一例奶牛氣腫疽猝死病例的實驗室診斷和分析

苑鳳婷，孫斌

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

反芻動物氣腫疽又名黑腿病、爛腿黃或鳴疽，是由于感染氣腫疽梭菌（Clostridium chauvoei）所引起的急性、高熱性傳染病。氣腫疽梭菌是一種革蘭氏陽性、產(chǎn)芽孢厭氧菌，具有很強(qiáng)的溶血活性。這種微生物產(chǎn)生至少五種可溶性抗原（毒素），包括氧穩(wěn)定的溶血素（α）、DNA 酶（β）、透明質(zhì)酸酶（γ）、氧不穩(wěn)定溶血素和神經(jīng)氨酸酶，這些毒素與氣腫疽梭菌的致病性有關(guān)[1]。按壓時腫脹部位有捻發(fā)音，有人也將其叫做“鳴疽”[2]。特征性臨床癥狀表現(xiàn)為在動物體肌肉豐滿處出現(xiàn)炎性氣性腫脹，多伴有跛行，嚴(yán)重時危及生命。反芻動物通過攝入存在于土壤中暴露的病原體氣腫疽梭菌孢子，然后誘導(dǎo)細(xì)胞壞死、水腫和發(fā)熱，隨后出現(xiàn)跛行和死亡[3]。氣腫疽病是一種引起牛、羊和其他家畜肌肉壞死的敗血癥傳染病，死亡率高，在畜牧生產(chǎn)中造成相當(dāng)大的損失。雖然氣腫疽梭菌通常被認(rèn)為是反芻動物特有的，但已有氣腫疽梭菌引起人類疾病的報道。氣腫疽病是一種高度致死的敗血性傳染病，世界各地均有分布，發(fā)病率和死亡率均非常高，在干燥炎熱的季節(jié)發(fā)病率高[4]。近年，春冬之際也有牛感染氣腫疽發(fā)病死亡。氣腫疽雖然常發(fā)于牛、綿羊和馬，但在豬、山羊、犬和貓等其它種類動物上也有發(fā)生。在實驗動物當(dāng)中豚鼠最易感染。據(jù)國外學(xué)者研究，氣腫疽在駱駝、印度象等一些野生動物的易感率上也比較突出，而且感染不受日齡限制[5]。至今為止，氣腫疽病在我國多個地區(qū)以地方性流行趨勢發(fā)病。當(dāng)所處周圍環(huán)境十分惡劣，氣腫疽梭菌可形成具有很強(qiáng)存活力的芽孢，在菌體中間或頂端部位，用以抵抗周圍不利環(huán)境，這種極端的抵抗促成了芽孢的自發(fā)產(chǎn)生，有助于孢子在環(huán)境中生存并維持一定的數(shù)量，甚至包括食品工業(yè)。環(huán)境中無處不在的各類物種的孢子，它們通常會污染食品，許多物種的孢子以食物腐敗和食源性疾病為載體。因此，食品工業(yè)投入大量資源來消除孢子用以使食物無菌，特別是用以消除極其危險的孢子，例如肉毒桿菌等。作為專性厭氧菌，梭菌病原體依靠其代謝休眠、耐氧的孢子來傳播疾病。然而，這些孢子萌發(fā)引起感染然后形成新的孢子，傳播感染疾病的分子機(jī)制，仍然知之甚少。雖然在枯草芽孢桿菌和炭疽芽孢桿菌中孢子形成和萌發(fā)已經(jīng)得到很好的表征，但在芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌之間觀察到這些過程的調(diào)節(jié)存在顯著差異，甚至一些保守蛋白質(zhì)在它們的需求和功能上也表現(xiàn)出差異[6]。

東北某奶牛養(yǎng)殖戶2019 年11 月份在3 d 內(nèi)5頭奶牛先后突然死亡。生前無明顯異常癥狀，期間未投喂任何中毒藥物與有害草料，水源檢查并未發(fā)現(xiàn)任何有害成分。未接種任何疫苗。死亡牛全為黑白花經(jīng)產(chǎn)奶牛，具體年齡不詳，食用同批草料。沒有進(jìn)食這批草料的牛沒有發(fā)生死亡。除草料外，牛群的其它飼料、飲水、圈舍都相同。雖然天氣很冷，但牛死后仍迅速臌氣。牛群中所有牛都未曾接種過氣腫疽梭菌疫苗。病死牛采食的草料來源于上凍時從低洼地收割而來。實驗通過對采集病料進(jìn)行實驗室分離培養(yǎng)后，設(shè)計目的基因引物并經(jīng)PCR 擴(kuò)增，得到的細(xì)菌DNA 片段與目的基因片段比較觀察是否匹配。最終判定致病菌的種類。

