肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶研究進(jìn)展*

李鳳妍,嚴(yán)茹鈺,曹小利

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科,南京210008)

碳青霉烯類抗生素具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、低毒性等特點(diǎn),臨床常用于治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶腸桿菌科細(xì)菌所引起的嚴(yán)重感染[1]。該類藥物作用于細(xì)菌細(xì)胞膜上的青霉素結(jié)合蛋白(penicillin-binding protein, BPS),抑制胞壁粘肽合成酶,阻礙細(xì)胞壁粘肽合成,使細(xì)菌胞壁缺損,菌體滲透壓改變并溶解,從而殺滅細(xì)菌。近年來(lái),由于臨床上碳青霉烯類抗生素的廣泛使用,碳青霉烯耐藥的腸桿菌(Carbapenem-resistantEnterobacteriaceae,CRE)不斷出現(xiàn)。碳青霉烯酶的產(chǎn)生是腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯耐藥的主要原因,其中,肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiellapneumoniaecarbapenemases, KPC)是全球流行最廣泛的碳青霉烯酶[2]。

1 KPC的主要特征

1.1KPC酶的結(jié)構(gòu)特征 KPC型碳青霉烯酶屬于Ambler分子分類法的A類酶,在Bush功能分類法中為2f組。blaKPC長(zhǎng)度約為882 bp,平均由294個(gè)氨基酸組成,結(jié)構(gòu)較保守,第70位絲氨酸(S70)為酶活性中心,周圍有4段保守的氨基酸序列,分別是α3-與α4-螺旋之間的環(huán)區(qū)(L102至S106)、Ω環(huán)(R164至D179)、β3-和β4-折疊之間的環(huán)區(qū)(C238至T243)以及β5-與α11-螺旋之間的環(huán)區(qū)(A267至S275),具有活性位點(diǎn)SXXK、SDN和KTG[2]。其中,Ω環(huán)位于KPC活性位點(diǎn)周圍,與環(huán)外的許多殘基相互作用,是維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ),而Glu166和Asn170是對(duì)β-內(nèi)酰胺脫?；匦璧陌被釟埢?。Tooke等[3]研究發(fā)現(xiàn),可變的Ω環(huán)結(jié)構(gòu)能賦予KPC-2對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的廣譜水解活性,Ω環(huán)易發(fā)生突變,介導(dǎo)KPC耐藥性的變化。

1.2KPC的流行特征

1.2.1KPC變異體的地域分布 自KPC酶分離以來(lái),產(chǎn)KPC酶的腸桿菌科細(xì)菌在美國(guó)不斷被發(fā)現(xiàn),2006年以來(lái),KPC酶在全球快速播散,并產(chǎn)生多種變異體。截止2023年6月,在數(shù)據(jù)庫(kù)Beta-Lactamase DataBase(BLDB, http://www.bldb.eu/BLDB.php?prot=A#KPC)中列出了164種KPC酶的變異體。值得注意的是,它們雖然都是KPC酶,但并不都具有碳青霉烯水解活性,有些則屬于超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs,表1)。不同地區(qū)間KPC亞型分布有一定的差異,KPC-2和KPC-3是其他KPC變異體的主要來(lái)源。一項(xiàng)全球CRE的監(jiān)測(cè)報(bào)告中顯示,KPC-2是亞太地區(qū)、拉丁美洲和北美洲最常見(jiàn)的KPC酶型,而歐洲、中東和非洲主要的流行亞型是KPC-2和KPC-3[4]。

表1 164種 KPC變異體的功能分類

1.2.2KPC菌種分布 KPC最常流行于肺炎克雷伯菌中,通過(guò)質(zhì)粒等移動(dòng)元件可在不同菌種間傳播,目前不僅在產(chǎn)酸克雷伯菌、大腸埃希菌、粘質(zhì)沙雷菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、陰溝腸桿菌、奇異變形桿菌和摩根菌等腸桿菌科細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)KPC;其也存在于銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌等非發(fā)酵性革蘭氏陰性桿菌中[2]。

