腎透明細(xì)胞癌患者尿液細(xì)胞外囊泡中miR-126-5p及miR-150-5p水平聯(lián)合檢測(cè)的價(jià)值*

張鈺,陳陽,朱蕓華,張楠,王成,汪俊軍

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院＆東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科,南京 210002)

腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是腎細(xì)胞癌最常見的病理亞型,尚無高靈敏度和特異性血清學(xué)標(biāo)志物,早期癥狀隱匿,約20%～30%的患者在診斷時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致預(yù)后較差[1],因此,尋找高價(jià)值的ccRCC早期診斷標(biāo)志物具有重要意義。細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是由細(xì)胞主動(dòng)分泌的介導(dǎo)細(xì)胞間通訊作用的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)成分,既往研究已證實(shí),腫瘤細(xì)胞分泌的EVs攜帶自身信息的miRNA等物質(zhì),可反映細(xì)胞及機(jī)體實(shí)時(shí)病理狀態(tài),極具早期分子標(biāo)志物潛能[2-3]。另有研究顯示,miR-126-5p和miR-150-5p與血管生成密切相關(guān)[4-5],在腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用,但ccRCC 患者尿液EVs中二者水平變化及聯(lián)合檢測(cè)價(jià)值未見報(bào)道。本研究擬通過檢測(cè)和分析ccRCC患者尿液EVs中miR-126-5p和miR-150-5p水平變化,評(píng)估其作為早期ccRCC患者輔助診斷分子標(biāo)志物的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 收集2022年5月至2023年2月于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院(東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院)泌尿外科初診且經(jīng)病理活檢確診為ccRCC的患者尿液標(biāo)本48例,男性40例,女性8例,年齡(53.6±1.6)歲。所有標(biāo)本均在手術(shù)或藥物治療前采集。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)ccRCC伴有急性感染、乙肝、結(jié)核或其他器官腫瘤患者;(2)其他腎臟良性及惡性腫瘤,如血管平滑肌脂肪瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、腎嫌色細(xì)胞癌、乳頭狀腎細(xì)胞癌等;(3)接受過手術(shù)或藥物干預(yù)的ccRCC患者。所有患者均根據(jù)第八版美國癌癥聯(lián)合會(huì)(American joint committee on cancer, AJCC) TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行評(píng)估。同期收集本院體檢中心48例年齡、性別匹配的體檢健康者[男性39例,女性9例,年齡(53.4±1.1)歲]的尿液標(biāo)本作為健康人對(duì)照,其肝腎功能正常,排除惡性腫瘤、炎癥性循環(huán)系統(tǒng)疾病或其他可能影響尿液性質(zhì)的疾病。本研究經(jīng)東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.2017NZGKJ-068),各研究對(duì)象均知情同意。

1.2主要試劑與儀器 細(xì)胞外囊泡提取試劑盒 ExoQuick-TCTMExosome(美國SBI公司),Trizol試劑(美國 Life Technologies 公司),氯仿、異丙醇、無水乙醇(上海國藥集團(tuán)試劑公司),DEPC水(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),人工合成miR-126-5p及miR-150-5p成熟體(廣州銳博生物技術(shù)有限公司),TaqMan探針(美國Applied Biosystems公司),qRT-PCR體系所用試劑(大連TaKaRa公司)。5418型高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司),Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher Scientific公司),高速低溫組織研磨儀(武漢賽維爾生物科技有限公司),TL988-Ⅳ 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(西安天隆科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1尿液EVs分離 收集ccRCC患者及健康人對(duì)照的晨尿樣本后立即于室溫3 000×g離心10 min,去除沉淀物和細(xì)胞碎片,取1～2 mL上清并置于-80 ℃保存;按照ExoQuick-TCTMExosome試劑盒說明書從500 μL尿液中分離EVs,并重懸于50 μL DEPC水中。

1.3.2EVs RNA樣本提取 按照本課題組前期建立的方法[7],采用Trizol試劑從EVs重懸液中提取RNA,以20 μL DEPC水溶解所得產(chǎn)物,樣本置于-80 ℃待用。