1 材料和方法

1.1 培養(yǎng)基

新鮮10%的綿羊血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、上下游引物與瓊脂糖購自上海生工；其它常用分子生物學(xué)試劑與儀器設(shè)備由檢測實驗室提供。

1.2 試劑盒

Premix Taq 和DNA Marker（2 000）購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購自杭州愛思進(jìn)生物有限公司。

1.3 細(xì)菌分離鑒定

無菌采集病死牛皮下組織、肌肉、心肌、肝臟、腎臟、腸組織、腸內(nèi)容物和腹腔液，放入無菌離心管中。新鮮10 %的綿羊血營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基按常規(guī)方法在實驗室制備[7-8]。其它常用試劑與儀器設(shè)備由檢測實驗室提供。將采集的皮下組織、肌肉、心肌、肝臟、腎臟、腸組織、腸內(nèi)容物和腹腔液依次接種于已經(jīng)標(biāo)記好的血瓊脂培養(yǎng)基，在焦性沒食子酸和氫氧化鈉反應(yīng)缸內(nèi)完全厭氧環(huán)境里進(jìn)行培養(yǎng)[9]。

1.4 PCR 檢測

參考Lane 等[10]研究報道，擴(kuò)增所分離細(xì)菌DNA利用合成擴(kuò)增細(xì)菌16 S rDNA 的通用引物。引物設(shè)計如下：

上游引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'8-27

下游引物5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'1512-1492

16 S rDNA 分子的大小適中，具有普遍性和高度保守性的功能和結(jié)構(gòu)，以其保守區(qū)進(jìn)行參照，設(shè)計出PCR 通用引物，進(jìn)而擴(kuò)增出所有細(xì)菌的16 S rDNA片段。如果依照可變區(qū)設(shè)計特異性引物，則可對不同的細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理剖檢

病死牛尸體臌脹明顯，從口鼻內(nèi)有淡紅色泡沫液體流出，陰道、肛門侈開。全身皮下炎性水腫、氣腫，呈黃色膠凍狀，肌間組織氣腫呈蜂窩狀。按壓體表腫脹部位有捻發(fā)音。心肌表面與切面紅染，煮肉樣壞死。肺淤血水腫，氣管粘膜出血紅染。肝被膜緊張、邊緣鈍圓，彌漫性壞死，膽囊腫大充盈綠色膽汁。腎臟被膜緊張、表面光滑濕潤粥樣且紅染，皮質(zhì)部出血壞死。脾臟柔軟，腹腔積液淡紅色半透明。剖檢變化見圖1。

圖1 奶牛尸體剖檢變化Fig.1 Changes in necropsy of dairy cows

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

在血瓊脂培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)24 h 后，血瓊脂培養(yǎng)基表面可見透明且具有β 溶血的菌落（圖2A），光學(xué)顯微鏡下觀察呈桿狀，革蘭氏染色陽性（圖2B），無莢膜，無芽孢。

圖2 細(xì)菌培養(yǎng)與染色Fig.2 Bacterial culture and staining

2.3 PCR 檢測結(jié)果

經(jīng)PCR 擴(kuò)增，得到的細(xì)菌DNA 片段1 600 bp左右，與氣腫疽梭菌目的基因片段相符（圖3）。

圖3 分離菌株16 S rDNA PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of the isolated strain 16 S rDNA

