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    3種測(cè)試片對(duì)煙用香精香料菌落總數(shù)檢測(cè)的適用性評(píng)價(jià)

    2023-11-24 08:51:48葉長(zhǎng)文崔中月趙婉霞胡中軍
    煙草科技 2023年11期
    關(guān)鍵詞:香精香料煙用計(jì)數(shù)法

    葉長(zhǎng)文,周 蕓,李 棟,崔中月,趙婉霞,黃 闊,胡中軍,周 曉*

    1.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院,鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號(hào) 4500012.廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心,南寧市西鄉(xiāng)塘區(qū)北湖南路28 號(hào) 530001

    煙用香精香料種類繁多,組分復(fù)雜,富含微生物生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)成分,易受污染變質(zhì)[1-4]。菌落總數(shù)是影響煙用香精香料質(zhì)量穩(wěn)定的重要因素之一[5],也是評(píng)價(jià)煙用香精香料衛(wèi)生狀況的重要指標(biāo)。目前,食品樣品的菌落總數(shù)檢測(cè)常參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.2—2022[6]中的平板計(jì)數(shù)法或測(cè)試片法進(jìn)行。平板計(jì)數(shù)法為傳統(tǒng)的菌落總數(shù)檢測(cè)方法,但該方法操作復(fù)雜,且對(duì)檢測(cè)環(huán)境要求較高[7]。測(cè)試片法是以凝膠或無(wú)紡布為培養(yǎng)基載體代替瓊脂培養(yǎng)微生物的一種新型檢測(cè)方法,具有操作快速、易于判讀、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)[8]。采用測(cè)試片法檢測(cè)各類食品樣品菌落總數(shù)的研究已有報(bào)道[9-10]。王曦等[11]采用測(cè)試片法與平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)了30個(gè)糕點(diǎn)樣品的菌落總數(shù),發(fā)現(xiàn)2種方法檢測(cè)的菌落總數(shù)無(wú)顯著差異;林杰等[12]采用測(cè)試片法和平板計(jì)數(shù)法分別檢測(cè)了沙拉、茶葉、明蝦等15 種食品樣品的菌落總數(shù),發(fā)現(xiàn)2 種方法的菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異;趙立冬等[13]采用測(cè)試片法與平板計(jì)數(shù)法對(duì)129 個(gè)熟肉樣品的菌落總數(shù)進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)測(cè)試片法與平板計(jì)數(shù)法的檢測(cè)結(jié)果一致性較好。然而,測(cè)試片法檢測(cè)煙用香精香料菌落總數(shù)的相關(guān)研究還鮮見報(bào)道。為此,使用3種測(cè)試片以及PCA培養(yǎng)基檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)菌株樣品、菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品和煙用香精香料樣品的菌落總數(shù),評(píng)價(jià)3種測(cè)試片檢測(cè)煙用香精香料菌落總數(shù)的適用性,旨在為測(cè)試片用于煙用香精香料菌落總數(shù)檢測(cè)提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑和儀器

    供試的17株標(biāo)準(zhǔn)菌株(表1)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院,為菌落總數(shù)測(cè)定過程中常見的可培養(yǎng)細(xì)菌[7,14],也是變質(zhì)煙用香精香料中常見的優(yōu)勢(shì)菌[2,4]。菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品(QC-FD-002)購(gòu)自中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院。標(biāo)準(zhǔn)菌株和菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品均保存于-20 ℃冰箱。代表性煙用香精香料樣品采集于廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司倉(cāng)庫(kù),共計(jì)56個(gè)。其中,1~53號(hào)樣品為煙用香料(含單體香料、香基、浸膏、酊劑、凈油等),54~56號(hào)樣品為煙用香精。煙用香精香料樣品均保存于4 ℃冰箱。

    表1 標(biāo)準(zhǔn)菌株名稱和編號(hào)Tab.1 Name and number of standard strains

    3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測(cè)試片(3M-AC 測(cè)試片,3M 中國(guó)有限公司);DNP 菌落總數(shù)測(cè)試片[DNP-AC測(cè)試片,安科生物制品(上海)有限公司];MC-Media 菌落總數(shù)測(cè)試片(MC-AC 測(cè)試片,德國(guó)Merck公司)。

    平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA)培養(yǎng)基和腦心浸出液肉湯(BHI)(北京陸橋技術(shù)有限公司);無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=7.2,山東微色譜生物科技有限公司)。

