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    鹽酸川芎嗪對冷暴露小鼠肝臟中解偶聯(lián)蛋白1 表達的影響

    2023-11-24 10:14:28孟凡舜李仕韋夏榕鴿趙天睿劉鼎鑫李鵬
    關鍵詞:小鼠

    孟凡舜,李仕韋,夏榕鴿,趙天睿,劉鼎鑫,李鵬

    (黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院,大慶 163319)

    對于我國北方高寒地域的動物,特別是對新生的動物而言,冷應激是較為常見的一種應激源。在北方高寒地域,初春的雛雞孵化、初春末秋的母豬產(chǎn)崽以及冬天的母牛產(chǎn)犢等,冷應激對于畜牧業(yè)的迅速發(fā)展都是需要重視的必要環(huán)節(jié)[1]。然而,由低溫環(huán)境所引起的冷應激往往會導致動物生長速度減慢、抗病能力變差,甚至導致動物死亡等問題。嚴重的冷應激會對動物產(chǎn)生較大的影響,除了會降低其生產(chǎn)性能,還可引發(fā)動物呼吸系統(tǒng)疾病,甚至導致動物死亡[2]。即使動物適應冷應激后,也會引起基礎代謝率和采食量提高,導致動物的能量儲備及生產(chǎn)性能有所降低,進而影響生產(chǎn)效益。綜上可知,低溫環(huán)境所引起的冷應激是影響我國北方畜牧業(yè)發(fā)展的重要因素之一。

    動物體內的能量資源不是無限的,當體內某一系統(tǒng)所需能量增加時,為適應自身變化,機體會對自身能量的利用進行重新分配,以維持自己的生命。當外界溫度降低時,恒溫動物首先通過非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱來增加產(chǎn)熱,當達到臨界點時,就會發(fā)生戰(zhàn)栗。作為三大營養(yǎng)物質的糖類、脂肪和蛋白質是機體熱量的主要來源。而肝臟是許多生理過程的關鍵樞紐,作為機體內物質代謝最旺盛的器官,它也是機體主要的產(chǎn)熱器官之一。肝臟與三大營養(yǎng)物質代謝之間存在著十分密切的關系,它是糖異生、調節(jié)血糖濃度以及將體內糖轉化為脂肪的主要器官,并在脂類代謝過程中發(fā)揮著重要作用,同時肝臟內蛋白質的代謝也很活躍。在進食時,肝臟以糖原形式儲存葡萄糖,空腹時則通過糖異生途徑組裝葡萄糖,肝臟能夠氧化脂肪,也可將多余的脂肪進行包裝,以分泌和儲存到其他組織,肝臟還負責血液中分泌的大多數(shù)蛋白質,能夠處理用于能量的氨基酸,還可通過以尿素新陳代謝的形式處理蛋白質降解所產(chǎn)生的含氮廢物[3]。當機體處于寒冷環(huán)境中時,肝臟的代謝活動會有所增強,以此提高機體熱量,同時也為骨骼肌的戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱提供能量。因此,在處于寒冷環(huán)境的情況下促進肝臟產(chǎn)熱對動物機體抵御低溫環(huán)境具有重要意義。

    川芎,傘形科藁本屬植物,在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品,又名香果,其性溫,味辛,常用于活血行氣、祛風止痛,在散偏湯、四物湯、溫經(jīng)湯等方劑中均可見其身影。川芎中所含化學成分眾多,如川芎嗪、阿魏酸、藁本內酯、丁基苯酞等。川芎嗪(ligustrazine,TMP)是從中草藥川芎中分離得到的一種活性生物堿,化學名稱為2,3,5,6-四甲基吡嗪,于1957 年首次被分離,具有2000 多年的廣泛藥用歷史。在我國川芎嗪被廣泛用于心腦血管疾病,至今已有40 多年的歷史,同時由于其對機體多個系統(tǒng)均表現(xiàn)有效性,而受到了廣泛關注[4]。在過去的幾十年里,研究人員探索了TMP 在各種疾病中的藥理作用,例如心腦血管缺陷[5-6]、脂肪肝[7-8]、胰腺炎[9]、Ⅱ型糖尿病[10-12]及癌癥[13-15]等,驗證了其保護肝臟和腎臟[16-17]、抗氧化[18]、抗炎[19]及抗腫瘤活性[20]等作用。