3 討論

3.1 臨床診斷與治療

關(guān)于氣腫疽病感染的發(fā)病機(jī)制尚無共識，但發(fā)病機(jī)制是由致病細(xì)菌產(chǎn)生的毒素和神經(jīng)氨酸酶起重要作用。毒素和神經(jīng)氨酸酶在氣腫疽病感染的發(fā)病機(jī)制和病理學(xué)中的作用以及神經(jīng)氨酸酶抑制劑在疾病臨床治療中的作用十分重要。傳統(tǒng)病原學(xué)檢查、生化鑒定、血清學(xué)、免疫學(xué)檢測、動物實驗等都可用于氣腫疽病的臨床診斷，可這些方法都存在時間長、特異性和敏感性不高等一系列問題[12]。牛和羊的氣腫疽病已經(jīng)有成熟的疫苗體系，該疫苗由完整的滅活細(xì)菌和化學(xué)試劑培養(yǎng)上清液組成。目前，鞭毛是唯一有證據(jù)表明其參與誘導(dǎo)針對氣腫疽病的保護(hù)性免疫，并在毒力中起作用的特定抗原。此外，假定氣腫疽梭菌產(chǎn)生5 種毒素，包括氧穩(wěn)定溶血素、氧不穩(wěn)定溶血素、脫氧核糖核酸酶（DNase）、透明質(zhì)酸酶和神經(jīng)氨酸酶。最近發(fā)現(xiàn)了一種27 kDa 的溶血素從氣腫疽梭菌株C6H 中純化，但未進(jìn)一步表征。這些毒素在氣腫疽梭菌毒力中的作用尚不清楚[13]。在給豚鼠和公牛分別注射毒素后，研究了氣腫疽梭菌毒素在氣腫疽病感染的發(fā)病機(jī)制和病理學(xué)中的作用，結(jié)果顯示毒素在氣腫疽病感染的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。顯微鏡下注射動物的肌肉變得透明化，受影響肌肉有輕度壞死和中性粒細(xì)胞浸潤。注射毒素的公牛血管退化、壞死、滲入少量中性粒細(xì)胞并形成血栓，表明梭狀芽孢桿菌毒素可以通過改變起血管內(nèi)皮作用。公牛腘窩淋巴結(jié)呈粉紅色均勻物質(zhì)，淋巴濾泡中心有壞死和中性粒細(xì)胞浸潤白細(xì)胞。脾臟中的小體增生，這歸因于毒素引發(fā)的體液免疫反應(yīng)。肝臟和腎臟的充血、出血和退化病灶也歸因于毒素。感染后1 到3 天，當(dāng)將整個細(xì)菌注射到牛體內(nèi)時，白細(xì)胞和血小板顯著減少，觀察到的白細(xì)胞減少和血小板減少是由于破壞了外周血中的白細(xì)胞和血小板由體內(nèi)細(xì)菌產(chǎn)生的毒素[14]。這些發(fā)現(xiàn)與之前的報道相符。

隨著生物技術(shù)的成熟，云巾宴等[15]分別以nanA、fliA（C）、cctA 作為靶向基因用以檢測PCR，根據(jù)其敏感性、特異性等方面進(jìn)行比較，用來篩選出對反芻動物氣腫疽梭菌感染更加高效的PCR 檢測法，其結(jié)果顯示，以cctA 作為靶向基因的PCR 檢測方法敏感性和特異性都更加高效?？梢哉J(rèn)為PCR 為氣腫疽的診斷提供了特異、敏感的快速檢測技術(shù)。感染氣腫疽病最為有效的治療辦法是及時確診，并且盡早通過靜脈或腹腔注射抗氣腫疽的高免血清，在此過程中要注射大劑量青霉素[16]。大量的臨床試驗已經(jīng)證明，血清療法在治療白喉和破傷風(fēng)等疾病十分有效，治療機(jī)制是由于神經(jīng)通過特異性抗體對毒素進(jìn)行追蹤。隨后，血清療法被用于治療病毒和細(xì)菌性疾病，血清療法的臨床作用不僅針對毒素介導(dǎo)的細(xì)菌感染，例如白喉和炭疽，同時也適用于肺炎鏈球菌引起的疾病葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、嗜血桿菌b 型流感和腦膜炎奈瑟菌?？股匾牒?，由于抗生素更容易制造且有活性一致，毒性較小，跟多的應(yīng)用于細(xì)菌感染的治療上[17]。已知細(xì)菌會產(chǎn)生溶血素，它可以溶解來自各種動物的紅細(xì)胞。研究表明，與缺乏溶血素的細(xì)菌相比，產(chǎn)生溶血素的細(xì)菌對動物的毒性更大[18]。因此，氣腫疽梭菌產(chǎn)生的溶血素被懷疑是主要的毒力因子，關(guān)于氣腫疽梭菌溶血素的產(chǎn)生和表征的報道很少。

3.2 調(diào)查與診斷

三天內(nèi)多頭奶牛先后突然死亡且生前無異常癥狀，牛死后仍迅速臌氣。尸體剖檢有可見多組織器官急性敗血癥變化；微生物培養(yǎng)有β 溶血的革蘭氏染色陽性桿菌。臨床癥狀與尸體剖檢病理變化提示有氣腫疽梭菌感染的可能。牛群中所有牛都未曾接種過氣腫疽梭菌疫苗，PCR 檢測得到的細(xì)菌DNA 片段約1 600 bp 左右，與氣腫疽梭菌相符。結(jié)果表明，經(jīng)臨床觀察、流行病學(xué)問詢、尸體剖檢、細(xì)菌培養(yǎng)和PCR 檢測，死亡原因可確診為氣腫疽梭菌病。病原來源可能就是上凍時從低洼地收割回來的草料，應(yīng)當(dāng)對此飼草做病原分離鑒定，以確定病原菌的來源。

