LncRNA H19和miR-625-5p在消化性潰瘍合并幽門螺桿菌感染患兒血清中的表達及意義

秦飛,徐文飛,林曉玲,李崇山,蘇桂如

(泉州市兒童醫(yī)院消化內科,福建泉州 362000)

消化性潰瘍(peptic ulcer,PU)是一種酸相關性疾病的消化道病變,多發(fā)生于胃或十二指腸近端等部位,胃黏膜脫落、缺損延伸至黏膜下層或固有肌層,對各個年齡段均有影響,具有較高的發(fā)病率和死亡率[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,HP)感染是PU的主要危險因素,可誘發(fā)炎癥反應,進一步加重胃黏膜損傷以及潰瘍[3-4]。因此,尋找與PU合并HP感染相關的生物學標志物有助于臨床盡早對患兒進行治療,保障患兒的生命健康。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是炎癥和血管功能的關鍵介質。LncRNA H19作為LncRNA的一種,可以進行自噬調節(jié),激活炎癥途徑,與炎癥性疾病密切相關。有研究顯示,LncRNA H19高表達的HP感染患者患胃癌的風險增大,其會通過增強炎癥反應,促進HP感染的胃癌細胞增殖和遷移[5-6]。微小RNA-625-5p(miR-625-5p)是一種多功能miRNA,能夠抑制腫瘤發(fā)生,影響信號通路,改變炎癥反應,在哮喘等過敏性疾病中具有重要作用。亦有研究顯示,LncRNA H19與miR-625-5p存在靶向關系[7-8]。但在PU合并HP感染患兒中的相關研究較少,推測LncRNA H19和miR-625-5p可能參與了PU合并HP感染。本研究通過檢測PU合并HP感染患兒血清LncRNA H19和miR-625-5p的表達水平,分析對PU合并HP感染的診斷價值,以期為診斷PU合并HP感染提供一定的實驗依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1研究對象 選取2021年2月至2023年2月在泉州市兒童醫(yī)院治療的160例PU患兒,年齡范圍為5～14歲。根據(jù)是否合并HP感染分為HP陽性組90例,陰性組70例。陽性組男性46例,女性44例,年齡(10.50±2.60)歲;陰性組男性37例,女性33例,年齡(11.20±2.70)歲;收集同期體檢健康兒童160例作為健康人對照組,其中男性80例,女性80例,年齡(10.80±2.65)歲,各組性別、年齡之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。納入標準:(1)患者符合PU相關診斷標準[9];(2)經14C-尿素呼氣試驗檢測,判斷為HP感染[10];(3)未使用抑酸劑、抗生素和胃黏膜保護劑等藥物治療;(4)臨床資料完整,監(jiān)護人自愿簽署同意書。排除標準:(1)胃食管反流、嗜酸性粒細胞胃腸炎、消化道手術等其他胃腸道疾病;(2)有心、肝、腎等功能障礙或疾病者;(3)免疫系統(tǒng)和血液系統(tǒng)疾病者;(4)存在感染及其他炎性疾病。本研究經患兒及健康兒童監(jiān)護人知情同意,且經泉州市兒童醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(倫理文號:2021012611)。

1.2方法

1.2.1樣本采集 所有患兒入院后24 h內(健康人對照組為體檢當日)采集空腹靜脈血3～4 mL,室溫靜置30 min,以800×g離心10 min進行血清分離,并置于-20 ℃保存待測。

