助于理解Nrg1及其主要亞型的功能，從而為神經(jīng)精神疾病的治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級C57BL/6 小鼠，單位倫理委員會的批準(zhǔn)文件號（SMKXJSXY2022010）。

1.1.2 主要藥品和試劑

DMEM-F/12 培養(yǎng)基、胎牛血清、神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基購自Gibco 公司。多聚賴氨酸、阿胞糖苷、青霉素、鏈霉素、氯化鉀、荷包牡丹堿、KN62、U0126、KT5720、Bis I 購 自Sigma-Aldrich 公 司。RNAiso Plus、PrimeScript RT Reagent Kit、SYBR Ex Taq 購自Takara 公司。所用引物于上海生物工程公司合成。

1.1.3 主要儀器

超凈工作臺（上海博訊）、二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Scientific）、熒光定量PCR 儀（Agilent Technologies Stratagene Mx3005P）。

1.2 方法

1.2.1 原代皮層神經(jīng)元培養(yǎng)

分離1 日齡的乳鼠腦皮層，在含有0.05%胰蛋白酶的培養(yǎng)基（DMEM-F/12）中37 ℃消化10 min。皮層神經(jīng)元經(jīng)500 g 離心10 min 后重新懸浮，再以高密度（8×105）接種于經(jīng)多聚賴氨酸（50 mg·m L-1）包被的12 孔板上。培養(yǎng)基成分為DMEM-F/12、10%胎牛血清（FBS）、青霉素和鏈霉素（100 U·m L-1）。5 h 后，將培養(yǎng)基換為添加B27 的神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基。3 d 后，加入5 mM 阿胞糖苷（AraC）以去除增殖的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。置于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換一半體積的培養(yǎng)基[20]。實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)14 d 的神經(jīng)元上進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)均按照實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例進(jìn)行。

1.2.2 藥物處理

在活動依賴性的Nrg1 表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)中，分別用氯化鉀（50 mM）或荷包牡丹堿（50 μM）處理培養(yǎng)14 d的小鼠皮層神經(jīng)元，0.5、1、3 和6 h 后提取RNA。在活動依賴性的Nrg1 表達(dá)機(jī)制探索實(shí)驗(yàn)中，用氯化鉀或荷包牡丹堿刺激前30 min 向體外培養(yǎng)的神經(jīng)元培養(yǎng)基中分別加入U0126（10 μM）以抑制絲裂原活化蛋白激酶，KT5720（10 μM）以抑制蛋白激酶A，KN62（10 μM）以抑制Ca2+/鈣調(diào)蛋白激酶，bis I（100 nM）以抑制蛋白激酶C。對于溶解在二甲基亞砜（DMSO）中的藥品，二甲基亞砜的最終濃度<0.1%。

1.2.3 RNA 提取和cDNA 合成

氯化鉀或荷包牡丹堿刺激神經(jīng)元后，按鞠憬等[26]報道的方法，用RNAiso Plus 分離總RNA，1 μg RNA通過PrimeScript RT Reagent Kit 試劑盒用于合成第一鏈cDNA。

1.2.4 實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)

所用引物按參考文獻(xiàn)［20］設(shè)計(jì)如下，NRG1-F：ACCAGCCATCTCATAAAGTGCG，R：TTGACGGGTTTGACAGGTCC；Ⅰ型NRG1 F：TCATCTTCGGGCGA GATGTCTG，R：CTCCTGGCTCTTCATTTCTTTCA；Ⅱ型NRG1 F：GAGACTGGCCGCAACCTCA，R：TGACTCCTGGCTCTTCATTTCTTT；Ⅲ型NRG1 F：GGACCCCTGAGGTGAGAACA，R：CAGTCGTCCATGTCGATGTGG。β-actin-F：CAGATGTGGATCAGCAAGCAGG，R：TTGTCAAAGAAAGGGTGTAAAACG。

在熒光定量PCR 儀iCycler （Agilent Technologies Stratagene Mx3005P）中使用SYBR 預(yù)混Ex Taq進(jìn)行實(shí)時RT-PCR。用β-actin 做內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法分析靶基因的mRNA 表達(dá)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)分析，多組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 神經(jīng)活動依賴的Nrg1 及其主要亞型的表達(dá)

用氯化鉀刺激體外培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元6 h時，Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 的表達(dá)增加（圖1a，1b），而Ⅱ型和Ⅲ型Nrg1 的表達(dá)不變（圖1c，1d）。荷包牡丹堿刺激6 h 時，Nrg1 和I 型Nrg1 的表達(dá)增加（圖2a，2b），Ⅱ型和Ⅲ型的表達(dá)不變（圖2c，2d）。

