aroC基因?qū)t緩愛(ài)德華氏菌生物學(xué)特性及致病性的影響

劉銳, 高大慶, 趙丹, 汪紅秋, 謝小芳, 祁琳, 易甜甜, 潘振, 張海方, 杜鴻

(1. 蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)診斷中心, 江蘇 蘇州 215004; 2. 東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 南京 210009)

遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiellatarda,Et)是腸桿菌科革蘭氏陰性短桿菌,該菌感染宿主廣泛,能夠感染魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)、爬行類(lèi)和人類(lèi)等,導(dǎo)致危害嚴(yán)重的魚(yú)類(lèi)愛(ài)德華氏菌病,從而造成水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失;人感染此菌,會(huì)引起敗血癥、腸炎、膿胸等[1]。近年來(lái),臨床上陸續(xù)發(fā)現(xiàn)患者感染Et還能引起感染性硬膜下血腫、自發(fā)性腹膜炎、急性膽管炎合并感染性休克等[2-4]。因此,研究Et的致病機(jī)制及尋找防治方法顯得極其重要。

魚(yú)類(lèi)在水質(zhì)差、高水溫的水環(huán)境中易被Et感染,出現(xiàn)眼球突出、腹部腫脹、鰭和皮膚出現(xiàn)點(diǎn)狀出血等癥狀,人類(lèi)誤食感染該菌的病魚(yú)或疫水,容易引起人類(lèi)愛(ài)德華氏菌病。研究發(fā)現(xiàn),Et致病過(guò)程主要包括黏附和侵入宿主上皮細(xì)胞、抗宿主免疫機(jī)制、產(chǎn)生酶類(lèi)和毒素,最后通過(guò)血液循環(huán)造成系統(tǒng)性感染[5]。鞭毛介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)性在Et致病的早期階段發(fā)揮重要作用,它使菌體穩(wěn)定地附著于宿主體內(nèi)并在其黏膜內(nèi)大量繁殖[6]。該致病菌侵入宿主后,釋放大量過(guò)氧化氫酶、脂多糖等來(lái)抵抗宿主防御系統(tǒng)的殺傷作用。細(xì)菌的群體密度感應(yīng)系統(tǒng)介導(dǎo)細(xì)菌種內(nèi)或種間的信號(hào)交流,進(jìn)而引起細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性、毒性、耐藥性、生物膜形成等生理活性的改變。吲哚作為Et一種新的密度感應(yīng)信號(hào)分子,不僅調(diào)控Et的運(yùn)動(dòng)性、生物膜形成、耐藥性、耐酸性、質(zhì)粒穩(wěn)定性,還參與該菌對(duì)斑馬魚(yú)的致病性[7]。

aroC基因編碼的分支酸合成酶,是芳香族氨基酸合成的關(guān)鍵酶,芳香族氨基酸對(duì)細(xì)菌在體內(nèi)的生長(zhǎng)和存活具有重要作用。該基因缺失的細(xì)菌在芳香族氨基酸缺乏的培養(yǎng)基中難以生長(zhǎng),表現(xiàn)出低毒力,能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生保護(hù)性免疫力[8]。為了確定aroC基因?qū)t致病性的作用,本研究通過(guò)構(gòu)建EtaroC缺失株,比較該菌野生株和缺失株生物學(xué)特性的差異,為進(jìn)一步探討aroC對(duì)該菌致病性的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)條件 本研究所用的菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1。細(xì)菌用Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基培養(yǎng),加入培養(yǎng)基抗生素終濃度分別為氯霉素(chloramphenicol,Cm)34 μg/mL,氨芐西林鈉(ampicillin sodium,Amp)100 μg/mL,鹽酸四環(huán)素(tetracycline hydrochloride,Tet)50 μg/mL,多黏菌素E(colistin,Col)50 μg/mL。

表1 本研究所用的菌株和質(zhì)粒

1.1.2 人喉癌上皮細(xì)胞 Hep-2細(xì)胞為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)劉錦博士惠贈(zèng)。胎牛血清、胰蛋白酶(美國(guó)Hyclone公司);細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM(美國(guó)Gibco公司);Solarbio鞭毛染色試劑盒(天根生化科技有限公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 28只6周齡雄性無(wú)菌級(jí)BALB/C小鼠,購(gòu)買(mǎi)于揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,許可證號(hào):SCXK(蘇)2017-0007。