3.3 危害性分析

氣腫疽病可在土壤里存活時間長達(dá)5 年，而且在腐敗尸體內(nèi)可存活3 個月。病原體常附著于草料或土壤上，當(dāng)反芻動物進(jìn)食或者通過圈舍圍欄等設(shè)施的接觸后，利用消化道或者皮膚傷口進(jìn)入體內(nèi)進(jìn)而發(fā)生感染發(fā)病，最終發(fā)展為持久傳染源。這對野外放牧反芻動物有很大的威脅[19]。許多厭氧產(chǎn)芽孢梭菌物種是致病的，其中一些應(yīng)用在工業(yè)生產(chǎn)上。盡管許多是嚴(yán)格的厭氧菌，但細(xì)菌在需氧和生長限制條件下作為多層代謝休眠孢子持續(xù)存在。對于許多病原體來說，孢子形式是最常見在宿主之間傳播生物體的形式。將孢子引入宿主后，某些蛋白質(zhì)識別特定信號，誘導(dǎo)孢子萌發(fā)并隨后長成代謝活躍的細(xì)胞。當(dāng)孢子萌發(fā)成具有代謝活性的營養(yǎng)形式時，由此產(chǎn)生的細(xì)菌可以定殖宿主，并由于細(xì)胞分泌毒素而引起疾病。孢子對許多環(huán)境壓力源具有抵抗力，這使得它們難以從臨床環(huán)境中去除。確定產(chǎn)生毒素物種的萌發(fā)條件和機(jī)制，可以通過抑制孢子的萌發(fā)來幫助開發(fā)負(fù)擔(dān)得起的治療某些感染的藥物。與傳染病無關(guān)，用于化學(xué)品工業(yè)生產(chǎn)的物種中的孢子，阻礙了化學(xué)品的最佳生產(chǎn)，因為種群中的營養(yǎng)細(xì)胞耗盡。了解丙酮—丁醇—乙醇生產(chǎn)物種中的孢子萌發(fā)有助于促進(jìn)化學(xué)品的生產(chǎn)，從而產(chǎn)生更便宜的乙醇燃料。直到最近，梭菌的孢子萌發(fā)被認(rèn)為與枯草芽孢桿菌的萌發(fā)相似[20]。

在孢子形成過程中，啟動從代謝休眠狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榇x活躍狀態(tài)所需的因素被構(gòu)建到孢子中。當(dāng)孢子響應(yīng)環(huán)境信號時，會刺激萌發(fā)。刺激萌發(fā)的信號可以是各種小分子，這些萌發(fā)劑通過與特定的萌發(fā)受體結(jié)合來激活萌發(fā)。在大多數(shù)孢子形成生物中迄今為止研究過，活化的萌發(fā)受體將信號傳播到對于從核心釋放二苯胺（DPA）重要的通道，并使皮質(zhì)退化。皮質(zhì)降解導(dǎo)致核心腫脹和進(jìn)一步水合。最后，從萌發(fā)的孢子中長出一個營養(yǎng)細(xì)胞，研究主要是在芽孢桿菌中進(jìn)行的[21]。盡管處于休眠狀態(tài)，但孢子對使用信號特異性蛋白質(zhì)刺激恢復(fù)營養(yǎng)生長作出反應(yīng)。通常，萌發(fā)劑是在有利于生物體生長的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的低分子量生物分子。最常見的萌發(fā)劑是氨基酸，但其他分子（例如，基于膽固醇的化合物、有機(jī)酸、核苷、肽聚糖片段等）已被鑒定。雖然一些孢子的萌發(fā)可以由一個簡單的萌發(fā)劑觸發(fā)，但一些孢子需要存在不止一種類型的分子來刺激萌發(fā)。與在芽孢桿菌中觀察到的相似，梭狀芽胞桿菌中最常見的萌發(fā)劑是L-丙氨酸。L-丙氨酸作為許多孢子形成生物的首選萌發(fā)劑的原因尚不清楚，但可能與肽聚糖120 的保守性有關(guān)構(gòu)體[22]。氣腫疽病在感染生物體的過程中，孢子的萌發(fā)至關(guān)重要，使孢子從休眠狀態(tài)變?yōu)榛钴S狀態(tài)進(jìn)而感染細(xì)胞。

