電壓門控鉀通道亞家族G成員1在肺癌中的表達及生物學作用

程峰, 彭詩晴, 曹楊, 陸益民

(1. 江蘇大學醫(yī)學院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013; 2. 江蘇大學附屬昆山醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學, 江蘇 蘇州 215300)

肺癌以侵襲度高、病情進展快、預后差為主要特征[1]。根據(jù)2020年全球癌癥研究報告,肺癌約占所有癌癥病例11.4%,致死率約占所有癌癥病例18.0%[2]。目前,外科手術、免疫治療和化療是肺癌主要的治療手段,但晚期肺癌患者惡性程度高,遠處轉移風險高,總生存期短,預后差[3-6]。

鉀離子通道蛋白是一類跨膜蛋白,在調(diào)節(jié)神經(jīng)信號傳導,防止神經(jīng)元過度興奮和上皮電解質(zhì)轉運等方面起關鍵作用[7-9]。最新研究表明,由于其結構和功能的多樣性,鉀離子通道蛋白的異常表達參與多種腫瘤的發(fā)生[10-11],包括胃癌[12]、前列腺癌[13]和宮頸癌[14]等。電壓門控鉀通道亞家族G成員1(potassium voltage-gated channel subfamily G member 1,KCNG1)為鉀離子通道家族成員之一,定位于染色體20q 13.13,通過與kv2.1(電壓門控鉀通道亞家族B成員1,KCNB1)形成功能性四聚體通道調(diào)控該離子通道的生物學功能[15]。目前關于KCNG1的研究多集中在房顫[16]和癲癇[17]等,僅Du等[18]證實KCNG1可作為頭頸部鱗狀細胞癌的一個預后指標。本研究擬基于生物信息學分析,并結合體外細胞功能學實驗初步驗證KCNG1在肺癌中的表達及生物學功能。

1 材料與方法

1.1 生物信息學分析

1.1.1KCNG1mRNA差異表達分析 基于TCGA泛癌數(shù)據(jù)集(https://www.cancer.gov/tcga/)下載肺癌樣本高通量測序數(shù)據(jù)(HTSeq),包含1 145份非配對組織樣本(癌旁組織108例,肺癌組織1 037例)和212例配對組織樣本(癌旁組織106例,肺癌組織106例),采用R軟件(第3.6.3版)進行統(tǒng)計分析,并結合ggplot2軟件包進行可視化,KCNG1mRNA在兩組間表達差異采用Wilcoxon秩和檢驗進行比較分析。

1.1.2KCNG1mRNA表達與肺癌患者臨床病理特征、預后的關系及預測模型的構建 從TCGA泛癌數(shù)據(jù)集下載肺癌樣本高通量測序數(shù)據(jù),根據(jù)KCNG1mRNA相對表達水平中位數(shù)分為KCNG1mRNA高表達組及低表達組,采用χ2檢驗分析KCNG1mRNA表達水平與肺癌患者臨床病理特征的相關性。

采用Kaplan-Meier曲線和log-rank檢驗比較KCNG1mRNA高表達組和KCNG1mRNA低表達組患者總體生存期;并針對不同病理特征的肺癌患者,比較KCNG1mRNA高表達和低表達者的生存差異。

基于肺癌患者的預后對不同的臨床病理特征、KCNG1mRNA表達水平等進行單因素Cox回歸分析并將結果繪制成森林圖;進一步采用多因素Cox回歸分析,并納入P<0.05的因素,采用R軟件中RMS軟件包建立列線圖模型,預測肺癌患者1年、3年、5年總生存期。預測模型通過校準曲線進行可視化評估,良好列線圖預測模型的散點落在45°對角線上[19]。

1.1.3 KCNG1相關差異表達基因分析 采用R軟件中DESeq2軟件包對KCNG1mRNA高表達組及低表達組間差異表達基因進行分析鑒定。篩選閾值設置為|log2[差異倍數(shù)(fold change,FC)]|>1.5,一般默認|log2(FC)|>1為差異基因的篩選標準和校正后P值<0.05,采用火山圖可視化篩選后的差異基因,并在熱圖中顯示與KCNG1相關的差異基因。

1.1.4 GO/KEGG富集分析和GSEA 采用clusterProfiler軟件包(3.14.3版本)對KCNG1相關差異表達基因進行GO和KEGG富集分析,GO富集分析KCNG1主要參與的生物學過程、細胞分布和分子功能;KEGG富集分析KCNG1相關差異表達基因主要參與的信號通路,并映射成氣泡圖。GSEA是基于TCGA數(shù)據(jù)庫中肺癌組織的轉錄本數(shù)據(jù),采用clusterProfiler包(3.14.3版本)進行富集分析,設定標準:錯誤發(fā)現(xiàn)率<0.25及校正后P值<0.05。