1.2 方法

1.2.1aroC缺失株的構(gòu)建 以ET13基因組DNA為模板,化學(xué)合成aroC基因上下游融合片段F1F2,將F1F2片段與自殺質(zhì)粒pWM91進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物接種至LB平板(含Ampr),雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pWM91-F1F2;將該重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入SM10λpir中,含重組質(zhì)粒的SM10λpir與ET13進(jìn)行接合反應(yīng),接合產(chǎn)物接種至平板上(含Ampr和Colr),挑選陽(yáng)性菌落,并以F1F2(表2)為引物進(jìn)行PCR鑒定,篩選接合子;用含15%蔗糖的LB平板篩選aroC缺失株,挑選在Ampr和Colr雙抗平板上不生長(zhǎng),僅在Colr抗性平板上生長(zhǎng)的菌落,以aroC(表2)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,傳代10次以后篩選穩(wěn)定缺失株,所得到的缺失株命名為ΔaroC。

表2 本研究所用的引物和擴(kuò)增產(chǎn)物大小

1.2.2aroC互補(bǔ)株和ΔaroC-pACYC184株的構(gòu)建 以ET13基因組DNA為模板,aroC為引物(表2),PCR擴(kuò)增aroC基因片段,插入到質(zhì)粒pACYC184中,構(gòu)建pACYC184-aroC重組質(zhì)粒,將其電轉(zhuǎn)入ΔaroC中,所得到的互補(bǔ)株命名為CΔaroC。將空質(zhì)粒pACYC184電轉(zhuǎn)入ΔaroC中,所得到的菌株命名為ΔaroC-pACYC184。

1.2.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 野生株、ΔaroC及CΔaroC株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,然后調(diào)節(jié)菌液D(600 nm)=0.5,按1 ∶100比例轉(zhuǎn)接至含100 mL的LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中,每小時(shí)從中取出2 mL菌液,用酶標(biāo)儀測(cè)定D值,每組重復(fù)3次取平均值,根據(jù)D(600 nm)數(shù)值繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 吲哚濃度測(cè)定 制備不同濃度吲哚標(biāo)準(zhǔn)品與其對(duì)應(yīng)D(571 nm)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線;取不同時(shí)間點(diǎn)野生株、ΔaroC及CΔaroC菌液,過(guò)濾取上清液,在571 nm波長(zhǎng)下,用酶標(biāo)儀測(cè)定這些上清液的D值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出相應(yīng)吲哚濃度。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5 結(jié)晶紫法檢測(cè)生物膜 分別取250 μL含菌量108CFU/mL的野生株、ΔaroC及CΔaroC加入到96孔板中,培養(yǎng)48 h,在570 nm波長(zhǎng)下,用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔中菌液D值,該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.6 掃描電鏡法檢測(cè)生物膜 無(wú)菌6 mm×6 mm蓋玻片置于野生株、ΔaroC及CΔaroC中,培養(yǎng)48 h,用電鏡觀察蓋玻片表面形成的生物膜。

1.2.7 Hep-2細(xì)胞黏附試驗(yàn) 制備Hep-2細(xì)胞懸液;對(duì)數(shù)期野生株、ΔaroC菌液按感染復(fù)數(shù)(MOI)=100 ∶1分別感染Hep-2細(xì)胞,共孵育2 h后,用1%的吉姆薩染色20 min,PBS清洗3次,室溫干燥后于油鏡下觀察細(xì)菌黏附情況。加入1 mL Triton X-100裂解細(xì)胞10 min,收集裂解液,采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算各組細(xì)菌數(shù)。黏附率(%)=平板所得細(xì)菌數(shù)/原始加入細(xì)菌數(shù)×100%,重復(fù)3次后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.8 軟瓊脂平板法檢測(cè)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性 對(duì)數(shù)期野生株、ΔaroC、S.albus接種至0.3%半固體瓊脂培養(yǎng)基上,CΔaroC、ΔaroC-pACYC184接種至0.3%半固體瓊脂培養(yǎng)基上(含Tetr),24 h后觀察各菌株鞭毛運(yùn)動(dòng)能力,并用游標(biāo)卡尺測(cè)量運(yùn)動(dòng)環(huán)直徑。S.albus作為陰性對(duì)照,該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.9 鍍銀法檢測(cè)細(xì)菌鞭毛形態(tài) 接種環(huán)分別沾取野生株、ΔaroC及CΔaroC至載玻片上,按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行鞭毛染色,在油鏡下觀察鞭毛形態(tài)。