1.3.3qRT-PCR檢測(cè)EVs miRNA水平 運(yùn)用基于TaqMan探針的qRT-PCR法檢測(cè)尿液EVs中miR-126-5p和miR-150-5p的表達(dá)水平。miRNA逆轉(zhuǎn)錄PCR、qRT-PCR反應(yīng)體系和PCR參數(shù)設(shè)置參照本課題組前期研究[7]。以不含RNA模板的ddH2O為陰性對(duì)照,每份樣本Ct值為3次復(fù)孔的均值。采用梯度稀釋的人工合成miRNA成熟體,與待測(cè)樣本反應(yīng)體系一致并同步進(jìn)行,以標(biāo)準(zhǔn)miRNA濃度的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo),測(cè)得的Ct值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)各樣本所得Ct值對(duì)miR-126-5p和miR-150-5p進(jìn)行絕對(duì)定量。

1.3.4miRNA靶基因及功能預(yù)測(cè) miRNA靶基因預(yù)測(cè)采用在線數(shù)據(jù)庫TargetScan8.0(https://www.targetscan.org/vert_80/),miRDB(https://mirdb.org/)和miRwalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)進(jìn)行,取三者交集為預(yù)測(cè)靶基因;進(jìn)一步利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析,以預(yù)測(cè)靶基因的潛在生物學(xué)功能和調(diào)控通路。

2 結(jié)果

2.1ccRCC患者及健康人對(duì)照腎功能指標(biāo)及尿液EVs miR-126-5p和miR-150-5p水平 ccRCC患者和健康人對(duì)照腎功能指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),ccRCC患者尿液EVs miR-126-5p和miR-150-5p含量明顯高于健康人對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001 2,P<0.000 1)。與健康人對(duì)照相比,臨床Ⅰ期ccRCC患者的尿液EVs miR-126-5p和miR-150-5p水平亦顯著升高(P=0.000 2,P=0.000 1)。見表1。

表1 ccRCC患者及健康人對(duì)照腎功能指標(biāo)及尿液EVs miR-126-5p和miR-150-5p表達(dá)水平

2.2ROC曲線分析尿液EVs篩查ccRCC的價(jià)值 miR-126-5p區(qū)分健康人對(duì)照和ccRCC的AUCROC為0.690(95%CI:0.585～0.794),區(qū)分Ⅰ期ccRCC的AUCROC為0.734(95%CI:0.630～0.839);尿液EVs miR-150-5p用于區(qū)分ccRCC的AUCROC為0.787(95%CI:0.692～0.881),區(qū)分Ⅰ期ccRCC的AUCROC為0.736(95%CI:0.602～0.870)。兩種miRNA組合區(qū)分ccRCC的AUCROC為0.815(95%CI:0.724～0.905),區(qū)分Ⅰ期ccRCC的AUCROC為0.855(95%CI:0.776～0.946)。見圖1。

注:A,尿液EVs miRNA篩查ccRCC價(jià)值;B,尿液EVs miRNA篩查臨床Ⅰ期ccRCC價(jià)值。

2.3ccRCC患者尿液EVs miR-126-5p和miR-150-5p與臨床腎功能指標(biāo)的相關(guān)性結(jié)果 尿液EVs miR-126-5p及miR-150-5p含量與血清肌酐水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.476,P=0.001;r=-0.345,P=0.016),而與尿素和尿酸水平的相關(guān)性差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 ccRCC患者尿液EVs miR-126-5p和miR-150-5p與臨床腎功能指標(biāo)的相關(guān)性

2.4生物信息學(xué)分析 聯(lián)合運(yùn)用TargetScan 8.0,miRDB和miRwalk在線數(shù)據(jù)庫,取三者預(yù)測(cè)靶基因的交集得到miR-126-5p和miR-150-5p的靶基因分別有146和49種;進(jìn)一步用DAVID(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)數(shù)據(jù)庫通路富集分析結(jié)果顯示,miR-126-5p主要調(diào)控軸突引導(dǎo),而miR-150-5p與多種癌癥發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),主要參與Wnt、磷脂酰肌醇三激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)等信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。見圖2。