    Bio II Advance 生物安全柜(西班牙Telstar 公司);BagMixer 400 均質(zhì)器(法國(guó)Interscience 公司);CTHI-250B2H 恒溫恒濕箱[施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司];CL-40M 高壓滅菌鍋(日本ALP 公司);ZQZY-C58F 恒溫振蕩培養(yǎng)箱(上海知楚儀器有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株樣品菌懸液制備

    分別挑取17株標(biāo)準(zhǔn)菌株的單菌落接種于10 mL BHI培養(yǎng)基中,36 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化。取10 μL活化后的菌液加入含有9 mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液的試管中,充分混勻后對(duì)所得液體進(jìn)行梯度稀釋,得到7個(gè)稀釋梯度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)的標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液。

    1.2.2 菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品菌懸液制備

    參照菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品說明書制備菌懸液原液。使用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液對(duì)菌懸液原液進(jìn)行梯度稀釋,得到4個(gè)稀釋梯度(10-2、10-3、10-4、10-5)的菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品菌懸液。

    1.2.3 煙用香精香料樣品勻液制備

    稱取25 g或量取25 mL煙用香精香料樣品放入無(wú)菌均質(zhì)袋中,加入225 mL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液后使用拍擊式均質(zhì)器(2 擋)均質(zhì)1~2 min。將所得液體進(jìn)行梯度稀釋,得到4 個(gè)稀釋梯度(10-1、10-2、10-3、10-4)的煙用香精香料樣品勻液。

    1.2.4 菌落總數(shù)檢測(cè)方法

    1.2.4.1 平板計(jì)數(shù)法

    在無(wú)菌條件下分別取10-1~10-7稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液、10-2~10-5稀釋梯度的菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品菌懸液和10-1~10-4稀釋梯度的煙用香精香料樣品勻液1 mL滴至無(wú)菌培養(yǎng)皿上,然后加入15~20 mL冷卻至46~50 ℃的PCA培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使其充分混勻,每個(gè)稀釋梯度設(shè)置3次重復(fù)。待瓊脂凝固后將培養(yǎng)皿倒置,(36±1)℃培養(yǎng)48 h后觀察PCA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài),并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),參照文獻(xiàn)[6]計(jì)算菌落總數(shù)。

    1.2.4.2 測(cè)試片法

    在無(wú)菌條件下分別取10-1~10-7稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液、10-2~10-5稀釋梯度的菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品菌懸液和10-1~10-4稀釋梯度的煙用香精香料樣品勻液1 mL滴至測(cè)試片中央,每個(gè)稀釋梯度重復(fù)3次。(36±1)℃培養(yǎng)24 h后觀察MC-AC測(cè)試片上的菌落形態(tài),并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù);在培養(yǎng)48 h后觀察3M-AC和DNP-AC測(cè)試片上的菌落形態(tài),并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。測(cè)試片法的詳細(xì)操作和菌落總數(shù)的計(jì)算參照3M-AC、DNP-AC和MC-AC測(cè)試片使用說明書進(jìn)行。

    1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    使用Excel 軟件將菌落總數(shù)轉(zhuǎn)換為10 的對(duì)數(shù)值,再用SPSS 24.0軟件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株和煙用香精香料樣品的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,并對(duì)煙用香精香料的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。

    菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品的結(jié)果通過計(jì)算Z比分?jǐn)?shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。Z比分?jǐn)?shù)計(jì)算公式:

    式中:x為實(shí)驗(yàn)室菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)數(shù)值,lgCFU/mL;X為特性值;s為能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差。本實(shí)驗(yàn)中菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品的特性值和能力評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)差分別為3.370 lgCFU/mL 和0.182 lgCFU/mL。當(dāng)|Z|≤2時(shí),評(píng)價(jià)結(jié)果為“滿意”;2<|Z|<3時(shí),評(píng)價(jià)結(jié)果為“有問題”;|Z|≥3時(shí),評(píng)價(jià)結(jié)果為“不滿意”。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株樣品菌落形態(tài)和菌落總數(shù)

    2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株樣品菌落形態(tài)