1.2.2實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測血清LncRNA H19和miR-625-5p水平 按照Trizol試劑盒(貨號:SH-2366,北京凱詩源生物科技有限公司)說明書對各組樣本總RNA進行提取,并采用紫外分光光度法對總RNA濃度和純度進行評估。按照M-MLV反轉錄試劑盒(貨號:PR2555,北京普非生物科技有限公司)說明書將RNA反轉錄為cDNA。反轉錄體系:總RNA 2 μL,RNase Free ddH2O 20 μL,PrimeScript RT Master Mix 4 μL。反轉錄條件:42 ℃反轉錄60 min,85 ℃滅活反轉錄酶5 min。LncRNA H19和miR-625-5p引物及U6、GAPDH內參引物由廣州銳博生物公司設計并合成,引物序列見表1。以cDNA為模板,采用qRT-PCR試劑盒(貨號:KT201,北京天根生化科技有限公司)檢測血清樣本中LncRNA H19和miR-625-5p的表達水平。PCR反應體系:0.5 μL cDNA模板,5 μL ddH2O,正、反向引物各0.5 μL,6.5 μL 2×Taq PCR Master Mix。反應條件:95 ℃預變性15 min;95 ℃變性15 s,65 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s,共40個循環(huán)。所有樣本重復3次。LncRNA H19以GAPDH為內參照,miR-625-5p以U6為內參照,使用2-ΔΔCt法計算二者的相對表達水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3HP感染分型檢測 利用HP抗體分型檢測試劑盒(貨號:YDLC-693,上海羽哚生物科技有限公司)檢測患者HP抗體類型,具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。結果判讀:(1)細胞毒素相關蛋白(CagA)、空泡毒素相關蛋白(VacA)區(qū)帶中任意一種或兩種同時出現(xiàn),為Ⅰ型HP抗體陽性;(2)未見CagA和(或)VacA區(qū)帶,為Ⅱ型HP抗體陽性;其中HP感染Ⅰ型68例,HP感染Ⅱ型22例。

2 結果

2.1健康人對照組、HP陰性組、陽性組PU患兒血清LncRNA H19和miR-625-5p水平比較 與健康人對照組相比,HP陰性組、陽性組PU患兒血清LncRNA H19水平顯著升高(P<0.05),miR-625-5p水平顯著降低(P<0.05);陽性組較陰性組血清LncRNA H19水平升高更為明顯(P<0.05),而miR-625-5p水平降低更為顯著(P<0.05)。見表2。

表2 各組血清LncRNA H19和miR-625-5p水平比較

2.2不同分型HP感染PU患兒血清LncRNA H19和miR-625-5p水平比較 HP感染Ⅰ型、HP感染Ⅱ型患兒血清LncRNA H19水平分別為(1.84±0.24)和(1.63±0.20),miR-625-5p水平分別為(0.50±0.07)和(0.62±0.11)。與HP感染Ⅰ型相比,HP感染Ⅱ型PU患兒血清LncRNA H19水平顯著降低(t=3.705,P<0.05),miR-625-5p水平顯著升高(t=6.014,P<0.05)。

2.3PU合并HP感染患兒血清LncRNA H19和miR-625-5p水平的相關性 采用生物信息學在線網(wǎng)絡工具Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/)分析預測LncRNA H19與miR-625-5p間存在結合位點(圖1)。Pearson相關性分析顯示,PU合并HP感染患兒血清LncRNA H19與miR-625-5p水平呈顯著負相關(r=-0.536,P<0.05)。

圖1 LncRNA H19與miR-625-5p間的結合位點

2.4Logistic回歸分析LncRNA H19、miR-625-5p與PU患兒HP感染的關聯(lián) 以PU患兒HP感染情況為因變量,LncRNA H19、miR-625-5p為自變量進行Logistic回歸分析,結果發(fā)現(xiàn),LncRNA H19是影響PU患兒HP感染的危險因素(P<0.05),miR-625-5p是其保護因素(P<0.05)。見表3。

表3 Logistic回歸分析LncRNA H19、miR-625-5p與PU患兒HP感染的關聯(lián)

2.5LncRNA H19、miR-625-5p水平對PU患兒HP感染的診斷價值 ROC曲線顯示,LncRNA H19、miR-625-5p單獨及二者聯(lián)合診斷PU患兒HP感染的AUCROC分別為0.870、0.895和0.935,二者聯(lián)合均優(yōu)于其各自單獨診斷(Z二者聯(lián)合-LncRNA H19=1.991,P=0.023;Z二者聯(lián)合-miR-625-5p=1.707,P=0.044)。見表4和圖2。

圖2 LncRNA H19、miR-625-5p水平診斷PU患兒HP感染的ROC曲線

3 討論

PU具有慢性和復發(fā)性,臨床主要表現(xiàn)為上腹部疼痛、燒心、反酸,及時診斷和治療可最大限度地降低PU相關發(fā)病率和死亡率[11-12]。研究發(fā)現(xiàn),HP感染引發(fā)PU,介導免疫炎癥發(fā)生以及炎癥細胞因子的釋放,其可致強烈而復雜的宿主免疫反應,但不足以消除病原體,造成胃黏膜破環(huán),屏障功能損傷,嚴重者可能會發(fā)生出血、穿孔等并發(fā)癥,嚴重威脅患者的生命健康[13-15]。因此,尋找有助于診斷PU合并HP感染的因子,可以及時加以干預,以便在臨床診療中對患兒進行及時的治療。