注:A,miR-126-5p靶基因預(yù)測(cè)與KEGG通路;B,miR-150-5p靶基因預(yù)測(cè)與KEGG通路。

3 討論

EVs miRNA具備作為ccRCC的新型分子標(biāo)志物潛能[2],可為機(jī)體的病理動(dòng)態(tài)變化提供更具價(jià)值的線索[8]。本研究針對(duì)ccRCC患者尿液EVs中與血管生成密切相關(guān)miR-126-5p和miR-150-5p的變化開展研究,發(fā)現(xiàn)ccRCC患者特別是早期(臨床Ⅰ期)患者尿液EVs中miR-126-5p、miR-150-5p均上調(diào),與ccRCC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)ccRCC患者尿液EVs中miR-126-5p與miR-150-5p水平較健康人對(duì)照顯著升高。目前,尚無尿液EVs miR-126-5p變化及價(jià)值報(bào)道,相關(guān)研究主要集中于外周血。Dias等[9]發(fā)現(xiàn)腫瘤切除后ccRCC患者血漿EVs來源的miR-126-5p表達(dá)下調(diào),提示EVs miR-126-5p水平升高可反映腎腫瘤發(fā)生發(fā)展,這與本研究結(jié)果一致。本研究聚焦于尿液EVs來源的miRNA,關(guān)注其早期診斷價(jià)值,發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)miR-126-5p和miR-150-5p水平有望輔助篩查早期ccRCC。此外,miR-150-5p在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤等多種惡性腫瘤中均存在異常表達(dá)[5]。既往研究[10]已證實(shí)miR-150-5p在RCC患者血清及腎癌細(xì)胞系來源的EVs中表達(dá)上調(diào),且血清miR-150-5p可以輔助RCC患者的診斷(AUCROC=0.717),但其早期診斷價(jià)值及其在尿液EVs中的價(jià)值尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)ccRCC患者尿液EVs中miR-150-5p水平升高,在病程早期已有明顯趨勢(shì),篩查價(jià)值更優(yōu)。

研究表明[11],miR-126-5p和miR-150-5p與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),與本研究的生信分析結(jié)果相一致。結(jié)果顯示,miR-126-5p參與軸突引導(dǎo)通路。據(jù)報(bào)道ccRCC中軸突引導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白SEMA6A的過表達(dá),促進(jìn)了ccRCC的惡性表型[12]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-150-5p參與調(diào)控Wnt、PI3K-Akt等與癌癥密切相關(guān)的信號(hào)通路,在ccRCC中發(fā)揮重要作用。Gorka等[13]發(fā)現(xiàn)Wnt通路活性受特定miRNA表達(dá)水平影響,調(diào)節(jié)ccRCC中上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)進(jìn)程。同時(shí),本研究預(yù)測(cè)顯示miR-150-5p靶基因?yàn)槟[瘤蛋白P53(TP53),是腎嫌色細(xì)胞癌中最常見的體細(xì)胞突變基因[14],可導(dǎo)致舒尼替尼耐藥,與患者預(yù)后相關(guān)[15],對(duì)此通路深入研究或可為ccRCC治療耐藥提供新的思路。

本研究通過ROC曲線證實(shí)尿液EVs來源的miR-126-5p及miR-150-5p單獨(dú)或聯(lián)合檢測(cè)均具備較好的早期ccRCC診斷效能,且miR-126-5p及miR-150-5p與ccRCC患者血清肌酐水平均呈顯著負(fù)相關(guān),提示其可表征腎功能的損傷。目前,關(guān)于尿液EVs miRNA作為早期篩查腎細(xì)胞癌的標(biāo)志物鮮有報(bào)道[16-17],其價(jià)值有待深入挖掘。尿液EVs miRNA具有無創(chuàng)便捷、易于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腎臟等優(yōu)點(diǎn),但仍面臨諸多挑戰(zhàn)。例如EVs分離、定量的方法尚未標(biāo)準(zhǔn)化,各研究間可比性較差等。本研究采用試劑盒提取尿液EVs,方便快捷,適合單樣本水平操作,對(duì)于EVs miRNA的臨床轉(zhuǎn)化較具優(yōu)勢(shì)。

本研究尚存在一定局限性:(1)樣本量偏少,缺乏晚期ccRCC患者,尿液EVs miR-126-5p及miR-150-5p與臨床分期的相關(guān)性尚不清楚;(2)僅收集治療前標(biāo)本,未對(duì)比治療前后的表達(dá)水平變化;(3)EVs miR-126-5p及miR-150-5p的來源、去路、對(duì)其調(diào)控的生物學(xué)功能有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)ccRCC患者尤其是早期患者尿液EVs miR-126-5p及miR-150-5p水平顯著升高,二者聯(lián)合檢測(cè)具備較優(yōu)的早期篩查價(jià)值。同時(shí),miR-126-5p及miR-150-5p與ccRCC的進(jìn)展關(guān)系密切,對(duì)其調(diào)控機(jī)制及腫瘤生物學(xué)功能深入探究或可為ccRCC的診治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。