氣調貯藏對接種粉紅單端孢霉蘋果的影響研究

曹嘉玥，李曉慧，李慶秀，王 娜，閆師杰,3,*，陳存坤

（1.天津農學院食品科學與生物工程學院，天津 300392；2.東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.天津市農副產品深加工技術工程中心，天津 300392；4.天津市農業(yè)科學院農產品保鮮與加工技術研究所（國家農產品保鮮工程技術研究中心（天津）），農業(yè)農村部農產品貯藏保鮮重點實驗室，天津市農產品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室，天津 300384）

蘋果甘甜性涼，營養(yǎng)豐富，是世界四大水果之冠[1]。因其適應性強、可長期貯藏、便于運輸、滿足全年供應等特點，深受廣大消費者喜愛[2]。由粉紅單端孢霉（Trichothcium roseum）引起的心腐病是我國蘋果采后貯藏期間的主要病害，國內將該類病害統稱為蘋果霉心病[3]。近年來蘋果的霉心病危害程度有所上升，常因果實心室發(fā)霉，果心腐爛和病果早期脫落，果肉腐爛等而損失[4]，且如果貯藏條件不當，其發(fā)病率可高達40%[5-7]。

粉紅單端孢霉可導致甜瓜、番茄、杏、芒果等果實采后腐爛，在侵染果實過程中可以穿過心皮，導致整個果實腐爛，除了造成嚴重的經濟損失，還會產生單端孢霉烯族類毒素[8-10]，這類毒素具有致癌、致畸、致突變等作用，嚴重威脅人類健康[11]。目前，主要采用氣相色譜法[12]、高效液相色譜法[13-14]、液相色譜串聯質譜法[15]等方法檢測果蔬中真菌毒素，其中應用最廣的方法是液相色譜串聯質譜法。

目前我國蘋果主要以冷藏（CS）方式貯藏保鮮，氣調（CA）貯藏占比在10%以下，而發(fā)達國家的蘋果氣調貯藏占總貯藏量的40%以上[16]。冷藏僅通過控制溫度和濕度來延緩果實衰老，而氣調貯藏是在冷藏的基礎上，進一步控制環(huán)境中的二氧化碳和氧氣的比例，具有比冷藏更顯著的保鮮效果[17]。在蘋果、梨、獼猴桃、四季豆等多種果蔬上的研究發(fā)現，氣調貯藏可以有效抑制果蔬的呼吸強度，維持較高的抗氧化酶活性，從而提高貯藏品質[18]。氣調貯藏對接種蘋果毒素含量及相關生理指標的影響是通過CO2和O2的協同作用，在氣調貯藏中，調節(jié)適宜O2與CO2體積分數的聯合貯藏效果比O2與CO2單獨作用顯著。任小林等[19]認為，富士蘋果果肉致密并且不耐高CO2，氣調貯藏時的CO2體積分數要始終低于O2體積分數。目前，針對調節(jié)O2和CO2體積分數對接種粉紅單端孢霉蘋果在貯藏期間的影響相關研究報道較少。因此，本研究以紅富士蘋果為材料，采用固相萃取-超高效液相色譜質譜法對不同氣調貯藏的接種蘋果毒素含量進行檢測，并測定蘋果的生理指標，探究不同氣調貯藏條件對蘋果毒素含量及生理指標的影響，旨在為蘋果貯藏保鮮技術研發(fā)提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

市售紅富士蘋果，于2021 年10 月下旬在山東省煙臺市采摘，選擇大小均勻、成熟度一致、無機械損傷的果實，采后當日運回天津農學院冷庫中，單果質量200～250 g。

粉紅單端孢霉（Trichothcium roseum），北納創(chuàng)聯生物技術有限公司；毒素標準品（赭曲霉素A（OTA）、T-2 毒素、HT-2 毒素、鐮刀菌烯酮（Fus-X）、新茄腐鐮刀菌烯醇（NEO）、細交鏈孢菌酮酸（TeA）、乙二酰鑣草鐮刀菌烯醇-蛇形毒素（DAS）、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-AcDON）、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-AcDON）），美國Romer 公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、乙醇、乙腈（分析純、色譜純）、檸檬酸、乙酸銨（色譜純），天津韻尼科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