1.2.3KPC人群分布 醫(yī)院中產(chǎn)KPC革蘭陰性桿菌主要引起患者呼吸道感染、菌血癥和尿路感染。痰液、血液和尿液標(biāo)本中分離得到KPC陽(yáng)性菌的概率較高?；颊叱槊庖吡Φ拖氯巳?通常使用過(guò)碳青霉烯類藥物或長(zhǎng)時(shí)間使用多種抗生素;接受過(guò)侵入性操作如深靜脈插管、氣管切開(kāi)術(shù)、留置導(dǎo)尿管或入住ICU及手術(shù)科室[5]。KPC定植是醫(yī)院感染發(fā)生的危險(xiǎn)因素與先決條件,CRE腸道定植率與感染率呈正相關(guān)[6]。故而加強(qiáng)環(huán)境監(jiān)測(cè),規(guī)范醫(yī)療器械及廢棄物管理,做好消毒工作和手部衛(wèi)生,減少不必要的侵入性操作,對(duì)于預(yù)防院內(nèi)感染至關(guān)重要。

1.3KPC酶的耐藥特征

1.3.1泛耐藥/全耐藥特征 通常單產(chǎn)KPC酶的臨床分離株很少見(jiàn),大部分產(chǎn)KPC菌株常伴有其他多種抗生素耐藥基因的檢出,或合并其他耐藥機(jī)制,如外排泵的過(guò)表達(dá)或外膜孔蛋白的缺失,往往表現(xiàn)為泛耐藥(extensively drug resistant, XDR)或全耐藥(pan-drug resistant, PDR)的耐藥特征[7]。在這些共存的耐藥基因中,blaSHV、blaCTX-M、blaTEM往往比較常見(jiàn);此外,氨基糖苷類耐藥基因、質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因、磷霉素耐藥基因fosA等常被報(bào)道;氯霉素、四環(huán)素以及磺胺類藥物相關(guān)的耐藥基因則少有報(bào)道,它們常位于同一質(zhì)?；蛘显谕豢梢苿?dòng)遺傳元件上傳播。Xu等[8]報(bào)道了1株產(chǎn)KPC酶的PDR肺炎克雷伯菌,該菌不僅攜帶了7種抗生素耐藥基因,染色體上mgrB和rpsJ基因突變還導(dǎo)致了粘菌素和替加環(huán)素的耐藥。臨床上,這種泛耐藥/全耐藥菌株的不斷增加往往導(dǎo)致臨床抗菌藥物治療失敗,患者病程遷延,死亡風(fēng)險(xiǎn)增高。

1.3.2KPC變異體的突變介導(dǎo)對(duì)頭孢他啶/阿維巴坦的耐藥 頭孢他啶/阿維巴坦(ceftazidime/avibactam, CAZ/AVI)是治療產(chǎn)KPC酶腸桿菌感染的有效抗生素之一,隨著該藥的臨床應(yīng)用,CAZ/AVI耐藥的產(chǎn)酶株不斷出現(xiàn),主要與KPC變異體的出現(xiàn)有關(guān)。目前,國(guó)內(nèi)外已報(bào)道了多種CAZ/AVI耐藥的KPC變異體[2],主要是由于KPC酶活性中心區(qū)域發(fā)生的某些氨基酸替換、插入或缺失后,導(dǎo)致了酶對(duì)頭孢他啶的催化活性增強(qiáng)或者阿維巴坦對(duì)酶的抑制減弱,進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)酶菌株對(duì)CAZ/AVI產(chǎn)生耐藥性。突變主要集中于3個(gè)區(qū)域:Ω環(huán)區(qū)域(氨基酸164～179位)、β鏈區(qū)域(氨基酸234～242位)以及臨近Ω環(huán)區(qū)域(氨基酸263～277位)[2]。其中,Ω環(huán)區(qū)域突變占比最多,D179Y是Ω環(huán)中最常發(fā)生的突變,介導(dǎo)了KPC-33和KPC-31對(duì)CAZ/AVI較高的耐藥性,同時(shí)恢復(fù)對(duì)碳青霉烯類抗生素的敏感性,這可能與突變使R164與D179之間的靜電引力和氫鍵作用減弱,Ω環(huán)結(jié)構(gòu)松散有關(guān)[9]。Ω環(huán)外的某些突變則同時(shí)介導(dǎo)碳青霉烯類抗生素及CAZ/AVI的耐藥。