1.2 細胞實驗

1.2.1 細胞系、主要試劑和儀器 人肺癌A549、H1299細胞系及人肺泡上皮細胞購自中國科學院上海生物科學研究所;F-12K培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco公司;KCNG1小干擾試劑盒、KCNG1引物和5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(EdU)檢測試劑盒購自廣州銳博生物技術公司;RNA快速提取試劑盒購自上海奕杉生物有限公司;逆轉錄試劑盒及SYBR Green染料購自康為世紀生物科技有限公司;實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀購自上海宏石醫(yī)療科技有限公司;PVDF膜購自德國Millipore公司;兔抗人KCNG1(Sino Biological公司);GAPDH一抗、羊抗兔IgG(英國Abcam公司);增強化學發(fā)光試劑(ECL,德國Millipore公司);Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠(美國Corning公司);血管生成擬態(tài)實驗試劑盒(德國Ibidi公司);多功能酶標儀(瑞士Tecan公司);熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2.2 細胞轉染及分組 將處于對數(shù)生長期的肺癌A549和H1299細胞以每孔3×104個密度接種于6孔板中,分為KCNG1敲低組1、KCNG1敲低組2以及對照組。待細胞融合率接近50%時,將兩個不同小干擾siRNA序列及陰性對照組siRNA序列分別轉入A549及H1299細胞中,轉染36～48 h;收集各組細胞用于后續(xù)實驗,采用蛋白質(zhì)免疫印跡法驗證轉染效率。siRNA序列如下:KCNG1敲低組1,TCCTCAACGTGTGCGATGA;KCNG1敲低組2,TCAACGTAGGCGGCATCAA。

1.2.3 qRT-PCR檢測KCNG1mRNA表達水平 采用RNA快速提取試劑盒提取細胞中總RNA,然后逆轉錄合成cDNA,最后用SYBR Green PCR Master Mix配置20 μL反應體系行qRT-PCR。具體反應體系:10 μL 2×Ultra SYBR Mixture、0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物、0.8 μL cDNA、8.4 μL雙蒸水。反應條件:95 ℃預變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火1 min。β-肌動蛋白為內(nèi)參。引物序列:KCNG1上游5′-TACTCGCTGCCCTGGACC-3′,KCNG1下游5′-AAGGTCAGGATAGTGCCGAAG-3′;β-肌動蛋白上游5′-TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG-3′,β-肌動蛋白下游5′-ACATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′。通過2-ΔΔCt方法計算目的mRNA相對表達水平。

1.2.4 蛋白免疫印跡檢測KCNG1蛋白表達水平 將處于對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板(每孔1×106個),待每孔細胞融合率達90%時,PBS清洗2次;加入蛋白裂解液,并置于冰上裂解15 min;于4 ℃行12 000 r/min離心15 min;取上清液,行BCA蛋白定量;100 ℃變性失活8 min。10% SDS-PAGE 80 V電泳120 min至不同分子量的蛋白完全分離;300 mA轉膜90 min,將蛋白轉至PVDF膜;10%脫脂牛奶封閉2 h;加入兔抗人KCNG1抗體(1 ∶2 000稀釋)及兔抗人GAPDH抗體(1 ∶3 000稀釋),4 ℃孵育過夜;TBST洗膜3次,每次6 min;加入二抗羊抗兔IgG(1 ∶4 000稀釋)室溫孵育2 h;TBST洗膜3次;添加ECL于凝膠成像儀曝光,用Image J軟件進行灰度值量化分析。

1.2.5 EdU細胞增殖實驗檢測細胞增殖能力 將轉染siRNA后的A549、H1299細胞及其對照組細胞分別接種至24孔板中(每孔2×104個細胞),孵育24 h;采用EdU細胞增殖試劑盒對細胞進行染色。在熒光顯微鏡下隨機選擇3個細胞視野并拍照,計算平均EdU陽性核比率。