1.2.10 熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)菌fliS、flgK、fliM、flgL、fliA和fliC相對(duì)表達(dá)量 按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,再以cDNA為模板,用fliS、flgK、fliM、flgL、fliA和fliC基因的引物(表2)擴(kuò)增各基因,以擴(kuò)增16SrRNA基因作為內(nèi)標(biāo)參照,定量測(cè)定各基因的轉(zhuǎn)錄水平,重復(fù)3次后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性20 s,56 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,循環(huán)40次,4 ℃保存;25 μL反應(yīng)體系:cDNA 7 μL,DEPC水11 μL,2× SYBR Green Mix 5 μL,上、下游引物各1 μL。

1.2.11 致病力檢測(cè) 野生株和ΔaroC株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,調(diào)節(jié)菌液D(600 nm)=1.0,然后用PBS稀釋至含菌量為108CFU/mL,每尾斑馬魚(yú)腹腔注射10 μL該濃度菌液;空白組注射相同劑量的無(wú)菌生理鹽水,每組10尾,連續(xù)觀察1周,每天記錄斑馬魚(yú)死亡數(shù)量。以時(shí)間為橫坐標(biāo),各組斑馬魚(yú)存活率為縱坐標(biāo),繪制兩菌株感染斑馬魚(yú)的存活率圖。

1.2.12 細(xì)菌組織載量測(cè)定 野生株和ΔaroC株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,調(diào)節(jié)菌液D(600 nm)=1.0,用PBS稀釋至含菌量為108CFU/mL;將6周齡雄性小鼠28只隨機(jī)分成野生株組和ΔaroC組(每組14只):每只小鼠腹腔注射20 μL含菌量108CFU/mL菌液(野生株或ΔaroC),在感染后1、2、3、4、5、6、7 d,每組分別取2只小鼠,斷脊處死小鼠,無(wú)菌操作,迅速解剖,取小鼠小腸、肝臟研磨均勻,研磨液稀釋一定倍數(shù)后,涂布含Colr的LB固體平板,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜;次日進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)(CFU/mL)=菌落數(shù)/平板×10×稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 Et aroC缺失株和互補(bǔ)株的鑒定

接合子接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后,涂布于15%蔗糖LB平板,取單菌落分別劃線于含Ampr+Colr雙抗的LB固體平板和含Colr單抗LB固體平板上,挑取在雙抗平板上不生長(zhǎng),而在單抗平板上生長(zhǎng)的菌落,以aroC為引物做PCR鑒定,該引物擴(kuò)增出來(lái)的aroC基因片段為1 200 bp。以aroC為引物擴(kuò)增不出任何片段,則該菌為aroC缺失株,結(jié)果如圖1A,共獲得2株,1、3號(hào)為aroC缺失株,2號(hào)、4～7號(hào)為ET13的野生株,將aroC缺失株轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),傳代15次以后篩選穩(wěn)定缺失株,于-80 ℃保種,將所得到的aroC缺失株命名為ΔaroC。將重組質(zhì)粒pACYC184-aroC電擊轉(zhuǎn)化到ΔaroC株中,涂布含Tetr的LB固體平板,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜,次日從平板上挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定,以aroC為引物能擴(kuò)出aroC基因片段,說(shuō)明互補(bǔ)株構(gòu)建成功,結(jié)果如圖1B,1號(hào)為CΔaroC株,將所得到的互補(bǔ)株命名為CΔaroC。

A:用aroC引物進(jìn)行PCR鑒定ΔaroC株;M:DL5000;1,3:ΔaroC株;2,4～7:ET13的野生株。B:PCR鑒定CΔaroC株;M:DL2000;1:CΔaroC株

2.2 比較ET13的野生株、ΔaroC和CΔaroC生長(zhǎng)能力的差異

結(jié)果如圖2所示,野生株、ΔaroC和CΔaroC株的生長(zhǎng)速度在各個(gè)時(shí)間段無(wú)顯著差異(P>0.05),說(shuō)明aroC基因缺失后,不影響ET13菌的生長(zhǎng)能力。