    17株標(biāo)準(zhǔn)菌株在PCA培養(yǎng)基和3種測(cè)試片上的菌落形態(tài)描述見表2。在3種測(cè)試片上,所有標(biāo)準(zhǔn)菌株菌落均為紅色;在PCA培養(yǎng)基上,除金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為黃色外,其他標(biāo)準(zhǔn)菌株菌落均為白色。在PCA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后,同一標(biāo)準(zhǔn)菌株在PCA培養(yǎng)基表面和內(nèi)部的菌落大小和形狀差異較大。17 株標(biāo)準(zhǔn)菌株在3M-AC 測(cè)試片上培養(yǎng)48 h后,枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和多黏類芽胞桿菌(Paenibacilluspolymyxa)的菌落有明顯的液化現(xiàn)象(圖1),影響計(jì)數(shù),其他標(biāo)準(zhǔn)菌株菌落一般為圓形或近似圓形,菌落形態(tài)清晰,便于計(jì)數(shù)。在DNP-AC測(cè)試片上培養(yǎng)48 h后,標(biāo)準(zhǔn)菌株菌落一般為圓形,菌落形態(tài)清晰,便于計(jì)數(shù)。在MC-AC測(cè)試片上培養(yǎng)24 h后,標(biāo)準(zhǔn)菌株菌落形狀多不規(guī)則,但菌落形態(tài)清晰,無(wú)液化現(xiàn)象,便于計(jì)數(shù)。

    圖1 3M-AC測(cè)試片上有明顯液化現(xiàn)象的標(biāo)準(zhǔn)菌株Fig.1 Standard strains with visible liquefaction on 3M-AC count plates

    2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果

    表3為17株標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌落總數(shù)和菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值。其中,大腸桿菌(Escherichiacoli)、腸沙門氏菌腸亞種鼠傷寒血清型(Salmonellaentericasupbsp.entericaserovarTyphimurium)、塞氏檸檬酸桿菌(Citrobactersedlakii)、鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumnnii)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和緩慢葡萄球菌(Staphylococcuslentus)6株標(biāo)準(zhǔn)菌株的3種測(cè)試片與PCA培養(yǎng)基菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果均為同一數(shù)量級(jí);蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)的3M-AC 和DNP-AC 測(cè)試片菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果與PCA培養(yǎng)基菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果存在2個(gè)數(shù)量級(jí)的差異;蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)的3M-AC測(cè)試片菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果與PCA培養(yǎng)基菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果存在2個(gè)數(shù)量級(jí)的差異。由圖2可見,PCA培養(yǎng)基與3M-AC、DNP-AC和MC-AC測(cè)試片的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)。其中,MC-AC測(cè)試片的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值與PCA培養(yǎng)基的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值相關(guān)性(R2=0.997 7,P<0.01)最好。

    圖2 不同檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)菌株菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis between logarithmic values of aerobic plate counts of standard bacterial strains obtained by different methods

    表3 標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌落總數(shù)和菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值Tab.3 Aerobic plate counts and the logarithmic values of aerobic plate counts of standard strains

    2.2 定量質(zhì)控樣品菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果和評(píng)價(jià)

    使用PCA培養(yǎng)基和3種測(cè)試片對(duì)菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品進(jìn)行檢測(cè),PCA 培養(yǎng)基、3M-AC、DNP-AC和MC-AC測(cè)試片的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值如表4所示。Z比分?jǐn)?shù)的評(píng)價(jià)結(jié)果均為“滿意”。

    表4 菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品檢測(cè)結(jié)果和評(píng)價(jià)Tab.4 Determination results and evaluation of quality control sample for aerobic plate count

    2.3 煙用香精香料樣品菌落總數(shù)檢測(cè)結(jié)果

    使用PCA培養(yǎng)基和3種測(cè)試片分別檢測(cè)56個(gè)煙用香精香料樣品的菌落總數(shù),部分樣品檢測(cè)結(jié)果見表5。其中,39個(gè)樣品的菌落總數(shù)小于10 CFU/mL(g),17 個(gè)樣品的菌落總數(shù)大于10 CFU/mL(g)。由圖3可見,采用測(cè)試片法和平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)煙用香精香料樣品菌落總數(shù),2種方法的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值呈正相關(guān)。其中,MC-AC測(cè)試片與PCA培養(yǎng)基的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值相關(guān)性(R2=0.922 8,P<0.01)最好。煙用香精香料樣品菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果(表6)表明,PCA 培養(yǎng)基與3 種測(cè)試片的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值差異均不顯著(P>0.05)。

    表5 煙用香精香料樣品的菌落總數(shù)和菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值①Tab.5 Aerobic plate counts and logarithmic values of aerobic plate counts of tobacco flavor samples

    表6 煙用香精香料樣品菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值配對(duì)t檢驗(yàn)①Tab.6 Paired t-test for logarithmic values of aerobic plate counts of tobacco flavor samples