1.2.6 Transwell及Matrigel Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力 Transwell及Matrigel Transwell實驗均采用8 μm孔徑的嵌入小室。分別將轉染siRNA后的A549和H1299及其對照組細胞以空白培養(yǎng)液重懸,以每孔3.5×104個細胞密度接種于上室中(Matrigel Transwell實驗需要在小室上側預先包被基質(zhì)膠),下室加入0.6 mL含20%胎牛血清的F-12K培養(yǎng)液,置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h;用棉簽刮取小室上表面細胞,而小室下側細胞用4%多聚甲醛固定15 min;2.5%結晶紫染色30 min;倒置顯微鏡觀察,隨機選擇3個區(qū)域拍照并進行細胞計數(shù)。

1.2.7 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力 分別將轉染siRNA后的A549和H1299及其對照組細胞接種于6孔板中(每孔約4×105個細胞),當每孔細胞融合度達90%左右時,用相同規(guī)格(20 μL)的移液槍槍頭在孔內(nèi)劃直線;PBS清洗2遍;加入空白培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h;顯微鏡下觀察并拍照,通過計算0 h及24 h的劃痕面積,比較不同組劃痕愈合情況。

1.2.8 血管生成擬態(tài)實驗檢測細胞成管能力 采用血管生成擬態(tài)實驗試劑盒,在下室中加入10 μL Matrigel基質(zhì)膠,分別將轉染siRNA后的A549及其對照組細胞接種于上室(每室含2×104個細胞),于37 ℃含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育18 h;顯微鏡下觀察并拍照,比較不同組細胞成管的數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 KCNG1 mRNA在肺癌組織中的相對表達水平

基于TCGA數(shù)據(jù)庫共獲得1 145份未配對組織樣本(108例癌旁組織,1 037例肺癌組織)和212例配對樣本(106例癌旁組織,106例肺癌組織),如圖1所示,KCNG1mRNA在肺癌組織中的相對表達水平顯著高于癌旁組織(P均<0.001)。

A:非配對樣本;B:配對樣本

2.2 KCNG1 mRNA相對表達水平與肺癌患者臨床病理特征之間的相關性

基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析KCNG1mRNA高表達和低表達患者之間臨床特征的差異,剔除重復樣本后,共納入609例肺癌患者,如表1所示。結果顯示KCNG1mRNA相對表達水平與肺癌患者N和M分期、病理學分級、性別、年齡及吸煙史臨床特征相關(P均<0.05)。

表1 KCNG1 mRNA相對表達水平與肺癌患者一般臨床特征間的關系

2.3 KCNG1 mRNA過表達與肺癌患者預后相關

如圖2所示,與KCNG1mRNA低表達肺癌患者相比,KCNG1mRNA高表達肺癌患者總生存期明顯縮短(圖3A,HR=1.23,95%CI:1.01～1.50,P=0.037)。此外在T1期、M1期、病理Ⅳ期、疾病進展(PD)和疾病穩(wěn)定(SD)期、部分緩解(PR)和疾病完全緩解(CR)期、女性、吸煙史>40年的肺癌患者中,與KCNG1mRNA低表達肺癌患者相比,KCNG1mRNA高表達患者總生存期明顯縮短(P均<0.05),提示KCNG1mRNA高表達與肺癌患者不良預后相關。

圖2 KCNG1 mRNA高表達與低表達肺癌患者總體生存期比較

A:肺癌患者不良預后的單因素Cox回歸分析;B:肺癌患者不良預后的多因素Cox回歸分析;C:預測肺癌患者生存率的列線圖模型;D:列線圖模型的校準曲線;E:受試者工作特征(ROC)曲線評價KCNG1在肺癌中的預測價值

2.4 基于KCNG1 mRNA表達水平構建肺癌患者列線圖模型

單因素Cox回歸分析顯示,T分期、N分期、M分期、初始治療臨床結局、年齡以及KCNG1mRNA相對表達水平與肺癌患者的不良預后相關(圖3A,P均<0.05);進一步Cox多因素回歸分析結果顯示,KCNG1mRNA相對表達水平是影響肺癌患者預后的獨立因素(圖3B,HR=1.427,95%CI:1.079～1.887,P=0.013)。據(jù)此,納入影響肺癌患者預后的獨立變量并構建預測肺癌患者預后的列線圖模型(圖3C)。對預測模型進行校正曲線的驗證,結果顯示校正曲線接近理論的45°對角線,證實預測模型具有良好的預測效能(圖3D);同時診斷性ROC曲線也提示KCNG1mRNA相對表達水平在肺癌患者中具有良好的預后評估價值(圖3E)。