圖2 比較ET13的野生株、ΔaroC和CΔaroC生長(zhǎng)能力的差異

2.3 比較ET13的野生株、ΔaroC和CΔaroC胞外吲哚含量的差異

檢測(cè)野生株、ΔaroC和CΔaroC在48 h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的胞外吲哚濃度,結(jié)果如圖3所示,上述菌株在1～7 h時(shí)胞外吲哚濃度增長(zhǎng)較緩慢、10～13 h時(shí)增長(zhǎng)速度較快,在13 h時(shí)吲哚濃度達(dá)到最高值,以后逐漸下降。0～1 h時(shí),上述3種菌株的胞外吲哚濃度無(wú)顯著差異(P>0.05);在4～48 h時(shí),ΔaroC胞外吲哚濃度明顯低于野生株(P<0.05或<0.01),CΔaroC的吲哚濃度介于野生株和缺失株之間。結(jié)果表明,4～48 h時(shí)aroC缺失后影響ET13胞外吲哚的生成。

a:P<0.05,b:P<0.01,與野生株相比

2.4 比較ET13的野生株和ΔaroC在48 h時(shí)生物膜形成的差異

細(xì)菌經(jīng)過(guò)48 h的培養(yǎng),在氣液交界面的孔壁上形成生物膜,人類(lèi)肉眼無(wú)法觀察到,借助結(jié)晶紫染色即能直觀觀察到生物膜,又能根據(jù)染色后顏色的深淺判斷生物膜的形成量。結(jié)果見(jiàn)圖4A,從左到右分別為未添加菌液的LB培養(yǎng)基,本試驗(yàn)中作為陰性對(duì)照、野生株、ΔaroC和CΔaroC株,未添加菌液的LB培養(yǎng)基的孔壁無(wú)色,說(shuō)明無(wú)生物膜形成;野生株的孔壁呈深紫色,ΔaroC的孔壁有一點(diǎn)紫色,CΔaroC的孔壁顏色略淺于野生株的孔壁顏色;用酶標(biāo)儀檢測(cè)每個(gè)小孔中結(jié)晶紫脫色液的D(570 nm)值,結(jié)果如圖4B所示,ΔaroC孔的D值明顯低于野生株孔(P<0.01),但高于LB孔,CΔaroC孔的D值介于野生株和缺失株之間。進(jìn)一步用掃描電鏡檢測(cè)ET13菌在蓋玻片表面形成的生物膜,結(jié)果見(jiàn)圖4C～4E,蓋玻片表面ΔaroC細(xì)菌數(shù)及胞外多聚物量少且分布零散,野生株與CΔaroC黏附在蓋玻片表面的細(xì)菌數(shù)及胞外多聚物量多且分布密集。以上結(jié)果表明,aroC基因缺失后,ET13生物膜形成能力明顯降低。

A:結(jié)晶紫法檢測(cè)野生株、ΔaroC和CΔaroC 48 h時(shí)在96孔板中形成的生物膜,從左到右分別為未添加菌液的LB培養(yǎng)基(陰性對(duì)照)、野生株、ΔaroC和CΔaroC株。B:酶標(biāo)儀分別檢測(cè)96孔板中LB、野生株、ΔaroC和CΔaroC的D值;a:P<0.01,與野生株相比。C～E:掃描電鏡檢測(cè)野生株、ΔaroC和CΔaroC 48 h時(shí)在蓋玻片表面形成的生物膜(×2 500)

2.5 比較ET13的野生株和ΔaroC運(yùn)動(dòng)能力的差異

結(jié)果如圖5A～5C所示,S.albus無(wú)鞭毛,在軟瓊脂平板上不能形成運(yùn)動(dòng)環(huán)。ΔaroC運(yùn)動(dòng)環(huán)直徑明顯小于野生株(P<0.01),該菌運(yùn)動(dòng)能力下降;CΔaroC運(yùn)動(dòng)環(huán)與野生株無(wú)明顯差異(P>0.05);ΔaroC-pACYC184與ΔaroC運(yùn)動(dòng)環(huán)直徑無(wú)明顯差異(P>0.05),說(shuō)明pACYC184質(zhì)粒不影響ΔaroC鞭毛運(yùn)動(dòng)。鍍銀法觀察鞭毛形態(tài)及數(shù)目,細(xì)菌菌體呈深褐色,鞭毛呈淺褐色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ΔaroC菌體周?chē)挥?～2根鞭毛、較短,野生株和CΔaroC周身鞭毛密集且較長(zhǎng)(圖5D～5F)。如圖5G所示,ΔaroC中fliC、fliA基因的轉(zhuǎn)錄水平相比野生株明顯降低(P<0.01),CΔaroC中該基因的轉(zhuǎn)錄水平處于野生株和缺失株之間,其他3個(gè)基因fliS、flgK和flgL在上述3種菌株間的轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯差異(P>0.05)。上述結(jié)果表明,aroC基因缺失后,ET13鞭毛介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)能力下降。