其次,一些野生型KPC分離株可能由于blaKPC基因的相對(duì)拷貝數(shù)量和表達(dá)量較高,外排泵高表達(dá)或合并外膜孔蛋白OmpK35或OmpK36缺失以及PBPs的突變產(chǎn)生了對(duì)CAZ/AVI的抗性[10]。Shen等[11]將214株產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌根據(jù)CAZ/AVI的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)分為高、中、低3組,發(fā)現(xiàn)高值組對(duì)頭孢他啶的親和力及blaKPC基因的表達(dá)和拷貝量明顯高于中值組和低值組;而聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示所有MIC值≥1 mg/L菌株的OmpK35蛋白編碼基因攜帶提前終止的移碼突變或者反向調(diào)控基因micF和ompR過(guò)度表達(dá)。相反,在MIC值≤0.5 mg/L的分離株中均能觀察到OmpK35和OmpK36條帶。產(chǎn)酶株對(duì)CAZ/AVI的耐藥性可能是在抗生素壓力下選擇產(chǎn)生的,或預(yù)先存在于人群中[10]。雖然CAZ/AVI對(duì)產(chǎn)KPC菌株有較好的療效,但實(shí)際用藥時(shí)仍需謹(jǐn)慎,檢測(cè)CAZ/AVI的MIC值對(duì)合理用藥有重要意義。

2 KPC的播散機(jī)制

2.1垂直播散機(jī)制 KPC酶主要流行于肺炎克雷伯菌,對(duì)產(chǎn)酶菌株的遺傳相關(guān)性分析顯示,KPC酶在全球范圍內(nèi)的傳播與肺炎克雷伯菌的一些主要克隆或克隆復(fù)合群的流行有關(guān)。雖然產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌存在多種序列型(sequence type, ST),但目前在全球大范圍播散的ST型主要為CC258克隆復(fù)合群,CC258包含四十余種ST型,其中最常見(jiàn)的ST型為ST258、ST11、ST512、ST340、ST437和ST833[12]。ST258主要在北美、拉丁美洲、歐洲流行。ST258型菌株特異性的蛋白質(zhì)與細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)、分泌以及DNA修復(fù)與修飾密切相關(guān),可能是ST258菌株成為流行菌株的基礎(chǔ)要素[12]。值得注意的是,ST11和ST258親緣關(guān)系很近,二者僅有1個(gè)管家基因(tonB)的差別,但ST258在我國(guó)的檢出率很低,ST11則是亞洲地區(qū)尤其是我國(guó)的主要克隆型,這可能是因?yàn)镾T11可攜帶多種毒力基因并耐受體液免疫,有利于菌株局部定植、形成生物膜、對(duì)抗免疫細(xì)胞吞噬作用,從而成為主要的流行菌株[13]。也有研究報(bào)道,ST11和ST258菌株均攜帶ICEKp258.1中的Ⅳ型分泌系統(tǒng)(type Ⅳ secretion system, T4SS),可以促進(jìn)質(zhì)粒等可移動(dòng)元件的傳播,促使CC258成為主要的克隆復(fù)合群[13]。ST512是ST258的1個(gè)單基因座變體,近年報(bào)道較多,常攜帶blaKPC-3,可引起醫(yī)院感染的暴發(fā)流行[14]。近年產(chǎn)KPC酶的大腸埃希菌ST131是一種多重耐藥的高?？寺?具有在各種生態(tài)環(huán)境中持續(xù)存在和定植的能力,并能抵抗粘菌素,成為KPC酶在全球擴(kuò)散的另一個(gè)主體菌株,值得引起重視[15]。

2.2水平播散機(jī)制

2.2.1質(zhì)粒介導(dǎo)的播散blaKPC主要位于多種不同大小的接合性質(zhì)粒上,一般為20～200 kb,質(zhì)粒的多樣性可能是由于在抗生素壓力下,發(fā)生了各種移動(dòng)元件的重組或插入事件,加快了耐藥基因的傳播進(jìn)程[16]。目前,攜帶blaKPC基因的質(zhì)粒有IncF、IncN、Inc A/C、IncX、IncI、IncL/M、IncR、IncH、IncP,其中IncF型質(zhì)粒最常見(jiàn),其次為IncA/C、IncX[17]。pKpQIL是第一個(gè)在ST258中發(fā)現(xiàn)的編碼blaKPC的IncF型質(zhì)粒,也是blaKPC在北美、歐洲和中東傳播的重要載體。ST11攜帶的IncFⅡ型質(zhì)粒介導(dǎo)了blaKPC在中國(guó)的傳播[18]。另有研究表明,某些流行克隆中限制性修飾 (restriction and modification,RM)系統(tǒng)和CRISPR-Cas系統(tǒng)的缺乏是blaKPC-IncF質(zhì)粒在其間傳播的潛在因素之一[7,19]。而耐藥質(zhì)粒與毒力質(zhì)粒的融合,導(dǎo)致了耐碳青霉烯高毒力肺炎克雷伯菌出現(xiàn),嚴(yán)重威脅患者生命。通過(guò)積極尋找質(zhì)粒中關(guān)鍵的分子標(biāo)記,可以實(shí)現(xiàn)對(duì)高危菌株的追蹤和控制[20]。