    鹽酸川芎嗪是川芎嗪最常用的藥物制劑,在臨床中具有良好的使用效果,穩(wěn)定性更好,半衰期較川芎嗪更長和副作用較小等特點。介于上述背景,鹽酸川芎嗪在冷暴露中尚未有研究。因此,試驗選擇鹽酸川芎嗪作為治療藥物,探究其在冷暴露條件下對小鼠肝臟產(chǎn)熱能力的影響,為提高畜禽冬季抗寒能力提供一定參考。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑及儀器

    4%多聚甲醛、蘇木精染色劑、伊紅染色劑、油紅O 染色試劑盒、RIPA 裂解液、PMSF 蛋白酶抑制劑、BCA 蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、SDS-PAGE 制膠試劑盒、SDA-PAGE 蛋白上樣緩沖液(5X)購自上海碧云天公司;蛋白marker、底物發(fā)光液、PVDF 膜購自美國MILLIPORE 公司;UCP1 兔多克隆抗體、β-Tublin 鼠單克隆抗體、HRP 標記的山羊抗兔IgG 和山羊抗鼠IgG 購自美國Proteinch 公司。

    1.2 實驗動物

    4 周齡雄性SPF 級C57BL/6J 小鼠購自遼寧長生生物技術股份有限公司。將其隨機分為常溫對照組(N 組)、冷暴露組(CN 組)、冷暴露+50 mg·kg-1鹽酸川芎嗪組(C50 mg·kg-1組)以及冷暴露+100 mg·kg-1鹽酸川芎嗪組(C100 mg·kg-1組),每組10 只,晝夜交替光照12 h,自由飲水,室溫(26±1)℃預飼一周后對加藥組小鼠進行相應濃度的灌胃,灌胃組在灌胃結束后與冷暴露組一起每天置于4 ℃人工氣候室中冷刺激3 h,4 周后處死小鼠,并采集肝臟組織。

    1.3 HE 染色

    將肝臟組織固定于4%多聚甲醛緩沖液,置于包埋盒中,流水沖洗30 min,利用不同濃度的酒精脫水,在二甲苯溶液中使組織透明后,將透明組織放在石蠟中,包埋后進行切片。染色前,采用二甲苯溶液脫蠟后,放入從高到低濃度的酒精中,再用蒸餾水清洗。將切片置于蘇木精染液中幾分鐘,然后放于鹽酸乙醇和氨水中各30 s 進行分色,再用伊紅染色液染色2~3 min,再通過不同濃度的酒精脫水,利用二甲苯溶液透明后封片。在×200 放大倍率下觀察各組肝臟是否有損傷。

    1.4 油紅O 染色

    取肝臟組織,將其包埋在OCT 化合物中,并置于-80 ℃條件下保存。利用冰凍切片機以10 μm 的厚度切割組織。采用異丙醇配制0.5%的油紅O 原液,工作濃度60%用DDH2O 稀釋。用60%異丙醇對切片進行洗滌,用油紅O 工作液染色1 h,染色完成后用自來水沖洗切片20 min。在×200 放大倍率下對各組肝臟中脂滴數(shù)量進行觀察。

    1.5 UCP1 免疫組織化學法檢測

    將固定后的肝臟組織進行固定和脫水處理,將處理后的組織包埋在石蠟中,包埋后的肝臟組織用切片機切成5 μm 厚的切片,將處理后的切片進行脫蠟和抗原修復。處理完畢后,對切片進行血清封閉然后加一抗4 ℃孵育過夜。一抗孵育結束后加入二抗37 ℃孵育30 min,二抗孵育結束后加入SABC 37 ℃孵育30 min,孵育結束后加入顯色劑,將顯色后的切片加入蘇木精復染,復染結束后進行脫水和封片。

    1.6 UCP1 蛋白表達水平的檢測

    用RIPA 提取肝臟組織中的總蛋白質,提取后在4 ℃和12 000RCF 的條件下離心10 min。離心結束后收集上清液用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,加入上樣緩沖液使其變性。將每個樣品等量的加入SDS-PAGE 凝膠上并進行電泳。電泳后,將蛋白轉移至PVDF 膜上,用5%脫脂奶粉封閉PVDF 膜2 h,封閉結束后孵育一抗(1∶1 000)8 h,加入HRP 標記的山羊抗兔和山羊抗鼠(1∶10 000 稀釋)孵育1 h。用ChemiDoc XRS+(Bio-Rad,USA)凝膠成像系統(tǒng)檢查印跡,并用Image-J 軟件分析目的蛋白與內參的灰度比值。