A:比較野生株、ΔaroC和S.albus鞭毛運(yùn)動(dòng)環(huán)直徑的差異;B:比較CΔaroC和ΔaroC-pACYC184鞭毛運(yùn)動(dòng)環(huán)直徑的差異;C:野生株、ΔaroC、CΔaroC和ΔaroC-pACYC184的鞭毛運(yùn)動(dòng)環(huán)直徑統(tǒng)計(jì)圖;D～F:鍍銀法觀察野生株、ΔaroC和CΔaroC鞭毛形態(tài)及數(shù)目的差異(×1 000);G:qRT-PCR比較野生株、ΔaroC和CΔaroC鞭毛合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平;a:P<0.01,與野生株相比

2.6 比較ET13的野生株和ΔaroC黏附Hep-2細(xì)胞能力的差異

光鏡下觀察野生株和ΔaroC黏附Hep-2細(xì)胞的差異,如圖6A～6C所示,ΔaroC黏附在Hep-2細(xì)胞上的數(shù)目少于野生株。平板計(jì)數(shù)法定量檢測(cè)結(jié)果表明,ΔaroC黏附在Hep-2細(xì)胞上的黏附率明顯低于野生株(P<0.01),見(jiàn)圖6D。以上結(jié)果表明,aroC基因缺失后,ET13黏附上皮細(xì)胞的能力降低。姬姆薩染色后,Hep-2細(xì)胞核和細(xì)菌被染成紫藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)被染成淺紅色。

A:未感染細(xì)菌的Hep-2細(xì)胞;B:野生株感染的Hep-2細(xì)胞;C:ΔaroC感染的Hep-2細(xì)胞;D:平板計(jì)數(shù)法定量檢測(cè)野生株和ΔaroC黏附Hep-2細(xì)胞的黏附率統(tǒng)計(jì)圖。a:P<0.01,與野生株相比;箭頭所示為黏附的細(xì)菌

2.7 比較ET13的野生株和ΔaroC感染斑馬魚(yú)后存活率的差異

將野生株和ΔaroC分別用PBS稀釋至含菌量為108CFU/mL,每尾斑馬魚(yú)腹腔注射10 μL該濃度菌液,連續(xù)觀察1周,結(jié)果如圖7所示,野生株組第1、2、3、4天各死了1尾斑馬魚(yú),第5、6天各死了2尾,第7天存活下來(lái)2尾;缺失株組第1天無(wú)斑馬魚(yú)死亡,第2、3、4、5、6天各死了1尾,第7天存活下來(lái)5尾。感染ΔaroC株斑馬魚(yú)存活率為50%,而感染野生株斑馬魚(yú)存活率僅為20%。以上結(jié)果表明,aroC基因缺失后,ET13對(duì)斑馬魚(yú)的毒力降低,提示aroC基因與該菌對(duì)宿主的致病性相關(guān)。

圖7 比較ET13的野生株和ΔaroC感染斑馬魚(yú)后存活率的差異

2.8 比較ET13的野生株和ΔaroC在小鼠組織中存活能力的差異

野生株和ΔaroC腹腔感染小鼠1周,各菌株在小鼠腸道中的存活能力見(jiàn)圖8A,僅在第1天和第7天時(shí),兩菌株在小鼠腸道中的存活數(shù)目無(wú)明顯差異(P>0.05),其他時(shí)間段ΔaroC在腸道中的存活數(shù)目低于野生株(P<0.05或<0.01)。兩菌株在小鼠肝臟中的存活能力如圖8B所示,第2天到第7天,野生株在肝臟中的存活數(shù)目高于ΔaroC(P<0.05或<0.01);但感染第1天時(shí),兩菌株在肝臟中的存活數(shù)目無(wú)明顯差異(P>0.05)。以上結(jié)果表明,aroC基因缺失后,ET13菌在小鼠組織中存活能力降低,該基因在ET13定植過(guò)程中發(fā)揮顯著作用。

