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    鹽酸川芎嗪對冷暴露小鼠肝臟中解偶聯(lián)蛋白1 表達(dá)的影響

    2023-11-24 10:14:28孟凡舜李仕韋夏榕鴿趙天睿劉鼎鑫李鵬
    關(guān)鍵詞:小鼠

    孟凡舜,李仕韋,夏榕鴿,趙天睿,劉鼎鑫,李鵬

    (黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,大慶 163319)

    對于我國北方高寒地域的動(dòng)物,特別是對新生的動(dòng)物而言,冷應(yīng)激是較為常見的一種應(yīng)激源。在北方高寒地域,初春的雛雞孵化、初春末秋的母豬產(chǎn)崽以及冬天的母牛產(chǎn)犢等,冷應(yīng)激對于畜牧業(yè)的迅速發(fā)展都是需要重視的必要環(huán)節(jié)[1]。然而,由低溫環(huán)境所引起的冷應(yīng)激往往會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物生長速度減慢、抗病能力變差,甚至導(dǎo)致動(dòng)物死亡等問題。嚴(yán)重的冷應(yīng)激會(huì)對動(dòng)物產(chǎn)生較大的影響,除了會(huì)降低其生產(chǎn)性能,還可引發(fā)動(dòng)物呼吸系統(tǒng)疾病,甚至導(dǎo)致動(dòng)物死亡[2]。即使動(dòng)物適應(yīng)冷應(yīng)激后,也會(huì)引起基礎(chǔ)代謝率和采食量提高,導(dǎo)致動(dòng)物的能量儲(chǔ)備及生產(chǎn)性能有所降低,進(jìn)而影響生產(chǎn)效益。綜上可知,低溫環(huán)境所引起的冷應(yīng)激是影響我國北方畜牧業(yè)發(fā)展的重要因素之一。

    動(dòng)物體內(nèi)的能量資源不是無限的,當(dāng)體內(nèi)某一系統(tǒng)所需能量增加時(shí),為適應(yīng)自身變化,機(jī)體會(huì)對自身能量的利用進(jìn)行重新分配,以維持自己的生命。當(dāng)外界溫度降低時(shí),恒溫動(dòng)物首先通過非戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱來增加產(chǎn)熱,當(dāng)達(dá)到臨界點(diǎn)時(shí),就會(huì)發(fā)生戰(zhàn)栗。作為三大營養(yǎng)物質(zhì)的糖類、脂肪和蛋白質(zhì)是機(jī)體熱量的主要來源。而肝臟是許多生理過程的關(guān)鍵樞紐,作為機(jī)體內(nèi)物質(zhì)代謝最旺盛的器官,它也是機(jī)體主要的產(chǎn)熱器官之一。肝臟與三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝之間存在著十分密切的關(guān)系,它是糖異生、調(diào)節(jié)血糖濃度以及將體內(nèi)糖轉(zhuǎn)化為脂肪的主要器官,并在脂類代謝過程中發(fā)揮著重要作用,同時(shí)肝臟內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝也很活躍。在進(jìn)食時(shí),肝臟以糖原形式儲(chǔ)存葡萄糖,空腹時(shí)則通過糖異生途徑組裝葡萄糖,肝臟能夠氧化脂肪,也可將多余的脂肪進(jìn)行包裝,以分泌和儲(chǔ)存到其他組織,肝臟還負(fù)責(zé)血液中分泌的大多數(shù)蛋白質(zhì),能夠處理用于能量的氨基酸,還可通過以尿素新陳代謝的形式處理蛋白質(zhì)降解所產(chǎn)生的含氮廢物[3]。當(dāng)機(jī)體處于寒冷環(huán)境中時(shí),肝臟的代謝活動(dòng)會(huì)有所增強(qiáng),以此提高機(jī)體熱量,同時(shí)也為骨骼肌的戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱提供能量。因此,在處于寒冷環(huán)境的情況下促進(jìn)肝臟產(chǎn)熱對動(dòng)物機(jī)體抵御低溫環(huán)境具有重要意義。