LncRNA H19是一種參與發(fā)育調節(jié)的RNA,其通過影響HP感染相關信號,傳導介質促進PU以及上皮屏障功能受損[16-17]。Mohamed等[18]研究發(fā)現(xiàn),HP感染相關的胃潰瘍患者LncRNA H19水平升高,對HP引起的PU的診斷具有較高的準確性、特異性和敏感性。Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn),LncRNA H19在HP感染的胃癌組織和細胞中表達上調,過表達LncRNA H19通過增強NF-κB誘導的炎癥,促進HP感染誘導的胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。miR-625-5p作為miRNA的一種,能夠抑制NF-κB信號傳導,表現(xiàn)出抗炎作用[19]。黃嵐等[20]研究發(fā)現(xiàn),上調miR-625-5p水平可調控STAT3,減輕高糖誘導的心肌細胞凋亡和炎癥反應。Qian等[21]研究發(fā)現(xiàn),人類支氣管上皮細胞中miR-625-5p升高可減少IL-6和TNF-α的分泌,抑制哮喘氣道炎癥。本研究發(fā)現(xiàn),與健康人對照組相比,HP陰性組、陽性組PU患兒血清LncRNA H19水平依次顯著升高,miR-625-5p水平依次顯著降低。提示LncRNA H19、miR-625-5p與PU患兒HP感染具有一定的相關性。研究顯示,HP可分為Ⅰ型菌株[細胞毒素A(CagA)和(或)空泡毒素A(VacA)陽性]與Ⅱ型菌株(CagA和VacA陰性),前者具有較強致病性,為PU的主要致病菌株[22-24]。VacA菌株使胃黏膜細胞發(fā)生空泡樣變性,導致細胞間的緊密連接松弛,削弱胃黏膜的屏障功能,導致黏膜萎縮、糜爛、潰瘍。CagA菌株可刺激炎性因子產生,引起胃黏膜中性粒細胞浸潤,損傷胃黏膜,促進PU的產生。本研究結果顯示,HP Ⅰ型菌株感染數(shù)高于Ⅱ型;與Ⅰ型菌株相比,Ⅱ型患兒血清LncRNA H19水平明顯降低,miR-625-5p水平明顯升高,說明LncRNA H19、miR-625-5p水平與PU患兒HP感染分型存在相關性,二者可用于分析PU患兒HP感染分型情況。

本研究還發(fā)現(xiàn),使用Starbase工具預測LncRNA H19與miR-625-5p間存在結合位點,且PU合并HP感染患兒血清LncRNA H19與miR-625-5p水平呈負相關。提示LncRNA H19與miR-625-5p之間具有相互作用,可影響患兒HP感染情況,與既往研究相一致[8]。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn),LncRNA H19是影響PU患兒HP感染的危險因素,miR-625-5p則是保護因素,提示二者可作為評估PU患兒HP感染的生物學標志物,并可能作為臨床靶向治療PU患兒HP感染的靶點。筆者推測高水平的LncRNA H19通過負調控miR-625-5p,增強NF-κB誘導的炎癥,破壞上皮屏障功能,促進HP感染。經ROC曲線分析,LncRNA H19、miR-625-5p二者聯(lián)合診斷PU患兒HP感染的AUCROC為0.935,均優(yōu)于其各自單獨診斷,提示二者聯(lián)合對PU合并HP感染具有一定的診斷價值,臨床醫(yī)師可通過比較治療前后患兒LncRNA H19、miR-625-5p水平評估療效,對不接受胃鏡復查患兒有一定的臨床應用價值。

綜上所述,PU合并HP感染患兒血清LncRNA H19水平升高,miR-625-5p水平降低,對PU合并HP感染具有一定的診斷價值。然而,仍需大量樣本對LncRNA H19和miR-625-5p在PU合并HP感染患兒中的臨床意義進行進一步驗證,并需要通過細胞和動物實驗以及通過基因敲除或過表達方法進一步探究二者在PU合并HP感染中的作用機制,為二者在臨床應用中提供更充分的實驗依據(jù)。