Acquity TM 型超高效液相色譜-Xevo TQ-S 串聯質譜儀，美國Waters公司；CA-10型呼吸代謝測定儀，美國Stable systems 公司；GC-14C 型氣相色譜儀，日本島津公司；Check point 型便攜式O2/CO2測定儀，丹麥PBI Dansensor 公司；3-30k 型臺式高速離心機，德國Sigma 公司；N-EVAP-112 型氮吹儀，美國Organomation 公司；VORTEX-BE1 型渦旋混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；PAL-1 型數顯糖度計，日本愛拓公司；PHS-3B型數顯酸度計，上海雷磁儀器廠；BSC-250 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.2 方法

1.2.1 試驗流程

菌種培養(yǎng)→制備孢子懸浮液→接種蘋果→氣調貯藏→指標測定

1.2.2 菌種培養(yǎng)

在超凈工作臺操作，將粉紅單端孢霉標準菌株接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上，在25 ℃條件下避光培養(yǎng)，采用平板劃線法將培養(yǎng)好的菌接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)皿上，將培養(yǎng)皿封口后，在25 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)7～8 d，備用。

1.2.3 孢子懸浮液的制備

參照Bi 等[20]的方法并略作修改。用無菌水沖洗帶菌培養(yǎng)基，在顯微鏡下采用血球計數板計數，每個樣品重復計數2～3次，計算出每毫升孢子懸浮液所含孢子細胞數（5 個中格孢子細胞總數×5×104×稀釋倍數），及孢子懸浮液的濃度，并將孢子懸浮液濃度調節(jié)至108個/mL。

1.2.4 接種

隨機選取無機械損傷、大小均一的紅富士蘋果，在超凈工作臺用75%的乙醇消毒后，再用滅菌打孔器在蘋果的赤道部位均勻打4個孔，將孢子懸浮液接入蘋果，每孔50 μL，每個處理接種35個蘋果。

1.2.5 氣調貯藏

本試驗以具有良好氣密性的盒子作為氣調貯藏的場所，并通過充入N2和CO2調節(jié)氣體組成。將接種有粉紅單端孢霉的蘋果分別放于不同氣體組分條件（氣調Ⅰ：3%～4% O2+1%～2% CO2；氣調Ⅱ：3%～4%O2+3%～4%CO2；氣調Ⅲ：3%～4%O2+5%～6%CO2）進行貯藏，對照組（CK）不進行氣調處理，貯藏溫度均為15 ℃，相對濕度為90%～95%，每5 d 進行1 次產毒素水平和相關生理指標測定。

1.2.6 測定指標與方法

1.2.6.1 粉紅單端孢霉生長曲線的繪制

各處理均取4個蘋果作為每次測量的固定用果，用數顯游標卡尺測定，采用十字交叉法測定蘋果病斑橫縱直徑，取平均值作為腐爛直徑，每5 d 記錄1次，當腐爛直徑大于60 mm 時結束測定，以貯藏時間為橫坐標，腐爛直徑為縱坐標，繪制不同氣體貯藏條件下粉紅單端孢霉生長曲線。

1.2.6.2 蘋果中毒素含量

參考韋迪哲等[21]的方法略作修改，對已接種蘋果中的毒素進行檢測。

1.2.6.3 可溶性固形物含量

參照Tappi 等[22]的方法，隨機挑選6 個已接種蘋果，用PAL-1數顯糖度計測量可溶性固形物含量，將蘋果的未發(fā)生腐爛部分削皮、切塊、用壓汁器壓汁，并用紗布過濾，設定3組平行測量。

1.2.6.4 可滴定酸含量

隨機選取6個已接種蘋果，將蘋果未腐爛部位切塊壓汁，紗布過濾后用PHS-3B 數顯酸度計進行測量，每個蘋果重復3次測量，其結果用百分比表示。

1.2.6.5 呼吸強度

將Liu 等[23]的方法稍加修改后，隨機選取6 個蘋果作為呼吸強度定果，悶氣時間為1 h，悶氣溫度為蘋果貯藏溫度，采用CA-10 呼吸代謝測定儀測定樣品的呼吸強度，單位為mg CO2/(kg·h)，每個處理設3 組平行。

