多重?cái)?shù)字PCR平臺(tái)檢測cfDNA突變在NSCLC患者中的應(yīng)用評估*

周小勻,彭穎斐,周琰,陳馨寧,潘柏申,王蓓麗,郭瑋

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 200032)

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見、死亡率最高的癌癥之一,其中非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)約占85%[1],超過70%的患者在確診時(shí)已處于晚期[2],手術(shù)切除可能性小,臨床預(yù)后差。上皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是亞裔NSCLC人群中常見的驅(qū)動(dòng)基因,臨床使用上皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)進(jìn)行靶向治療能顯著提高患者的無進(jìn)展生存率和總生存率[3-4]。多數(shù)患者使用EGFR-TKIs治療后會(huì)發(fā)生獲得性耐藥,有學(xué)者推薦檢測外周血循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)中EGFR基因突變狀態(tài)[5],據(jù)此及時(shí)調(diào)整治療方案[6]。

目前用于檢測外周血EGFR基因突變的常用方法包括超級擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(super amplification refractory mutation system, Super-ARMS)、下一代測序(next-generation sequencing, NGS)和數(shù)字PCR(digital PCR,dPCR)等。其中,dPCR快速、靈敏度高、成本較低,便于臨床推廣。本研究旨在建立并評價(jià)一種新的多重dPCR檢測平臺(tái)檢測NSCLC患者血漿游離DNA(circulating cell-free DNA,cfDNA)標(biāo)本中EGFR基因突變情況,為其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持,以期幫助患者進(jìn)行靶向用藥篩選以及動(dòng)態(tài)監(jiān)測療效。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2019年6月至2020年11月于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科就診的49例NSCLC患者,男13例,女35例,年齡(65.4±11.2)歲。所有患者均根據(jù)其病理組織學(xué)檢測結(jié)果確診為NSCLC,且均有Super-ARMS法(由檢驗(yàn)科提供)檢測結(jié)果。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)病理組織學(xué)明確診斷,病理分期參考美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)發(fā)布的非小細(xì)胞肺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[5];(2)年齡≥18歲;(3)未行抗貧血及任何抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)小細(xì)胞肺癌患者;(2)合并其他惡性腫瘤,嚴(yán)重心血管、肝、腎功能不全的患者;(3)接受EGFR-TKIs治療患者;(4)臨床病理資料缺失或失訪患者。本研究獲得復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號:B2019-255R),所有研究對象均知情同意。

1.2主要儀器與試劑 Naica微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)及Naica Geode熱循環(huán)儀(法國Stilla Technologies公司),Qubit 3.0熒光定量儀(美國Thermo Fisher公司),安捷倫Agilent 2100 生物分析儀(美國Agilent公司),熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)。游離核酸提取試劑盒(德國Qiagen公司),QubitTM雙鏈DNA高靈敏度熒光定量試劑盒(美國Ivitrogen公司),人類EGFR突變基因檢測試劑盒(廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司),人類EGFR基因突變檢測試劑盒(數(shù)字PCR法),定制的EGFRL858R、19Del和T790M突變質(zhì)粒(蘇州艾普拜生物科技有限公司),EGFR基因多重參考品HD802(gDNA,美國Horizon公司)。

1.3方法

1.3.1性能驗(yàn)證

1.3.1.1檢測精密度(批內(nèi)精密度和批間精密度) 將L858R、19Del、T790M突變型質(zhì)粒分別用野生型樣本稀釋,配制高(10%)、中(5%)、低(1%)3個(gè)豐度的標(biāo)準(zhǔn)品,每種突變類型的3個(gè)豐度重復(fù)檢測3次,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差(standard debiation,SD)與變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)[7],以CV<15%為達(dá)到廠商聲明,驗(yàn)證通過。

1.3.1.2檢測靈敏度(檢測限) 依據(jù)檢測系統(tǒng)的預(yù)估檢測限,將L858R、19Del、T790M突變型質(zhì)粒分別用野生型樣本稀釋,配制檢測限以上(0.5%)、預(yù)估檢測限(0.1%)、檢測限以下(0.05%)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,每種突變類型的每個(gè)豐度重復(fù)檢測10次,對檢測限及以上的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒均檢出為驗(yàn)證通過。

1.3.1.3空白限 在2個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)中對空白樣本(純水)進(jìn)行20次重復(fù)檢測,最終將空白限設(shè)置為重復(fù)測試空白樣本時(shí)可測得的最高突變濃度。