氣腫疽病在1870 年首次報道?，F(xiàn)有報告表明，豬、貂、淡水魚、威爾士和青蛙易受感染，雖然人類、鳥類、貓、狗和兔子被認(rèn)為對它有抗藥性，但這種細(xì)菌已從貓和狗的傷口和母雞的傷口分離出來，疫苗接種是最可靠的預(yù)防疾病的方法。1929 該病在尼日利亞報道，并且一直是該國牛群的主要問題。雖然疫苗接種沒有中斷過，但每年都有零星的病例爆發(fā)記錄。該疾病在尼日利亞被列為“A 類疾病”，是該國牛年死亡率高的疾病之一。由于氣腫疽梭菌病造成的經(jīng)濟(jì)損失尚未量化，但考慮到由此造成的反芻動物的高年死亡率，它的經(jīng)濟(jì)損失十分巨大。2006年，日本千葉縣報道了全球首例人類感染氣腫疽菌死亡病例之后，2011 年美國也發(fā)布了人感染氣腫疽梭菌死亡病例。由此使得該病迅速被各國人醫(yī)和獸醫(yī)列為共同關(guān)注和研究的焦點。這預(yù)示著氣腫疽梭菌病不但給動物健康安全造成了巨大的危害，同時也逐漸地影響到公共衛(wèi)生安全，進(jìn)而威脅到人類的健康和安全[23]。

3.4 防控措施

對動物進(jìn)行系統(tǒng)性接種疫苗和類毒素組合疫苗是最有效的控制氣腫疽病的措施，可以明顯降低發(fā)病率和死亡率。應(yīng)從低日齡的動物開始進(jìn)行疫苗接種，于4~6 周后再接種免疫，至少每年要加強(qiáng)免疫接種疫苗一次[24]。疫苗大大減輕了傳染病的負(fù)擔(dān)，在降低全球死亡率方面僅次于清潔飲用水。免疫是一種具有成本效益的策略，不僅可以保護(hù)接種疫苗的個體，還可以通過產(chǎn)生群體免疫間接保護(hù)周圍環(huán)境[25]。應(yīng)該建立系統(tǒng)的疫病防御措施，早期預(yù)警系統(tǒng)是預(yù)防傳染病傳播的基礎(chǔ)，風(fēng)險評估方法和其他臨時建模技術(shù)，很大程度上可以有效預(yù)測傳染病在不同地理區(qū)域引入和傳播的概率。在此過程中，必須建立有效的信息系統(tǒng)，在發(fā)生流行病緊急情況時協(xié)助獸醫(yī)服務(wù)，支持迅速采取措施來控制感染，減少負(fù)面后果的嚴(yán)重程度[26]。同時積極宣傳對氣腫疽病的防控知識，讓人們認(rèn)識到其危害、掌握基本的防治措施。做好環(huán)境、器具設(shè)施、圈舍、運(yùn)輸工具的消毒?；疾游铩⒖梢蓜游锛皶r隔離治療或撲殺，病死動物應(yīng)按國家標(biāo)準(zhǔn)實施深埋、焚燒等無害化處理[27]。對患病及死亡動物已經(jīng)污染圈舍、周圍牧道、排泄物及被污染的草場、畜群養(yǎng)殖場及周邊設(shè)施進(jìn)行徹底消毒以及無害化處理。不到疫區(qū)去放牧、收草，不使用被患病動物污染的器具。被污染的草場、畜群養(yǎng)殖場及周邊設(shè)施嚴(yán)格消毒后，短時間內(nèi)（5 年）禁嚴(yán)任何畜群入內(nèi)。嚴(yán)格規(guī)范疫苗接種、無菌操作。畜群有發(fā)病現(xiàn)象時應(yīng)該馬上采取全面封閉、逐個排查，患病動物進(jìn)行嚴(yán)格的封閉隔離診治，對疑似病例實施嚴(yán)密監(jiān)視，患病及病死動物嚴(yán)禁私自轉(zhuǎn)移或販賣食用。沒有患病的畜群緊急接種氣腫疽梭菌疫苗。發(fā)現(xiàn)氣腫疽疫情，立即將疫情信息上報到相關(guān)獸醫(yī)主管部門。

從多方面對氣腫疽病進(jìn)行疫病的防御和管控，及時在未發(fā)病的臨近地帶做好檔案記載和疫苗接種，以防突然發(fā)病，并做好防范措施。在已經(jīng)發(fā)病的區(qū)域，做好隔離、診治、撲殺、掩埋和封鎖，并且做好檔案記錄，歸納總結(jié)出快速的疾病應(yīng)急方案，為今后的疫病防治打好基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本次病例發(fā)生在寒冬季節(jié)，經(jīng)現(xiàn)場觀察、流行病學(xué)調(diào)查、病死牛臨床癥狀觀察、病死牛尸體剖檢、微生物培養(yǎng)和分子生物學(xué)檢查等確診為奶牛氣腫疽病。