1.2.6.6 乙烯釋放量

隨機挑選6 個已接種蘋果，采用GC-14C 型氣相色譜儀進行乙烯釋放量的測定，單位為μL/（kg·h），每個處理設3組平行。

1.2.7 數據處理

采用SPSS 23.0 軟件進行顯著性分析，用WPS 軟件進行數據統計分析，用Origin 2021軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 氣調貯藏對蘋果中粉紅單端孢霉產毒的影響

2.1.1 氣調貯藏對粉紅單端孢霉生長曲線的影響

由圖1可以看出，接種粉紅單端孢霉后的蘋果在貯藏期間都會出現病斑，且在貯藏期間其病斑（腐爛直徑）持續(xù)增大，在氣調Ⅱ（3%～4%O2+3%～4%CO2）環(huán)境下，粉紅單端孢霉生長速度較其他兩種氣調環(huán)境快，氣調Ⅰ（3%～4% O2+1%～2% CO2）和氣調Ⅲ（3%～4% O2+5%～6% CO2）之間無顯著性差異。10～25 d期間，接種粉紅單端孢霉蘋果的對照組腐爛直徑顯著大于氣調組（P＜0.05），說明適當上調二氧化碳體積分數可以延緩粉紅單端孢霉的生長。

圖1 不同氣調處理對蘋果粉紅單端孢霉生長曲線的影響Fig.1 Effects of different CA treatments on growth curves of T.roseum

2.1.2 氣調貯藏對接種蘋果中毒素產生情況的影響

由表1可以看出，接種蘋果在貯藏期間有TeA毒素產生，其他幾種毒素均未達到檢測限。貯藏前期（0、5 d）各處理接種蘋果中均未檢測到TeA毒素，相同貯藏時間內對照組毒素含量顯著高于氣調組（P＜0.05），說明適當提高貯藏環(huán)境中CO2體積分數有利于抑制接種蘋果中毒素的積累，但并不是CO2體積分數越高抑制效果越好，貯藏在氣調Ⅱ環(huán)境中的TeA毒素含量高于氣調Ⅰ和氣調Ⅲ，氣調Ⅰ與氣調Ⅲ差異不顯著。

表1 貯藏期間接種粉紅單端孢霉的蘋果中TeA的檢出情況Table 1 Contents of TeA toxin of apples inoculated with T.roseum during storage 單位：μg/L

2.2 氣調貯藏對蘋果產毒相關生理指標的影響

2.2.1 氣調貯藏對蘋果可溶性固形物含量的影響

由圖2可以看出，所有處理蘋果中可溶性固形物含量均呈現先上升后下降的變化趨勢，各個氣調處理組均于貯藏15 d 時達到最高值，氣調Ⅰ、氣調Ⅱ、氣調Ⅲ蘋果中可溶性固形物含量峰值分別為13.6%、13.7%、13.7%，而對照組于貯藏20 d 時達到最高值。在貯藏15 d 后氣調組可溶性固形物含量又迅速下降，氣調Ⅲ處理組蘋果中可溶性固形物含量始終低于其他2組氣調處理。在貯藏后期，氣調處理的蘋果可溶性固形物含量均低于對照組，說明氣調貯藏可有效抑制蘋果的呼吸作用，更有利于延長果品的貯藏期。

圖2 不同氣調處理對接種蘋果中可溶性固形物含量的影響Fig.2 Effects of different CA treatments on soluble solids contents of inoculated apples

2.2.2 氣調貯藏對蘋果可滴定酸含量的影響

由圖3 可以看出，3 種氣體組分下貯藏的接種蘋果中可滴定酸含量均呈先上升后下降的變化趨勢。氣調Ⅰ、氣調Ⅱ、氣調Ⅲ組蘋果的可滴定酸含量分別于第10、5、5 天時達到高峰，而后開始下降。在貯藏中后期，氣調Ⅰ和氣調Ⅱ處理蘋果中可滴定酸含量普遍略高于對照組。氣調Ⅲ在貯藏25 d時低于對照組，說明氣調處理可在貯藏中后期適當抑制接種蘋果中可滴定酸的降解，延緩果實成熟和品質劣變。

圖3 不同氣調處理對接種蘋果中可滴定酸含量的影響Fig.3 Effects of different CA treatments on titration acid contents of inoculated apples