1.3.1.4檢測線性 將定制已知等位基因攜帶突變L858R、19Del、T790M突變質(zhì)粒與野生型樣本按照以下比例混合得到梯度突變比例樣本:L1(10%)、L2(1%)、L3(0.5%)、L4(0.1%)與L5(0.05%)。對各樣本進(jìn)行3次重復(fù)檢測,計(jì)算均值并得到線性關(guān)系,分析實(shí)際檢測結(jié)果與預(yù)期值的相關(guān)性以確認(rèn)檢測線性。

1.3.2臨床評估 將本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果與用于血漿EGFR檢測的Super-ARMS法檢測結(jié)果對比,計(jì)算方法符合率,包括陽性符合率、陰性符合率和總符合率(陽性符合率=兩方法均陽性結(jié)果數(shù)/參比方法陽性結(jié)果數(shù)×100%;陰性符合率=兩方法均陰性結(jié)果數(shù)/參比方法陰性結(jié)果數(shù)×100%;總符合率=兩方法一致結(jié)果數(shù)/總結(jié)果數(shù)×100%),并使用Pearson卡方檢驗(yàn)比較兩種方法所得結(jié)果的差異。

1.4EGFR突變檢測 采用分離膠型真空管在患者接受治療前采集20 mL乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝全血,2～8 ℃、10 000×g離心10 min,吸取上層血漿置于1.5 mL尖底離心管中,再以20 000×g離心10 min,分離血漿于2 mL圓底離心管中。取9 mL血漿,按照游離核酸提取試劑盒說明書操作抽提cfDNA。按照QubitTM雙鏈DNA高靈敏度熒光定量試劑盒說明書定量檢測cfDNA濃度及混合測序(pooling)文庫DNA濃度,要求文庫DNA濃度>0.5 ng/μL。使用Agilent 2100生物分析儀對cfDNA和文庫DNA進(jìn)行片段長度分析,要求臨床樣本cfDNA在160～180 bp處有典型的峰,且在3 000 bp處無基因組DNA污染峰,pooling文庫DNA在600～1 300 bp處有典型的峰[8]。

使用Naica微滴芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)(藍(lán)寶石芯片)及人類EGFR基因突變檢測試劑盒(數(shù)字PCR法)檢測EGFR突變。每個(gè)試管中加入25 μL反應(yīng)混合物,包括dPCR Mix1和dPCR Mix2(分別為5 μL和1.5 μL)、引物和探針的多重混合物1 μL、無核酸酶水7.5 μL以及待測樣本10 μL(不足10 μL時(shí)用無核酸酶水補(bǔ)足體積)。另設(shè)立空白對照品(純水)、陽性對照品。將芯片裝入Naica Geode熱循環(huán)儀,以分隔液滴并進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR循環(huán)參數(shù):95 ℃ 5 min;95 ℃ 20 s,60 ℃ 30 s,共45個(gè)循環(huán)。使用Naica Prism3閱讀器對藍(lán)寶石芯片進(jìn)行成像。依據(jù)泊松分布原理,使用Crystal Miner軟件(法國Stilla Technologies公司)根據(jù)公式NDual=N×(1-e-λc1)×(1-e-λc2)[9]分析dPCR的原始數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1性能驗(yàn)證

2.1.1檢測精密度 精密度試驗(yàn)結(jié)果見表1。新平臺(tái)對于3種突變百分比在高、中、低3個(gè)豐度(10%、5%和1%)的CV均小于15%,檢測精密度高,達(dá)到廠商聲明標(biāo)準(zhǔn)。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2檢測靈敏度與空白限 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果見表2。新平臺(tái)對于3種常見突變位點(diǎn)的高于、等于及低于預(yù)估檢測限的檢測結(jié)果均成功報(bào)告陽性,初步認(rèn)為新平臺(tái)對于此3種突變的檢測靈敏度極高。根據(jù)實(shí)際檢測結(jié)果和空白限計(jì)算公式:LoB=Meanblank+1.645×SDblank,可得L858R、19Del、T790M的檢測空白限分別為0.038 2、0.000和0.053。

表2 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3檢測線性 線性試驗(yàn)結(jié)果見圖1。T790M、19Del、L858R突變百分比在0.05%～10%(0.05%、0.1%、0.5%、1%、10%)時(shí),實(shí)測值與預(yù)期百分比的線性回歸方程分別為:Y=0.974X+0.002(R2=0.997 7,P<0.01)、Y=0.915 6X+0.184(R2=0.995 4,P<0.01)、Y=0.917X+0.019(R2=0.998 4,P<0.01),五點(diǎn)回歸線斜率接近1,相關(guān)性顯著。