    2.4 平板計(jì)數(shù)法和測(cè)試片法操作過程比較

    由表7可見,相比平板計(jì)數(shù)法,在前期準(zhǔn)備時(shí),測(cè)試片法無(wú)需清洗培養(yǎng)皿和配制培養(yǎng)基。在接種樣品勻液時(shí),平板計(jì)數(shù)法將樣品勻液滴至培養(yǎng)皿后需傾注PCA培養(yǎng)基(46~50 ℃),而測(cè)試片法只需滴加樣品勻液即可。其中,樣品勻液滴至3M-AC測(cè)試片中央后,需用壓板將樣品勻液壓至規(guī)定大小,操作不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致樣品勻液接種區(qū)大小不一致,影響判讀,而樣品勻液滴至MC-AC 和DNP-AC 測(cè)試片中央后無(wú)需壓板按壓,樣品勻液因毛細(xì)管作用將自動(dòng)擴(kuò)散至測(cè)試片的整個(gè)接種區(qū)。在培養(yǎng)過程中,平板計(jì)數(shù)法使用的培養(yǎng)皿所占空間較大,而測(cè)試片體積小,可堆疊,移動(dòng)方便;PCA 培養(yǎng)基、3M-AC 和DNP-AC 測(cè)試片的培養(yǎng)時(shí)間均為48 h,而MC-AC測(cè)試片的培養(yǎng)時(shí)間為24 h。在結(jié)果判讀時(shí),PCA 培養(yǎng)基上的菌落顏色和培養(yǎng)基接近,部分菌落較小,難以觀察和計(jì)數(shù),而測(cè)試片上的菌落為紅色,菌落清晰,便于計(jì)數(shù),但當(dāng)3M-AC測(cè)試片上出現(xiàn)明顯的液化現(xiàn)象時(shí),可能會(huì)影響菌落計(jì)數(shù)。

    表7 平板計(jì)數(shù)法和測(cè)試片法的操作過程Tab.7 Procedures of plate count method and count plate method

    綜上,在進(jìn)行菌落總數(shù)檢測(cè)時(shí),測(cè)試片法比平板計(jì)數(shù)法更簡(jiǎn)便、快速。其中,使用MC-AC 測(cè)試片進(jìn)行菌落總數(shù)檢測(cè)的前期準(zhǔn)備、樣品勻液接種和培養(yǎng)過程耗時(shí)均最短。

    3 討論

    3 種測(cè)試片與PCA 培養(yǎng)基的計(jì)數(shù)結(jié)果無(wú)顯著(P>0.05)差異,這與徐蕾蕊等[14]和孫霞等[15]的研究結(jié)果一致。枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和多黏類芽胞桿菌(Paenibacilluspolymyxa)在3M-AC 測(cè)試片上菌落邊緣模糊,液化現(xiàn)象明顯,這與謝范英[7]和王杰偉等[16]的研究結(jié)果一致。液化現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是因?yàn)檫@些菌株的代謝能力較強(qiáng),分解了測(cè)試片中的凝膠。在使用PCA 培養(yǎng)基和3 種測(cè)試片對(duì)煙用香精香料菌落總數(shù)進(jìn)行檢測(cè)時(shí),發(fā)現(xiàn)54號(hào)樣品在PCA培養(yǎng)基上的檢測(cè)結(jié)果比3M-AC 和DNP-AC 測(cè)試片高4 個(gè)數(shù)量級(jí),這與張建軍等[9]報(bào)道的3M-AC 測(cè)試片和PCA 培養(yǎng)基檢測(cè)同一濃縮果汁樣品時(shí),PCA 培養(yǎng)基上的菌落總數(shù)比測(cè)試片上菌落總數(shù)高的結(jié)果相似。

    4 結(jié)論

    17 株標(biāo)準(zhǔn)菌株中的枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和多黏類芽胞桿菌(Paenibacilluspolymyxa)在3M-AC 測(cè)試片上有明顯的液化現(xiàn)象,其余標(biāo)準(zhǔn)菌株在PCA 培養(yǎng)基和3 種測(cè)試片上的菌落形態(tài)均較清晰,便于計(jì)數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)菌株3種測(cè)試片的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值與PCA 培養(yǎng)基的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)。對(duì)菌落總數(shù)定量質(zhì)控樣品的PCA 培養(yǎng)基與3 種測(cè)試片的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值進(jìn)行Z比分?jǐn)?shù)評(píng)價(jià),評(píng)價(jià)結(jié)果均為“滿意”。煙用香精香料樣品的3種測(cè)試片與PCA培養(yǎng)基的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值間差異不顯著(P>0.05),且MC-AC 測(cè)試片與PCA 培養(yǎng)基的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值相關(guān)性(R2=0.922 8,P<0.01)最好。測(cè)試片法比平板計(jì)數(shù)法更簡(jiǎn)便、快速。其中,使用MC-AC測(cè)試片檢測(cè)菌落總數(shù)耗時(shí)最短。

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