圖1 氯化鉀誘發(fā)的神經(jīng)活動依賴的Nrg1 及其主要亞型表達(dá)Fig.1 The expression of KCl-induced activity-dependent Nrg1 and its main isoforms

圖2 荷包牡丹堿誘發(fā)的神經(jīng)活動依賴的Nrg1 及其主要亞型表達(dá)Fig.2 Expression of bicuculline-induced activity-dependent Nrg1 and its main isoforms

2.2 PKC 參與氯化鉀誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元Nrg1 和1亞型Nrg1 mRNA 表達(dá)的上調(diào)

在體外培養(yǎng)14 d 的小鼠皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)基中分別加入Ca2+/鈣調(diào)蛋白激酶（CaMK）抑制劑KN62，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制劑U0126 ，蛋白激酶A（PKA）抑制劑KT 5720（KT）或蛋白激酶C（PKC）抑制劑bisⅠ（Bis），再加入氯化鉀刺激6 h 后，收集神經(jīng)元提取RNA。如圖3a 和圖3b，實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)KN62（KN）對氯化鉀刺激誘發(fā)的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 mRNA 表達(dá)沒有影響。因此，氯化鉀誘導(dǎo)的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 mRNA 的表達(dá)增加不依賴于Ca2+/鈣調(diào)蛋白激酶。加入絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制劑U0126 或蛋白激酶A（PKA）抑制劑KT 5720（KT）對氯化鉀誘導(dǎo)的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 mRNA 表達(dá)沒有影響，但蛋白激酶C（PKC）抑制劑bisⅠ（Bis）降低了氯化鉀誘導(dǎo)的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 mRNA 表達(dá)。

圖3 氯化鉀誘發(fā)的Nrg1 及1 亞型Nrg1 表達(dá)增加需要PKCFig.3 KCl-induced Nrg1 and Nrg1 type I expressions requires PKC

2.3 CAMK，MAPK 和PKC 通路參與荷包牡丹堿誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元Nrg1 和1 亞型Nrg1 mRNA表達(dá)的上調(diào)

如圖4a 和圖4b，Ca2+/鈣調(diào)蛋白激酶（CaMK）抑制劑KN62（KN）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制劑U0126 或蛋白激酶C（PKC）抑制劑bis Ⅰ（Bis）均可降低荷包牡丹堿誘導(dǎo)的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 的mRNA 表達(dá)，但蛋白激酶A（PKA）抑制劑KT 5720（KT）對荷包牡丹堿誘導(dǎo)的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 的mRNA 表達(dá)無影響。

3 討論

為了探討神經(jīng)活動是否可以引起Nrg1 及其主要亞型的表達(dá)變化，在體外培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元中，采用氯化鉀和荷包牡丹堿兩種不同的方式誘發(fā)神經(jīng)活動。研究發(fā)現(xiàn)活動依賴性表達(dá)變化的基因，如c-fos 可在神經(jīng)活動誘導(dǎo)后60 min 內(nèi)表達(dá)增加[27]，而腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）可在神經(jīng)活動誘導(dǎo)后360 min 表達(dá)增加[28]。首先，用氯化鉀（50 mM）引發(fā)的快速去極化刺激體外培養(yǎng)14 d 的小鼠皮層神經(jīng)元，在0.5、1、3 和6 h 分別收集神經(jīng)元，采用實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)分析Nrg1 及其主要亞型mRNA 水平的時間依賴性變化。發(fā)現(xiàn)高濃度氯化鉀刺激體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元6 h 時Nrg1 和Ⅰ亞型Nrg1 表達(dá)增加，這支持了前人報道[20]，而其他兩種主要亞型Ⅱ和Ⅲ型Nrg1 的表達(dá)保持不變。接下來又用GABA 受體的拮抗劑荷包牡丹堿（50 μM）處理神經(jīng)元，GABA受體的拮抗劑荷包牡丹堿可以通過去除GABA 能抑制導(dǎo)致神經(jīng)元的活性增強(qiáng)，從而觸發(fā)了另一種神經(jīng)活動[29]，同樣也發(fā)現(xiàn)了荷包牡丹堿刺激可引起Nrg1和I 型Nrg1 表達(dá)增加，但不能引起Ⅱ型和Ⅲ型Nrg1的表達(dá)變化。綜上，Nrg1 和I 型的表達(dá)具有神經(jīng)活動依賴性。