注:A,T790M線性圖,X軸為期望突變豐度Log值,Y軸為實(shí)測突變豐度Log值;B,外顯子19Del線性圖,X軸為期望突變豐度Log值,Y軸為實(shí)測突變豐度Log值;C,L858R線性圖,X軸為期望突變豐度Log值,Y軸為實(shí)測突變豐度Log值。

2.2臨床評估結(jié)果 分別使用dPCR平臺(tái)和Super-ARMS平臺(tái)檢測49例臨床標(biāo)本的EGFR基因突變情況,兩種方法的結(jié)果比對見圖2。

圖2 dPCR法與Super-ARMS法檢測臨床標(biāo)本結(jié)果

兩種方法的符合率如表3所示,基于多重dPCR的新平臺(tái)與Super-ARMS檢測S768I、G719X、19Del、T790M、20ins、L858R突變的方法總符合率分別為100%、100%、100%、97.96%、93.62%和89.80%。兩種方法對突變位點(diǎn)的檢測結(jié)果進(jìn)行卡方檢驗(yàn),P均>0.05(表4),dPCR新平臺(tái)的檢測結(jié)果與Super-ARMS法檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 49例臨床樣本的dPCR法與Super-ARMS法檢測方法符合率

表4 Pearson卡方檢驗(yàn)結(jié)果

3 討論

研究表明,攜帶EGFR基因敏感突變的NSCLC患者使用EGFE-TKIs治療后可有效改善其預(yù)后[4-5]。外周血中的ctDNA因其取材安全無創(chuàng)與不易受腫瘤異質(zhì)性影響,在實(shí)施動(dòng)態(tài)監(jiān)測NSCLC晚期患者中具有較大優(yōu)勢,但其豐度極低且高度片段化,易受高濃度野生型血漿游離DNA的干擾,需要靈敏度極高的方法才能對血漿EGFR基因突變進(jìn)行檢測。

本研究評估的多重dPCR平臺(tái)在檢測精密度、靈敏度、空白限及線性的性能驗(yàn)證結(jié)果良好,能夠滿足臨床檢測需求。與同類檢測平臺(tái)相比,Wang等[10]使用微滴式dPCR QX200TM系統(tǒng)檢測ctDNA的檢測限達(dá)0.02%;劉曉蕾[11]構(gòu)建了基于TaqMan-MGB雙探針熒光定量PCR技術(shù)的微流控芯片數(shù)字PCR檢測體系用于檢測外周血EGFR基因突變,在104copies/μL內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,靈敏度可達(dá)0.01%～0.001%。本研究的多重dPCR平臺(tái)檢測性能與上述同類平臺(tái)性能基本相當(dāng)。此外,構(gòu)建的多重dPCR新平臺(tái)還具備加樣量少,能同時(shí)檢出39種EGFR位點(diǎn)突變等優(yōu)點(diǎn),其中新增加的C797S位點(diǎn)是最新報(bào)道的EGFE-TKIs治療后關(guān)鍵突變[12]。

多重dPCR新平臺(tái)結(jié)合組織病理結(jié)果、影像學(xué)結(jié)果能為NSCLC患者靶向藥物治療效果提供全面的評估依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)多例突變豐度極低的cfDNAEGFR突變標(biāo)本,拷貝數(shù)在10-3數(shù)量級。這些標(biāo)本用dPCR新平臺(tái)檢測結(jié)果為陽性,但是可能受限于Super-ARMS方法檢測靈敏度低而被漏檢。已有研究表明EGFR的突變豐度與治療反應(yīng)等關(guān)聯(lián)密切[13],多重dPCR新平臺(tái)能夠利用血漿中DNA豐度較低的優(yōu)勢使其檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確,可以輔助靶向治療。本研究的不足之處在于臨床評估樣本例數(shù)較少,且由于時(shí)間與樣本資源比較緊張,未對患者進(jìn)行長期隨訪研究,與之相匹配的病理結(jié)果等臨床資料欠缺。

在未來的研究中,EGFR、ALK、ROS1基因和其他癌基因的評估有望在同一dPCR平臺(tái)上得以簡化整合,并有望獲取到臨床信息更全面、留有組織活檢結(jié)果、包含罕見突變的樣本進(jìn)行深入分析研究。盡管NGS可以并行分析多種突變,包括未知突變,但dPCR因其靈敏度高、結(jié)果易解讀、檢測時(shí)間較短、成本較低仍然是臨床檢測中合適的方法。本研究初步表明dPCR平臺(tái)具有良好的檢測性能和成本效益,能夠很好地輔助NSCLC患者的臨床診斷和靶向治療。