    川芎,傘形科藁本屬植物,在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品,又名香果,其性溫,味辛,常用于活血行氣、祛風(fēng)止痛,在散偏湯、四物湯、溫經(jīng)湯等方劑中均可見其身影。川芎中所含化學(xué)成分眾多,如川芎嗪、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、丁基苯酞等。川芎嗪(ligustrazine,TMP)是從中草藥川芎中分離得到的一種活性生物堿,化學(xué)名稱為2,3,5,6-四甲基吡嗪,于1957 年首次被分離,具有2000 多年的廣泛藥用歷史。在我國川芎嗪被廣泛用于心腦血管疾病,至今已有40 多年的歷史,同時(shí)由于其對機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)均表現(xiàn)有效性,而受到了廣泛關(guān)注[4]。在過去的幾十年里,研究人員探索了TMP 在各種疾病中的藥理作用,例如心腦血管缺陷[5-6]、脂肪肝[7-8]、胰腺炎[9]、Ⅱ型糖尿病[10-12]及癌癥[13-15]等,驗(yàn)證了其保護(hù)肝臟和腎臟[16-17]、抗氧化[18]、抗炎[19]及抗腫瘤活性[20]等作用。

    鹽酸川芎嗪是川芎嗪最常用的藥物制劑,在臨床中具有良好的使用效果,穩(wěn)定性更好,半衰期較川芎嗪更長和副作用較小等特點(diǎn)。介于上述背景,鹽酸川芎嗪在冷暴露中尚未有研究。因此,試驗(yàn)選擇鹽酸川芎嗪作為治療藥物,探究其在冷暴露條件下對小鼠肝臟產(chǎn)熱能力的影響,為提高畜禽冬季抗寒能力提供一定參考。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑及儀器

    4%多聚甲醛、蘇木精染色劑、伊紅染色劑、油紅O 染色試劑盒、RIPA 裂解液、PMSF 蛋白酶抑制劑、BCA 蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)、SDS-PAGE 制膠試劑盒、SDA-PAGE 蛋白上樣緩沖液(5X)購自上海碧云天公司;蛋白marker、底物發(fā)光液、PVDF 膜購自美國MILLIPORE 公司;UCP1 兔多克隆抗體、β-Tublin 鼠單克隆抗體、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 和山羊抗鼠IgG 購自美國Proteinch 公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    4 周齡雄性SPF 級(jí)C57BL/6J 小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。將其隨機(jī)分為常溫對照組(N 組)、冷暴露組(CN 組)、冷暴露+50 mg·kg-1鹽酸川芎嗪組(C50 mg·kg-1組)以及冷暴露+100 mg·kg-1鹽酸川芎嗪組(C100 mg·kg-1組),每組10 只,晝夜交替光照12 h,自由飲水,室溫(26±1)℃預(yù)飼一周后對加藥組小鼠進(jìn)行相應(yīng)濃度的灌胃,灌胃組在灌胃結(jié)束后與冷暴露組一起每天置于4 ℃人工氣候室中冷刺激3 h,4 周后處死小鼠,并采集肝臟組織。

    1.3 HE 染色

    將肝臟組織固定于4%多聚甲醛緩沖液,置于包埋盒中,流水沖洗30 min,利用不同濃度的酒精脫水,在二甲苯溶液中使組織透明后,將透明組織放在石蠟中,包埋后進(jìn)行切片。染色前,采用二甲苯溶液脫蠟后,放入從高到低濃度的酒精中,再用蒸餾水清洗。將切片置于蘇木精染液中幾分鐘,然后放于鹽酸乙醇和氨水中各30 s 進(jìn)行分色,再用伊紅染色液染色2~3 min,再通過不同濃度的酒精脫水,利用二甲苯溶液透明后封片。在×200 放大倍率下觀察各組肝臟是否有損傷。