進(jìn)而探究神經(jīng)活動依賴的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 mRNA 表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。有研究表明：Ca2+/鈣調(diào)蛋白激酶（CaMK）在轉(zhuǎn)錄因子CREB 的快速磷酸化中起作用[30-31]，假設(shè)Ca2+/鈣調(diào)蛋白激酶（CaMK）可能介導(dǎo)Nrg1 和Ⅰ亞型Nrg1 的神經(jīng)活動依賴性的增加。用Ca2+/鈣調(diào)蛋白激酶（CaMK）抑制劑KN62 孵育體外培養(yǎng)14 d 的皮層神經(jīng)元，然后用氯化鉀刺激后分析Nrg1 和Ⅰ亞型Nrg1 mRNA 的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)Ca2+/鈣調(diào)蛋白激酶（CaMK）抑制劑KN62 不能降低氯化鉀誘導(dǎo)的Nrg1 和Ⅰ亞型Nrg1 mRNA 表達(dá)。因此，氯化鉀誘導(dǎo)的Nrg1 和Ⅰ亞型Nrg1 mRNA 的表達(dá)增加不依賴于Ca2+/鈣調(diào)蛋白激酶（CaMK）。探討其他典型的神經(jīng)元信號分子，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、蛋白激酶A（PKA）和蛋白激酶C（PKC）[32]是否與氯化鉀刺激引起的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 mRNA 表達(dá)增加有關(guān)。發(fā)現(xiàn)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制劑U0126或蛋白激酶A（PKA）抑制劑KT5720 預(yù)處理對氯化鉀誘導(dǎo)的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 mRNA 表達(dá)沒有影響，但蛋白激酶C（PKC）抑制劑bisⅠ（Bis）可降低氯化鉀誘導(dǎo)的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 mRNA 表達(dá)。綜上，氯化鉀誘導(dǎo)的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 mRNA 的表達(dá)是由PKC 介導(dǎo)的，而不是CaMK、MAPK 或PKA。

用類似的方法探討荷包牡丹堿誘導(dǎo)的Nrg1 和Ⅰ型mRNA 表達(dá)上調(diào)的機(jī)制，CaMK 激酶抑制劑KN62（KN）、MAPK 抑制劑U0126 或PKC 抑制劑bisⅠ（Bis）降低了荷包牡丹堿誘導(dǎo)的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1的mRNA 表達(dá)，但PKA 抑制劑KT5720 對荷包牡丹堿誘導(dǎo)的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 的mRNA 表達(dá)無影響。這提示PKC、CaMK 和MAPK 參與了荷包牡丹堿誘導(dǎo)的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 mRNA 的表達(dá)增加。