2.2.2轉(zhuǎn)座子(Transposon,Tn)介導(dǎo)的播散 Tn是可以在基因組上自由移動(dòng),并插入其中的DNA序列。質(zhì)粒介導(dǎo)的碳青霉烯酶類抗生素耐藥,主要通過(guò)轉(zhuǎn)座子Tn4401實(shí)現(xiàn)。Tn4401序列兩側(cè)有5 bp的靶位復(fù)制序列,可以攜帶blaKPC非特異性地插入到不同質(zhì)粒的開(kāi)放讀碼框中,是歐美地區(qū)攜帶blaKPC最常見(jiàn)的基因元件[21]。其結(jié)構(gòu)組成包括blaKPC-2基因、轉(zhuǎn)座酶基因(tnpA)、解離酶基因(tnpR)以及ISKpn6和ISKpn7插入序列。Tn4401大小為10 kb,屬于Tn3轉(zhuǎn)座子家族,現(xiàn)已有多種異構(gòu)體被發(fā)現(xiàn),其中Tn4401a和Tn4401b分布最廣[22]。

非Tn4401元件(NTE)中也發(fā)現(xiàn)了blaKPC基因。第一個(gè)NTE于2007年在中國(guó)被報(bào)道,以Tn3整合子為基礎(chǔ),各基因的順序?yàn)門(mén)n3轉(zhuǎn)座酶、Tn3解離酶、ISKpn8、blaKPC-2基因、類ISKpn6插入序列,與國(guó)外Tn4401轉(zhuǎn)座子差異明顯[23]。之后在阿根廷、哥倫比亞、智利和巴西等國(guó)家也有了不同結(jié)構(gòu)NTE的報(bào)道[24]。中國(guó)流行的ST11型肺炎克雷伯菌攜帶的blaKPC-2基因大部分在非Tn4401元件上發(fā)現(xiàn),尤其以NTEKPC-Ⅰ和NTEKPC-Ⅱ?yàn)橹?我國(guó)產(chǎn)KPC酶的腸桿菌所攜帶的blaKPC基因環(huán)境十分相似,復(fù)合轉(zhuǎn)座子Tn3-Tn4401和轉(zhuǎn)座子Tn1721最常被報(bào)道[22,25]。

2.2.3插入序列(insertion sequence, IS)和整合子介導(dǎo)的播散 IS是最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座子,它不含有任何與轉(zhuǎn)位功能無(wú)關(guān)的基因,可獨(dú)立存在,也可構(gòu)成了Tn的兩臂。在細(xì)菌染色體和質(zhì)粒中存在多種IS或多個(gè)拷貝的IS,可介導(dǎo)blaKPC復(fù)制轉(zhuǎn)座及水平傳播,從而增加細(xì)菌耐藥性。Li等[26]發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒pKPC-J5501中blaKPC-2的雙拷貝且證實(shí)兩側(cè)序列是IS26,2個(gè)拷貝的IS26可形成復(fù)合轉(zhuǎn)座子,該轉(zhuǎn)座子可以從質(zhì)粒中切下并轉(zhuǎn)移,參與了blaKPC-2的傳播和擴(kuò)增。雙拷貝的blaKPC-2可能是IS26同源重組介導(dǎo)的,blaKPC高表達(dá)使該菌株耐藥性增強(qiáng)。轉(zhuǎn)座子中的插入序列影響了啟動(dòng)子活性和表達(dá)水平,Mmatli等[27]報(bào)道IS26在ardK中的插入使亞胺培南酶的表達(dá)增加了53倍。因此,插入序列和啟動(dòng)子對(duì)細(xì)菌耐藥性的影響也不容忽視。

整合子是可移動(dòng)的DNA分子,通過(guò)捕獲外源耐藥基因并穩(wěn)定表達(dá),以提高細(xì)菌對(duì)周圍環(huán)境改變的耐受性。blaKPC常位于整合子可變區(qū),它的傳播與Ⅰ、Ⅱ類整合子密切相關(guān)[28]。