    1.7 統(tǒng)計學分析

    利用Graphpad-prism8.0 進行統(tǒng)計分析和繪圖,采用單因素方差分析方法分析數(shù)據(jù),結果采用平均數(shù)±標準差進行表示(±s),P<0.05 表示差異具有顯著性;P<0.01 表示差異具有極顯著性;P<0.001 表示差異極其顯著。

    2 結果與分析

    2.1 小鼠肝臟組織病理變化

    HE 染色結果如圖1 所示。經(jīng)觀察,各組肝細胞形態(tài)正常、染色均勻,小鼠肝臟組織并未出現(xiàn)炎性浸潤等炎癥現(xiàn)象,鹽酸川芎嗪并未引起肝臟損傷。說明試驗所選的鹽酸川芎嗪添加濃度屬于安全范圍。

    圖1 小鼠肝臟組織HE 染色形態(tài)圖(×200)Fig.1 HE staining morphology of liver tissue in mice(×200)

    2.2 小鼠肝臟組織脂滴數(shù)量變化

    油紅O 染色結果如圖2 所示,冷暴露條件下添加鹽酸川芎嗪后,C50 mg·kg-1組脂滴數(shù)大量增多,CN組相對于N 組脂滴少量增多,C100 mg·kg-1組相對于CN 組脂滴數(shù)少量增多。說明冷暴露下添加鹽酸川芎嗪后大量脂質如甘油三酯等轉運至肝臟中,可提高機體的脂質代謝,進而使機體產(chǎn)生熱量以維持體溫。

    圖2 小鼠肝臟組織油紅O 染色形態(tài)圖(×200)Fig.2 Morphological map of oil red O staining in mouse liver tissue(×200)

    2.3 UCP1 的IHC 結果

    IHC(圖3)結果顯示,冷暴露條件下添加鹽酸川芎嗪后,小鼠肝臟組織中的UCP1 表達量提高,其中C50 mg·kg-1組的表達量最高,說明添加鹽酸川芎嗪可促進小鼠肝臟組織產(chǎn)熱。

    圖3 小鼠肝臟組織IHC 結果圖(×200)Fig.3 IHC results of mouse liver tissue(×200)

    2.4 UCP1 蛋白表達水平

    通過Western Blot 對產(chǎn)熱關鍵蛋白UCP1 進行了檢測,結果如圖4 所示。相較于CN 組,C50 mg·kg-1組及C100 mg·kg-1組小鼠肝臟中的UCP1 均有顯著升高,其中C50 mg·kg-1組升高更多。由此可見,添加鹽酸川芎嗪可以提高肝臟產(chǎn)熱蛋白表達,促進肝臟產(chǎn)熱來維持體溫。

    圖4 Western blot 檢測各組肝臟中UCP1 蛋白表達水平Fig.4 The expression of UCP1 protein in liver of each group detected by western blot

    3 討論

    寒冷是北方冬季氣候的代名詞,冷應激是北方一種常見的應激源。冷應激會給動物的生長繁殖、免疫功能、生產(chǎn)性能等方面帶來許多不良影響。當動物受到冷應激刺激時,作為一個整體,機體會通過神經(jīng)—內分泌途徑對體內全部的器官和組織進行動員,以應對寒冷應激源帶來的刺激。如交感—腎上腺髓質系統(tǒng)經(jīng)過一系列反應會使兒茶酚胺類激素分泌增多,從而促進機體分解肝糖原、肌糖原和脂肪來升高血糖,去甲腎上腺素還會收縮血管減少散熱;下丘腦—垂體—腎上腺皮質軸也會發(fā)生正反饋調節(jié),其中皮質醇會通過加強代謝、加快糖異生、促進脂肪分解和脂肪酸氧化等來增加機體產(chǎn)熱;下丘腦—垂體—甲狀腺軸中甲狀腺激素能促進三大物質代謝來增加產(chǎn)熱[21]。雖然在不斷進化和適應環(huán)境的過程中,很多動物都擁有了一定的抗寒能力,但仍有許多畜禽因自身所產(chǎn)生的熱量無法抵御周圍的低溫環(huán)境或受到其他因素影響而經(jīng)歷寒冷所帶來的病痛,甚至走向死亡。因此,冷應激仍應受到重視。