    1.4 油紅O 染色

    取肝臟組織,將其包埋在OCT 化合物中,并置于-80 ℃條件下保存。利用冰凍切片機(jī)以10 μm 的厚度切割組織。采用異丙醇配制0.5%的油紅O 原液,工作濃度60%用DDH2O 稀釋。用60%異丙醇對切片進(jìn)行洗滌,用油紅O 工作液染色1 h,染色完成后用自來水沖洗切片20 min。在×200 放大倍率下對各組肝臟中脂滴數(shù)量進(jìn)行觀察。

    1.5 UCP1 免疫組織化學(xué)法檢測

    將固定后的肝臟組織進(jìn)行固定和脫水處理,將處理后的組織包埋在石蠟中,包埋后的肝臟組織用切片機(jī)切成5 μm 厚的切片,將處理后的切片進(jìn)行脫蠟和抗原修復(fù)。處理完畢后,對切片進(jìn)行血清封閉然后加一抗4 ℃孵育過夜。一抗孵育結(jié)束后加入二抗37 ℃孵育30 min,二抗孵育結(jié)束后加入SABC 37 ℃孵育30 min,孵育結(jié)束后加入顯色劑,將顯色后的切片加入蘇木精復(fù)染,復(fù)染結(jié)束后進(jìn)行脫水和封片。

    1.6 UCP1 蛋白表達(dá)水平的檢測

    用RIPA 提取肝臟組織中的總蛋白質(zhì),提取后在4 ℃和12 000RCF 的條件下離心10 min。離心結(jié)束后收集上清液用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,加入上樣緩沖液使其變性。將每個(gè)樣品等量的加入SDS-PAGE 凝膠上并進(jìn)行電泳。電泳后,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上,用5%脫脂奶粉封閉PVDF 膜2 h,封閉結(jié)束后孵育一抗(1∶1 000)8 h,加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗鼠(1∶10 000 稀釋)孵育1 h。用ChemiDoc XRS+(Bio-Rad,USA)凝膠成像系統(tǒng)檢查印跡,并用Image-J 軟件分析目的蛋白與內(nèi)參的灰度比值。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    利用Graphpad-prism8.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖,采用單因素方差分析方法分析數(shù)據(jù),結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示(±s),P<0.05 表示差異具有顯著性;P<0.01 表示差異具有極顯著性;P<0.001 表示差異極其顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 小鼠肝臟組織病理變化

    HE 染色結(jié)果如圖1 所示。經(jīng)觀察,各組肝細(xì)胞形態(tài)正常、染色均勻,小鼠肝臟組織并未出現(xiàn)炎性浸潤等炎癥現(xiàn)象,鹽酸川芎嗪并未引起肝臟損傷。說明試驗(yàn)所選的鹽酸川芎嗪添加濃度屬于安全范圍。

    圖1 小鼠肝臟組織HE 染色形態(tài)圖(×200)Fig.1 HE staining morphology of liver tissue in mice(×200)

    2.2 小鼠肝臟組織脂滴數(shù)量變化

    油紅O 染色結(jié)果如圖2 所示,冷暴露條件下添加鹽酸川芎嗪后,C50 mg·kg-1組脂滴數(shù)大量增多,CN組相對于N 組脂滴少量增多,C100 mg·kg-1組相對于CN 組脂滴數(shù)少量增多。說明冷暴露下添加鹽酸川芎嗪后大量脂質(zhì)如甘油三酯等轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟中,可提高機(jī)體的脂質(zhì)代謝,進(jìn)而使機(jī)體產(chǎn)生熱量以維持體溫。

    圖2 小鼠肝臟組織油紅O 染色形態(tài)圖(×200)Fig.2 Morphological map of oil red O staining in mouse liver tissue(×200)