a:P<0.05,b:P<0.01,與野生株相比

3 討論

Et作為愛(ài)德華氏菌屬中唯一可以感染人的致病菌,其危害性引起臨床上極大關(guān)注。分支酸合成酶作為莽草酸代謝途徑下游支點(diǎn)的重要酶,影響莽草酸途徑次生代謝產(chǎn)物吲哚的產(chǎn)生;吲哚作為細(xì)菌一種新的密度感應(yīng)信號(hào)分子,近幾年來(lái)受到研究者極大關(guān)注,研究發(fā)現(xiàn)其能參與細(xì)菌運(yùn)動(dòng)、黏附、抗酸性、毒力、生物膜形成等多種生理活動(dòng)[9]。在Et中,吲哚可以通過(guò)CpxAR雙組分系統(tǒng)和Ⅲ型分泌系統(tǒng)參與毒力調(diào)控[10]。本研究發(fā)現(xiàn),aroC基因缺失株胞外吲哚生成量明顯降低。

黏附和侵入作為Et致病過(guò)程的第一步,涉及了黏附素、鞭毛蛋白等,該菌可以黏附并侵入Hep-2細(xì)胞和HeLa細(xì)胞,鞭毛在黏附過(guò)程中可引起微絲發(fā)生重排,協(xié)助病原菌侵入到宿主體內(nèi)并遷移到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的位置上[11]。FliA、FliC等鞭毛蛋白裝配成細(xì)菌鞭毛絲;FlgK和FlgL共同構(gòu)成鞭毛鉤環(huán)狀結(jié)構(gòu),是鞭毛形成及發(fā)揮功能的重要組成部分;鞭毛蛋白FliS作為FliC的分子伴侶,與鞭毛的形成、菌株的游動(dòng)性、毒性等有著密切的關(guān)系[12]。本研究結(jié)果顯示,與野生株和互補(bǔ)株相比,ΔaroC運(yùn)動(dòng)能力明顯下降、鞭毛較短且量少、fliA和fliC基因的轉(zhuǎn)錄水平降低;該缺失株黏附Hep-2細(xì)胞的能力也顯著降低。fliA和fliC基因轉(zhuǎn)錄水平降低,可能是ΔaroC運(yùn)動(dòng)能力降低的原因之一,具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。細(xì)菌附著于惰性或活性實(shí)體的表面,分泌胞外多聚物將菌體包裹起來(lái),形成的細(xì)菌聚集體膜狀物稱(chēng)為生物膜。生物膜內(nèi)部的細(xì)菌能逃避免疫系統(tǒng)的攻擊和抗菌藥物的殺傷作用,使感染易于慢性化、難于控制,從而能夠增強(qiáng)細(xì)菌致病性[13]。本研究應(yīng)用96孔酶標(biāo)板結(jié)晶紫法和掃描電鏡法檢測(cè)了野生株、ΔaroC和CΔaroC在48 h形成的生物膜,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生株和互補(bǔ)株相比,ΔaroC生物膜形成能力降低。

細(xì)菌侵入宿主后分泌多種毒素,這些毒素不僅為細(xì)菌自身生長(zhǎng)繁殖提供營(yíng)養(yǎng),同時(shí)也能抵抗宿主防御機(jī)制,進(jìn)而有利于細(xì)菌產(chǎn)生致病作用。有研究發(fā)現(xiàn),豬鏈球菌aroC基因缺失株表面莢膜多糖合成受阻,導(dǎo)致該缺失株在感染過(guò)程中與免疫細(xì)胞充分接觸,激活更高炎性反應(yīng),從而更易被宿主清除,毒力明顯降低[14]。斑馬魚(yú)存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,感染ΔaroC斑馬魚(yú)癥狀較輕,且存活率(50%)高于野生株(20%)。進(jìn)一步檢測(cè)兩菌株在小鼠腸道和肝臟中的載量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ΔaroC在小鼠腸道和肝臟中的定植能力低于野生株。

本研究結(jié)果表明,Et的aroC基因缺失株生物膜形成能力、運(yùn)動(dòng)性、黏附性、吲哚生成量及致病力明顯下降,為深入了解Et致病機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。然而,aroC基因是通過(guò)何種作用機(jī)制影響Et的生物學(xué)特性,需要后期進(jìn)一步深入研究。