2.5 KCNG1相關差異表達基因及共表達基因的分析

差異基因分析共得到3 906個KCNG1相關差異表達基因,其中包括1 692個上調(diào)基因和2 214個下調(diào)基因,如火山圖4A所示。熱圖4B顯示與KCNG1表達密切相關的基因,其中包含10個正相關基因和10個負相關基因。見圖4。

FPKM:每千個堿基的轉錄每百萬次映射讀取的片段數(shù);A:火山圖顯示與KCNG1相關的差異表達基因;B:熱圖顯示與KCNG1表達正相關的前10個基因;C:熱圖顯示與KCNG1表達負相關的前10個基因

2.6 KCNG1生物學功能分析

GO分析結果表明,與KCNG1相關的差異表達基因主要富集在調(diào)節(jié)激素分泌、離子轉運、神經(jīng)肽信號和細胞間黏附等生物學過程中(圖5A);此外,這些差異表達基因主要富集在突觸后膜、細胞外基質(zhì)、頂端質(zhì)膜等部分(圖5B);在分子功能上,這些差異表達基因主要富集在氧化還原酶活性、神經(jīng)遞質(zhì)轉運體活性、金屬離子跨膜轉運體活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性等(圖5C);KEGG富集分析提示神經(jīng)活性配體與受體的相互作用、雌激素信號通路、細胞色素P450代謝、化學致癌和PPAR信號通路與KCNG1相關差異表達基因的表達密切相關(圖5D)。

2.7 GSEA預測相關信號通路

GSEA預測結果顯示,與KCNG1協(xié)同高表達基因主要富集在與腫瘤增殖和凋亡以及免疫反應等相關的通路,包括KRAS、mTORC1、MYC、P53和WNT信號通路(圖6)。因此,KCNG1可能在腫瘤增殖、血管生成、凋亡及免疫反應等過程中發(fā)揮調(diào)控作用,從而促進肺癌的發(fā)生發(fā)展。

2.8 KCNG1 mRNA和蛋白在肺癌細胞中高表達

qRT-PCR結果提示,肺癌A549及H1299細胞系中KCNG1mRNA相對表達水平明顯高于正常肺泡上皮細胞(P<0.01或<0.001);蛋白免疫印跡結果顯示,肺癌A549及H1299細胞系中KCNG1蛋白表達水平明顯高于正常肺泡上皮細胞(P<0.01)。見圖7。由此表明,KCNG1mRNA和蛋白在肺癌細胞中表達上調(diào)。

**:P<0.01,***:P<0.001,與肺泡上皮細胞比較;A:qRT-PCR實驗檢測KCNG1 mRNA相對表達量;B:蛋白免疫印跡實驗檢測KCNG1蛋白相對表達量

2.9 KCNG1敲低抑制肺癌細胞的增殖能力

蛋白免疫印跡結果顯示,與對照組相比,KCNG1敲低組1以及KCNG1敲低組2肺癌A549細胞中KCNG1蛋白表達水平明顯降低(P<0.01或<0.001),充分驗證了siRNA轉染效率。EdU染色結果顯示,與對照組相比,肺癌A549及H1299細胞系KCNG1敲低組1和KCNG1敲低組2 EdU陽性核比率明顯降低(A549細胞:t=6.554,5.468,P均<0.01;H1299細胞:t=7.057,4.585,P<0.01或<0.05),見圖8。由此提示,siRNA干擾KCNG1表達后,肺癌細胞增殖能力下降。

*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001,與對照組相比;A:蛋白免疫印跡檢測KCNG1蛋白相對表達水平;B:EdU實驗檢測A549細胞增殖能力(×100);C:EdU實驗檢測H1299細胞增殖能力(×100)

2.10 KCNG1敲低抑制肺癌細胞的遷移能力

如圖9所示,與對照組相比,肺癌A549及H1299細胞系KCNG1敲低組1和KCNG1敲低組2細胞劃痕愈合能力明顯下降(A549細胞:t=5.397,3.697,P<0.01或<0.05;H1299細胞:t=8.434,5.936,P均<0.01)。Transwell實驗結果顯示,與對照組相比,肺癌A549及H1299細胞系KCNG1敲低組1和KCNG1敲低組2遷移細胞數(shù)明顯減少(A549細胞:t=7.387,4.364,P<0.01或<0.05;H1299細胞:t=9.849,7.603,P<0.01或<0.001)。由此提示,下調(diào)KCNG1表達水平可抑制肺癌細胞的遷移能力。

*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001,與對照組相比;A:劃痕愈合實驗檢測A549細胞遷移能力(×40);B:劃痕愈合實驗檢測H1299細胞遷移能力(×40);C:Transwell實驗檢測A549細胞遷移能力(×100);D:Transwell實驗檢測H1299細胞遷移能力(×100)