    2.3 UCP1 的IHC 結(jié)果

    IHC(圖3)結(jié)果顯示,冷暴露條件下添加鹽酸川芎嗪后,小鼠肝臟組織中的UCP1 表達(dá)量提高,其中C50 mg·kg-1組的表達(dá)量最高,說明添加鹽酸川芎嗪可促進(jìn)小鼠肝臟組織產(chǎn)熱。

    圖3 小鼠肝臟組織IHC 結(jié)果圖(×200)Fig.3 IHC results of mouse liver tissue(×200)

    2.4 UCP1 蛋白表達(dá)水平

    通過Western Blot 對產(chǎn)熱關(guān)鍵蛋白UCP1 進(jìn)行了檢測,結(jié)果如圖4 所示。相較于CN 組,C50 mg·kg-1組及C100 mg·kg-1組小鼠肝臟中的UCP1 均有顯著升高,其中C50 mg·kg-1組升高更多。由此可見,添加鹽酸川芎嗪可以提高肝臟產(chǎn)熱蛋白表達(dá),促進(jìn)肝臟產(chǎn)熱來維持體溫。

    圖4 Western blot 檢測各組肝臟中UCP1 蛋白表達(dá)水平Fig.4 The expression of UCP1 protein in liver of each group detected by western blot

    3 討論

    寒冷是北方冬季氣候的代名詞,冷應(yīng)激是北方一種常見的應(yīng)激源。冷應(yīng)激會(huì)給動(dòng)物的生長繁殖、免疫功能、生產(chǎn)性能等方面帶來許多不良影響。當(dāng)動(dòng)物受到冷應(yīng)激刺激時(shí),作為一個(gè)整體,機(jī)體會(huì)通過神經(jīng)—內(nèi)分泌途徑對體內(nèi)全部的器官和組織進(jìn)行動(dòng)員,以應(yīng)對寒冷應(yīng)激源帶來的刺激。如交感—腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)經(jīng)過一系列反應(yīng)會(huì)使兒茶酚胺類激素分泌增多,從而促進(jìn)機(jī)體分解肝糖原、肌糖原和脂肪來升高血糖,去甲腎上腺素還會(huì)收縮血管減少散熱;下丘腦—垂體—腎上腺皮質(zhì)軸也會(huì)發(fā)生正反饋調(diào)節(jié),其中皮質(zhì)醇會(huì)通過加強(qiáng)代謝、加快糖異生、促進(jìn)脂肪分解和脂肪酸氧化等來增加機(jī)體產(chǎn)熱;下丘腦—垂體—甲狀腺軸中甲狀腺激素能促進(jìn)三大物質(zhì)代謝來增加產(chǎn)熱[21]。雖然在不斷進(jìn)化和適應(yīng)環(huán)境的過程中,很多動(dòng)物都擁有了一定的抗寒能力,但仍有許多畜禽因自身所產(chǎn)生的熱量無法抵御周圍的低溫環(huán)境或受到其他因素影響而經(jīng)歷寒冷所帶來的病痛,甚至走向死亡。因此,冷應(yīng)激仍應(yīng)受到重視。

    TMP 已被驗(yàn)證在治療心腦血管疾病和保護(hù)肝臟等方面具有一定作用,TMP 可通過抑制炎癥因子和p—NF—κB/ROS 信號(hào)通路,對高脂飲食所引發(fā)的非酒精性脂肪肝小鼠的肝臟產(chǎn)生保護(hù)作用[22]和對反式脂肪酸所導(dǎo)致的大鼠肝臟損傷具有較好的保護(hù)效果[23]。機(jī)體暴露在寒冷中會(huì)引起特定的急性和慢性生理反應(yīng)[24],TMP 可以減少砷誘導(dǎo)的活性氧(ROS)的產(chǎn)生、提高谷胱甘肽(GSH)的水平、防止線粒體功能出現(xiàn)障礙、抑制促炎信號(hào)的激活以及抑制自噬和細(xì)胞凋亡的發(fā)展,結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果來看,小鼠肝臟并未出現(xiàn)損傷現(xiàn)象,這與前人研究基本一致。肝臟是甘油三酯(TG)的主要合成場所,冷暴露會(huì)增強(qiáng)機(jī)體物質(zhì)代謝,因此機(jī)體生成的TG 也會(huì)隨之增多。同時(shí),甘油三酯是機(jī)體內(nèi)重要的儲(chǔ)能物質(zhì),其儲(chǔ)量最大、產(chǎn)能也最多,在油紅O 染色結(jié)果中可見冷暴露條件下的肝臟脂滴數(shù)量都有所增加,其中C50 mg·kg-1組脂滴數(shù)最多,說明冷暴露下添加鹽酸川芎嗪可以提高肝臟的產(chǎn)熱能力。