3 KPC檢測(cè)方法

碳青霉烯酶的檢測(cè)與分型對(duì)于臨床感染控制和精準(zhǔn)用藥十分重要,目前碳青霉烯酶檢測(cè)方法分為表型檢測(cè)和基因型檢測(cè)。表型檢測(cè)主要包括Carba NP試驗(yàn)、改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)(包括mCIM和eCIM)、碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)(APB/EDTA)。這類檢測(cè)方法只能對(duì)碳青霉烯酶初步篩查并不能確定待測(cè)酶的基因型;針對(duì)KPC酶的特異性基因檢測(cè)方法主要包括NG-test Carba5膠體金免疫層析技術(shù)或利用熒光定量PCR技術(shù)研發(fā)的一些試劑盒如Filmarray血流感染或肺炎檢測(cè)試劑盒、GeneXpert Carba-R、Verigene革蘭陰性菌血培養(yǎng)鑒定試劑盒,這類方法快速、高效,但需要特殊的試劑和設(shè)備檢測(cè)特異性靶基因,若待測(cè)基因與目標(biāo)基因不同,會(huì)呈假陰性結(jié)果。KPC突變體往往具有不同的藥敏特性,一些菌株表現(xiàn)為低水平的碳青霉烯類抗生素耐藥,甚至敏感,造成臨床檢出困難,Ding等[29]評(píng)估了mCIM和eCIM、APB/EDTA、NG-test Carba 5、 GeneXpert Carba-R 4種方法對(duì)6種CAZ/AVI耐藥的blaKPC-2變異體的檢測(cè)效果,結(jié)果表明,使用mCIM和eCIM、APB/EDTA都無(wú)法檢出blaKPC-2變體,而使用NG-test Carba 5時(shí),少部分變異體可檢出KPC陽(yáng)性,假陰性率高,GeneXpert Carba-R可以檢測(cè)到所有blaKPC-2變體,這項(xiàng)研究提示臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)blaKPC-2變異體的檢測(cè)要注意選擇合適的方法。目前,還有許多方法也在不斷優(yōu)化和探索中,有科研團(tuán)隊(duì)利用亞胺培南/雷巴坦改良Carba NP試驗(yàn)檢測(cè)腸桿菌中的A類碳青霉烯酶,改良后檢測(cè)時(shí)間大幅縮短,操作亦十分簡(jiǎn)單,但對(duì)KPC變異體的檢測(cè)性能未經(jīng)驗(yàn)證[30]。Huang等[31]提出針對(duì)ST11型產(chǎn)KPC-2酶肺炎克雷伯菌的特征峰4 521 m/z用MALDI-TOF MS的方法可以進(jìn)行早期快速檢測(cè)?？傊?不同方法有各自的優(yōu)缺點(diǎn),這些檢測(cè)方法往往對(duì)CAZ/AVI耐藥的KPC變異體檢出率低,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)根據(jù)自身實(shí)際情況選擇合適的檢測(cè)方法,并可根據(jù)自己的檢測(cè)目的對(duì)常規(guī)方法進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。

4 小結(jié)與展望

KPC是全球分布最廣的碳青霉烯酶,通過(guò)攜帶多種抗性基因的質(zhì)粒和可移動(dòng)元件擴(kuò)散到不同細(xì)菌中,導(dǎo)致泛耐藥/全耐藥的超級(jí)細(xì)菌不斷出現(xiàn)。CAZ/AVI是治療產(chǎn)酶菌的最優(yōu)選擇,但近年出現(xiàn)了多種耐藥突變體,探索其中的耐藥機(jī)制對(duì)合理用藥十分重要。常規(guī)碳青霉烯酶檢測(cè)方法對(duì)這種KPC突變體易漏檢,且只能確定表型,難以區(qū)分出具體的基因型,醫(yī)務(wù)工作者應(yīng)不斷探索新方法,并將其應(yīng)用于臨床檢測(cè)。長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看,應(yīng)盡量延緩耐藥性的出現(xiàn),針對(duì)感染的高危因素,采取嚴(yán)格的感染控制措施,并根據(jù)患者病情,感染部位,細(xì)菌種類以及藥敏結(jié)果,抗菌藥物的臨床應(yīng)用指征,制訂合理的治療方案,才能取得療效并控制產(chǎn)KPC酶細(xì)菌的播散。