    TMP 已被驗證在治療心腦血管疾病和保護肝臟等方面具有一定作用,TMP 可通過抑制炎癥因子和p—NF—κB/ROS 信號通路,對高脂飲食所引發(fā)的非酒精性脂肪肝小鼠的肝臟產(chǎn)生保護作用[22]和對反式脂肪酸所導致的大鼠肝臟損傷具有較好的保護效果[23]。機體暴露在寒冷中會引起特定的急性和慢性生理反應[24],TMP 可以減少砷誘導的活性氧(ROS)的產(chǎn)生、提高谷胱甘肽(GSH)的水平、防止線粒體功能出現(xiàn)障礙、抑制促炎信號的激活以及抑制自噬和細胞凋亡的發(fā)展,結合試驗結果來看,小鼠肝臟并未出現(xiàn)損傷現(xiàn)象,這與前人研究基本一致。肝臟是甘油三酯(TG)的主要合成場所,冷暴露會增強機體物質代謝,因此機體生成的TG 也會隨之增多。同時,甘油三酯是機體內重要的儲能物質,其儲量最大、產(chǎn)能也最多,在油紅O 染色結果中可見冷暴露條件下的肝臟脂滴數(shù)量都有所增加,其中C50 mg·kg-1組脂滴數(shù)最多,說明冷暴露下添加鹽酸川芎嗪可以提高肝臟的產(chǎn)熱能力。

    UCP1 是一種線粒體內膜蛋白,屬于線粒體載體家族。當UCP1 被激活時,它會使線粒體內膜兩側的跨膜質子濃度差被消除,減慢氧化磷酸化過程,使三磷酸腺苷(ATP)的形成受阻,從而將營養(yǎng)能量直接轉化為熱量,以增加機體產(chǎn)熱。UCP1 特異性表達存在于線粒體內膜,通過解偶聯(lián)氧化磷酸化產(chǎn)熱,而其產(chǎn)熱受冷暖中樞的興奮調控[25]。與此同時下丘腦通過與攝食中心連接到相對應產(chǎn)熱系統(tǒng)中,以控制體溫和體重調節(jié)。

    UCP1 可通過高效能的介導其質子滲漏,使質子梯度中貯存的勢能轉化成熱能而散失,并增加機體的非震顫性產(chǎn)熱,為動物保溫、御寒以及維持高等哺乳動物恒定的體溫,還可預防因能量代謝不平衡帶來的Ⅱ型糖尿病和肥胖癥。雖然體力活動可消耗多余能量,但多余的能量會通過線粒體UCP1 解偶聯(lián)棕色脂肪細胞氧化磷酸化,轉化為保護自身免受低溫影響的生熱系統(tǒng)。此外,UCP1 可與游離脂肪酸相互作用催化質子從線粒體膜間到基質的熱生成凈轉移,盡管在大型哺乳動物中所占的比重較低,但其對小型哺乳動物的靜息能量消耗和體重調節(jié)都起到重要的作用[26]。研究結果顯示,在添加了鹽酸川芎嗪后,小鼠肝臟組織UCP1 的表達量顯著提高。結合油紅O染色結果分析,冷暴露環(huán)境下添加鹽酸川芎嗪后,可促進機體的脂質代謝,甘油三酯等物質大量轉運至肝臟,提高了肝臟的產(chǎn)熱能力。同時,鹽酸川芎嗪還具有效果穩(wěn)定,抑制炎性發(fā)生發(fā)展和氧化應激的損傷的特點。通過添加鹽酸川芎嗪來應對北方畜牧業(yè)所遭受的冷應激損失,可能是一個安全又有效的方法。

    4 結論

    實驗結果表明,冷暴露下鹽酸川芎嗪能夠顯著提高UCP1 的表達水平,促進小鼠肝臟產(chǎn)熱,其中C50 mg·kg-1組的效果最強,為提高畜禽的抗寒能力,降低冷應激對北方畜牧業(yè)發(fā)展的影響提供了一定的參考。

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