    UCP1 是一種線粒體內(nèi)膜蛋白,屬于線粒體載體家族。當(dāng)UCP1 被激活時(shí),它會(huì)使線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的跨膜質(zhì)子濃度差被消除,減慢氧化磷酸化過程,使三磷酸腺苷(ATP)的形成受阻,從而將營養(yǎng)能量直接轉(zhuǎn)化為熱量,以增加機(jī)體產(chǎn)熱。UCP1 特異性表達(dá)存在于線粒體內(nèi)膜,通過解偶聯(lián)氧化磷酸化產(chǎn)熱,而其產(chǎn)熱受冷暖中樞的興奮調(diào)控[25]。與此同時(shí)下丘腦通過與攝食中心連接到相對應(yīng)產(chǎn)熱系統(tǒng)中,以控制體溫和體重調(diào)節(jié)。

    UCP1 可通過高效能的介導(dǎo)其質(zhì)子滲漏,使質(zhì)子梯度中貯存的勢能轉(zhuǎn)化成熱能而散失,并增加機(jī)體的非震顫性產(chǎn)熱,為動(dòng)物保溫、御寒以及維持高等哺乳動(dòng)物恒定的體溫,還可預(yù)防因能量代謝不平衡帶來的Ⅱ型糖尿病和肥胖癥。雖然體力活動(dòng)可消耗多余能量,但多余的能量會(huì)通過線粒體UCP1 解偶聯(lián)棕色脂肪細(xì)胞氧化磷酸化,轉(zhuǎn)化為保護(hù)自身免受低溫影響的生熱系統(tǒng)。此外,UCP1 可與游離脂肪酸相互作用催化質(zhì)子從線粒體膜間到基質(zhì)的熱生成凈轉(zhuǎn)移,盡管在大型哺乳動(dòng)物中所占的比重較低,但其對小型哺乳動(dòng)物的靜息能量消耗和體重調(diào)節(jié)都起到重要的作用[26]。研究結(jié)果顯示,在添加了鹽酸川芎嗪后,小鼠肝臟組織UCP1 的表達(dá)量顯著提高。結(jié)合油紅O染色結(jié)果分析,冷暴露環(huán)境下添加鹽酸川芎嗪后,可促進(jìn)機(jī)體的脂質(zhì)代謝,甘油三酯等物質(zhì)大量轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟,提高了肝臟的產(chǎn)熱能力。同時(shí),鹽酸川芎嗪還具有效果穩(wěn)定,抑制炎性發(fā)生發(fā)展和氧化應(yīng)激的損傷的特點(diǎn)。通過添加鹽酸川芎嗪來應(yīng)對北方畜牧業(yè)所遭受的冷應(yīng)激損失,可能是一個(gè)安全又有效的方法。

    4 結(jié)論

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,冷暴露下鹽酸川芎嗪能夠顯著提高UCP1 的表達(dá)水平,促進(jìn)小鼠肝臟產(chǎn)熱,其中C50 mg·kg-1組的效果最強(qiáng),為提高畜禽的抗寒能力,降低冷應(yīng)激對北方畜牧業(yè)發(fā)展的影響提供了一定的參考。

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