2.2.3 氣調貯藏對蘋果呼吸強度的影響

由圖4 可以看出，在貯藏前期，隨著貯藏時間的延長，氣調和對照處理接種蘋果的呼吸強度均呈上升趨勢，氣調Ⅰ、氣調Ⅱ、氣調Ⅲ以及對照組分別于第10、15、15、10天達到呼吸高峰，且對照組的呼吸高峰值顯著高于氣調組（P＜0.05）。說明貯藏環(huán)境中適宜的高二氧化碳體積分數有助于推遲接種蘋果呼吸高峰的出現時間，并能大幅度降低其呼吸強度。

圖4 不同氣調處理對接種蘋果呼吸強度的影響Fig.4 Effects of different CA treatments on respiration rates of inoculated apples

2.2.4 氣調貯藏對蘋果乙烯釋放量的影響

由圖5 可以看出，在3 種氣調環(huán)境下，接種粉紅單端孢霉的蘋果乙烯釋放量快速增加，氣調Ⅰ和對照組的蘋果在第15 天出現乙烯釋放高峰，氣調Ⅱ和氣調Ⅲ處理的蘋果于第20 天出現乙烯釋放高峰，之后下降，說明氣調處理有助于降低果實乙烯釋放峰值，且高體積分數的二氧化碳能夠推遲乙烯釋放高峰的出現時間。

圖5 不同氣調處理對接種蘋果乙烯釋放量的影響Fig.5 Effects of different CA treatments on ethylene release of inoculated apples

3 討論與結論

粉紅單端孢霉侵染水果后會產生如T-2 毒素、HT-2毒素等單端孢烯族毒素，它們和伏馬毒素、雪腐鐮刀菌烯醇等共同隸屬于鐮刀菌毒素，這些鐮刀菌毒素能在植物中代謝或結合并轉化為其他霉菌毒素[24]。細交鏈孢菌酮酸是由鏈格孢菌或其他植物病原菌產生的一種真菌毒素[25]。本試驗中所產生的TeA 毒素可能是由于粉紅單端孢霉所產生的鐮刀菌毒素轉化而來，但具體產生途徑還需進一步探究。

接種蘋果在貯藏期間對照組TeA 含量遠高于氣調組，說明適當提高貯藏環(huán)境中CO2體積分數有利于抑制接種蘋果中毒素的積累，但并不是CO2體積分數越高抑制效果越好，貯藏在氣調Ⅱ環(huán)境下蘋果的TeA毒素含量高于氣調Ⅰ和氣調Ⅲ，氣調Ⅰ與氣調Ⅲ差異不顯著。有研究表明，蘋果心腐病在貯藏期發(fā)病情況與貯藏溫度以及貯藏環(huán)境中O2、CO2等有關，且與貯藏溫度呈正相關[26]；Ali 等[27]將荔枝果實貯藏于10 種不同的氣體環(huán)境下，貯藏溫度為（5±1）℃，研究不同氣體組分對果皮褐變、生化特性和抗氧化活性的影響，結果表明，1%O2+5%CO2氣調處理可延緩果皮褐變，保持抗氧化活性和生化特性，更好地保持荔枝果實的感官品質。然而，不是所有氣調保鮮都可以延長水果貨架期，當氣調參數設置不當時，會對果蔬起反作用。錢卉蘋等[28]研究表明，CO2體積分數過高會造成李子和鴨梨褐變以及風味物質代謝紊亂，還可使桃口感變差。

本試驗結果表明：氣調貯藏有明顯延緩粉紅單端孢霉生長的作用，并能降低蘋果中TeA 毒素含量，氣調Ⅰ（3%～4% O2+1%～2% CO2）和氣調Ⅲ（3%～4%O2+5%～6%CO2）對粉紅單端孢霉生長以及毒素積累的抑制效果優(yōu)于氣調Ⅱ（3%～4% O2+3%～4% CO2）。貯藏25 d 時，與其他2 種氣體環(huán)境相比，氣調Ⅲ中的蘋果可溶性固形物含量最低，氣調Ⅰ和氣調Ⅲ環(huán)境下的蘋果中可滴定酸含量低于氣調Ⅱ，適當提高貯藏環(huán)境中CO2體積分數有利于抑制接種蘋果中TeA毒素的積累以及推遲呼吸高峰和乙烯釋放高峰的出現，進而可以提高果實的貯藏品質，延長果實的采后壽命，但并不是CO2體積分數越高抑制效果越好。