2.11 KCNG1敲低抑制肺癌細胞的侵襲能力

Matrigel Transwell結果顯示,與對照組相比,肺癌A549及H1299細胞系KCNG1敲低組1和KCNG1敲低組2侵襲細胞數(shù)目均明顯減少(A549細胞:t=2.903,3.778,P均<0.05;H1299細胞:t=5.126,4.982,P均<0.01)。見圖10。由此表明,KCNG1表達水平下調(diào)抑制肺癌細胞的侵襲能力。

P<0.05,**:P<0.01,與對照組相比;A:Matrigel Transwell實驗檢測A549細胞侵襲能力;B:Matrigel Transwell實驗檢測H1299細胞侵襲能力

2.12 KCNG1敲低抑制肺癌細胞的擬態(tài)成管能力

如圖11所示,與對照組相比,KCNG1敲低組1和KCNG1敲低組2肺癌A549細胞成管數(shù)量明顯減少(t=2.982,3.693,P均<0.05)。由此表明,KCNG1敲低可抑制肺癌細胞的擬態(tài)成管能力。

*:P<0.05,與對照組相比

3 討論

目前肺癌仍是全世界癌癥相關死亡的主要原因[20],由于分子靶向治療的進展,目前肺癌治療效果有所提高[21]。生物信息學分析為基因在腫瘤學研究過程中提供了具體的方向[22],本文通過生物信息學獲取并分析了1 145例肺癌及癌旁組織的高通量測序數(shù)據(jù),結果發(fā)現(xiàn)KCNG1mRNA在肺癌組織中表達水平顯著增高,且KCNG1mRNA高表達與肺癌患者的N和M分期等臨床病理特征密切相關。在此基礎上通過回歸分析進一步證實KCNG1可作為預測肺癌患者預后的獨立因素。初步證實KCNG1在肺癌發(fā)生發(fā)展中具有潛在的生物學功能。

有研究證實,多種鉀通道蛋白的異常表達參與肺癌的發(fā)生發(fā)展,Song等[23]發(fā)現(xiàn)kv3.1和kv3.4的異常高表達參與調(diào)控細胞的侵襲和轉移。Liu等[24]發(fā)現(xiàn)敲低KCNJ2表達后可通過miR-7和Ras/MAPK信號通路減弱非小細胞肺癌的耐藥性。本研究通過體外轉染siRNA肺癌A549細胞以及H1299細胞,干擾KCNG1表達水平后,顯著抑制其增殖、遷移、侵襲能力。基于已有研究,本研究未在H1299細胞中檢測成管能力,只在肺癌A549細胞中轉染siRNA,其成管能力明顯下降。由此表明,KCNG1在肺癌的惡性進展中發(fā)揮重要作用。多種促癌分子信號的異常表達和活化是肺癌發(fā)生、浸潤、轉移和耐藥的主要原因[25],其中包括Wnt,mTOR,MAPK以及P53等信號通路[26-29]。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫,通過富集分析發(fā)現(xiàn)KCNG1相關的差異表達基因可能參與調(diào)控KRAS通路、MTORC1通路、MYC通路和WNT通路等。其中,KRAS位點突變是腫瘤發(fā)生發(fā)展的最重要的驅動因素之一,有1/3肺癌患者存在KRAS位點突變[30-32]。既往研究報道,KRAS主要通過參與調(diào)控MAPK,RAF和MEK等下游信號分子促進肺癌的進展[33-35]。因此,KCNG1高表達可能通過促進KRAS等相關促癌信號通路的活化,進而促進肺癌的惡性進展。然而,KCNG1在肺癌中高表達的主要分子機制以及其高表達與下游促癌信號活化之間的聯(lián)系有待進一步探究。

綜上所述,KCNG1在肺癌中顯著高表達并與患者不良預后密切相關,干擾其表達水平可抑制肺癌細胞的惡性生長,初步提示KCNG1異常高表達參與肺癌的進展,這可能與KCNG1調(diào)控多種促癌信號通路的活化密切相關。本研究目前只通過生物信息學分析及體外細胞學實驗探討了KCNG1對肺癌進展的作用機制,也僅在A549細胞中檢測了成管能力的變化,未能在更多的肺癌細胞中檢測增殖、遷移、成管等行為學的變化,還缺乏動物體內(nèi)實驗的驗證,后續(xù)有待進一步完善。