Ca2+/鈣調(diào)蛋白激酶（CaMK）是一種絲氨酸/蘇氨酸特性的蛋白激酶，可被鈣/鈣調(diào)蛋白復(fù)合物所調(diào)節(jié)。其中鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ（CaMK Ⅱ）具有多功能，在多種生物反應(yīng)中起重要作用。腦中約有1%～2%的鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ，在神經(jīng)系統(tǒng)中的主要作用包括神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)和糖原代謝等。蛋白激酶A激活后，催化亞基釋放，從而催化ATP 末端的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到蛋白底物的絲氨酸或蘇氨酸殘基上，進(jìn)而導(dǎo)致底物活性的變化。在神經(jīng)元中蛋白激酶A（PKA）參與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的基因表達(dá)，其機(jī)制是通過激活CREB，CREB 結(jié)合cAMP 反應(yīng)元件，從而改變基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成。此過程需要較長的時間（從幾個小時到幾天）。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一組絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，它能被不同類型的細(xì)胞外刺激（如神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子、激素、應(yīng)激等）激活，是信號入細(xì)胞核的重要傳遞者。在未受刺激的細(xì)胞內(nèi)，MAPK 為靜止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，MAPK 可被激活，發(fā)生逐級磷酸化。蛋白激酶C（PKC）也是具有多種功能的酶。在未受任何刺激的細(xì)胞中，蛋白激酶C 主要以非活性構(gòu)象分布在細(xì)胞質(zhì)中，遇第二信使時與細(xì)胞膜結(jié)合，進(jìn)而參與生物化學(xué)反應(yīng)調(diào)控；蛋白激酶C 也可以作用于細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，參與基因表達(dá)的調(diào)控。可通過兩種主要的途徑參與基因表達(dá)的調(diào)控。一種是通過激活磷酸化的級聯(lián)反應(yīng)，使絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）發(fā)生磷酸化，而磷酸化的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）又可將基因調(diào)節(jié)蛋白Elk-1 磷酸化，使之激活。Elk-1 激活后與血清反應(yīng)元件（SRE）結(jié)合，進(jìn)而與血清反應(yīng)因子（SRF）共同調(diào)節(jié)基因表達(dá)。另一種可能參與基因表達(dá)調(diào)控的方式是其磷酸化后激活抑制蛋白IκB，釋放基因調(diào)節(jié)蛋白NF-κB，使之進(jìn)入細(xì)胞核從而激活特定的基因轉(zhuǎn)錄[30-32]。根據(jù)上述結(jié)果，蛋白激酶C 參與神經(jīng)活動依賴的Nrg1 及1 型Nrg1 的表達(dá)增加可能是通過NFκB 途徑，有待進(jìn)一步研究。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，單個神經(jīng)元可接受數(shù)千個突觸的輸入，神經(jīng)活動誘發(fā)相關(guān)的基因表達(dá)，從而使細(xì)胞對外界刺激作出反應(yīng)。神經(jīng)活動依賴的基因突變與人類認(rèn)知功能障礙有關(guān)，在神經(jīng)發(fā)育異常或精神障礙的人群中，需要環(huán)境信息的輸入（如語言交流）或依賴環(huán)境的適應(yīng)（如學(xué)習(xí)）活動通常出現(xiàn)異常，這表明神經(jīng)活動依賴性的神經(jīng)元適應(yīng)的失調(diào)可能是這些疾病的發(fā)病機(jī)制。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（Neuregulin 1，Nrg1）在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、突觸可塑性以及神經(jīng)精神疾病中發(fā)揮重要作用，對缺血性腦損傷具有保護(hù)作用[9-10]。小鼠前額葉皮層中神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1 下調(diào)可產(chǎn)生抑郁樣行為[11]，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1 可介導(dǎo)氯胺酮的急性、持續(xù)抗抑郁作用[12]，過表達(dá)I 型神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1 的基因治療，可以保護(hù)肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥小鼠脊髓中的運(yùn)動神經(jīng)元，從而改善后肢肌肉的運(yùn)動功能，延遲臨床疾病發(fā)生[16]。血漿的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1 可作為阿爾茨海默病臨床檢測的標(biāo)志物[14]。精神分裂癥患者的前額葉皮層I 亞型神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1 表達(dá)增加[22]，在基因治療精神分裂癥以及與發(fā)育相關(guān)的精神疾病方面具重大潛力[33]。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1 以及1 型神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1 的mRNA 表達(dá)是神經(jīng)活動依賴性的。蛋白激酶C（PKC）同時參與了氯化鉀和荷包牡丹堿誘發(fā)的兩種不同的神經(jīng)活動依賴的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1 和I 型神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1 的mRNA 表達(dá)增加，其蛋白表達(dá)水平有待進(jìn)一步探索。這將有助于深入了解大腦的正常發(fā)育和可塑性，并理解認(rèn)知功能障礙相關(guān)疾病的病因，可為這些神經(jīng)精神疾病的治療提供新思路。

哺乳動物和人的大腦由許多具有不同解剖學(xué)、電生理學(xué)和轉(zhuǎn)錄組特征的細(xì)胞類型組成。用RNA 測序技術(shù)可高通量的識別胚胎興奮性或抑制性神經(jīng)元的神經(jīng)活動依賴的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，在刺激后的60 min 內(nèi)，興奮性和抑制性神經(jīng)元表達(dá)的基因還包括活動依賴性轉(zhuǎn)錄因子如Egr1、Fos、Fosb、Npas4 等[34]。使用核糖體標(biāo)記技術(shù)從體內(nèi)特定神經(jīng)元亞型中分離的mRNA，可揭示不同亞型的抑制性神經(jīng)元〔如前腦的小白蛋白（PV）中間神經(jīng)元、生長抑素（SST）中間神經(jīng)元和血管活性腸肽（VIP）中間神經(jīng)元〕中獨(dú)特的神經(jīng)活動依賴性的基因表達(dá)[35-37]。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1 在不同腦區(qū)（皮層、海馬、杏仁核等）、不同細(xì)胞類型（如PV 中間神經(jīng)元、SST 中間神經(jīng)元和VIP 中間神經(jīng)元等）、不同時間的表達(dá)比較復(fù)雜，可能與其不同的功能有關(guān)，需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

在體外培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元中，氯化鉀和荷包牡丹堿兩種神經(jīng)活動可引起Nrg1 及1 型Nrg1 的表達(dá)增加。PKC 參與氯化鉀誘導(dǎo)的小鼠皮層神經(jīng)元Nrg1 和1 亞型Nrg1 mRNA 表達(dá)的增加，而CAMK，MAPK 和PKC 參與荷包牡丹堿誘導(dǎo)的小鼠皮層神經(jīng)元Nrg1 和1 亞型Nrg1 mRNA 表達(dá)的增加。