異常畢赤酵母和纖維素酶對青貯甜高粱產(chǎn)甲烷潛力的影響*

任海偉 ,李仲琦 ,趙亞寧 ,丁聞浩 ,張丙云 ,李金平 ,陸 棟,劉瑞媛,李連華,孫永明

(1. 蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 蘭州 730050;2. 甘肅省生物質(zhì)能與太陽能互補供能系統(tǒng)重點實驗室 蘭州 730050;3. 中國科學(xué)院近代物理研究所 蘭州 730000;4. 中國科學(xué)院廣州能源研究所 廣州 510640)

大力發(fā)展可再生能源,從源頭減少碳排放,降低化石能源依賴,是我國實現(xiàn)“雙碳”目標、加快生態(tài)文明建設(shè)的必然選擇。生物天然氣(沼氣)是農(nóng)牧有機廢棄物經(jīng)厭氧消化和凈化提純產(chǎn)生的綠色低碳清潔能源。利用厭氧消化技術(shù)將有機物中的碳能源轉(zhuǎn)化為生物甲烷,既有利于農(nóng)牧廢棄物的循環(huán)利用,還有助于緩解氣候變化。甜高粱(Sorghum bicolor)是一種生長特性優(yōu)良的C4 能源作物,具有光合作用強、抗逆性好、生長速度快、生物量高等優(yōu)勢,在我國甘肅、青海、新疆等西北半干旱地區(qū)廣泛種植,其中甘肅省種植面積約10 萬hm2。據(jù)測算,甜高粱產(chǎn)甲烷潛力可達223～420 mL·g-1(VS),每公頃的青貯甜高粱可產(chǎn)生4440 Nm3的生物甲烷,與玉米(Zea mays)相當(dāng),折合發(fā)電量約76.6～179.5 GJ·hm-2,高于小麥(Tritium aestivum)秸稈和柳枝稷(Panicum virgatum)等,可作為玉米生物能源的替代品[1]。然而,甜高粱作為一種典型的非糧生物質(zhì)資源,表面覆有硅氧蠟質(zhì)層,其復(fù)雜的木質(zhì)纖維組分(纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等)和頑固的抗降解屏障結(jié)構(gòu)很難被微生物高效降解利用,進而影響其生物能源轉(zhuǎn)化效率[2]。其次,甜高粱的種植生產(chǎn)具有明顯的收獲季節(jié)性,且收獲后極易被微生物污染致使可溶性糖變質(zhì)或損失,與生物天然氣工程要求的原料連續(xù)穩(wěn)定供給存在結(jié)構(gòu)性矛盾。再者,新鮮甜高粱含有毒氰苷和抗營養(yǎng)單寧,在厭氧消化產(chǎn)甲烷過程中會釋放對產(chǎn)甲烷菌有毒的氫氰酸[3]。這些因素都會對甜高粱的厭氧消化產(chǎn)甲烷過程造成不利影響[4]。因此,亟需探索一種集甜高粱長時間保質(zhì)貯存和強化預(yù)處理于一體的新方法,從而實現(xiàn)甜高粱貯存的同時進行強化預(yù)處理,以(貯存)時間換取(產(chǎn)能)空間,最終提高生物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率。

青貯既是一種成本低廉的生物質(zhì)保存方法,也蘊藏有一定的生化預(yù)處理作用,使結(jié)構(gòu)性碳水化合物更易被酶或微生物水解利用,從而有效縮短厭氧發(fā)酵周期,提高產(chǎn)甲烷效能,降低生產(chǎn)成本,尤其加入乳酸菌、酵母菌、生物酶等添加劑可以促進生物質(zhì)解聚,調(diào)控效果更好[2]。Wang 等[5]認為布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)等復(fù)合添加劑的應(yīng)用顯著提升青貯質(zhì)量,并且能明顯促進木質(zhì)纖維組分的降解。Kaewpila 等[6]發(fā)現(xiàn)甜高粱青貯時添加植物乳桿菌不僅能有效改善乳酸發(fā)酵,還能提高累計產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量。Antonopoulou等[7]發(fā)現(xiàn)甜高粱青貯時添加纖維素酶可作用于非結(jié)晶區(qū),能有效降解木質(zhì)纖維素。Zhao 等[8]發(fā)現(xiàn)水稻(Oryza sativa)秸稈在青貯中添加纖維素酶能使其纖維組分含量下降,可溶性碳水化合物含量上升,增加對發(fā)酵有利的微生物菌種多樣性。另外,也可以通過纖維素酶在厭氧消化前對消化原料進行生物預(yù)處理,使原料結(jié)構(gòu)被破壞并發(fā)生水解作用,從而提高厭氧消化的甲烷產(chǎn)量。Garcia 等[9]認為使用纖維素酶、纖維二糖酶對甜高粱進行酶預(yù)處理,對其產(chǎn)甲烷性能有一定促進作用。李秋園[10]發(fā)現(xiàn)利用纖維素酶對木糖渣預(yù)處理能大幅度提高原料沼氣生產(chǎn)能力。由此可見,纖維素酶是一種高效的生物催化酶,不僅能低損耗保存生物質(zhì)材料,將纖維素安全高效地降解為還原糖,促進乳酸菌發(fā)酵,還能提高原料利用率與甲烷產(chǎn)量。但由于生物酶制劑成本相對較高,還需要拓寬尋找新的微生物添加劑。

酵母菌也可以用作青貯添加劑,添加釀酒酵母(Sacharomy cescerevisiae)、奇異酵母(Saaccharmy cesparadoxus)等能抑制真菌繁殖,降低霉菌污染,還能調(diào)控乳酸菌代謝從而減少營養(yǎng)物質(zhì)損耗[11]。然而,高劑量(108CFU·g-1)釀酒酵母在青貯玉米中會顯著提高其pH 和氨氮(NH4+-N)含量,降低有機酸含量和有氧穩(wěn)定性;并且釀酒酵母還會在青貯過程中促進酒精發(fā)酵,將糖轉(zhuǎn)化為乙醇和二氧化碳,使得可溶性碳水化合物(WSC)和干物質(zhì)(DM)損失[12-13]。因此,有必要尋找新的酵母菌劑進行青貯調(diào)控。異常畢赤酵母(Pichia anomala)是一種廣具前景、安全無毒的嗜殺酵母,具有抗真菌、降低抗營養(yǎng)物質(zhì)和提高蛋白等作用,還對厭氧、高滲透壓、低pH 和低水分活度等極端環(huán)境有很好的耐受性。它能利用分泌的嗜殺蛋白抑制甚至殺死腐敗真菌的生長,具有良好生物控制作用,常用于果蔬、谷物等糧食貯存[14]。異常畢赤酵母還能產(chǎn)生內(nèi)切葡聚糖酶,對羧甲基纖維素具有水解作用,能破壞秸稈木質(zhì)纖維組分[15]。異常畢赤酵母細胞外還存在大量植酸酶,可提高青貯料的蛋白質(zhì)利用率[16]。Tayel 等[17]認為異常畢赤酵母產(chǎn)生的外切幾丁質(zhì)酶和β-1,3 葡聚糖酶能抑制黃曲霉生長,具有抗真菌活性。Olstorpe 等[18]發(fā)現(xiàn)在谷物飼料青貯中接種異常畢赤酵母可以減少霉菌和腸桿菌含量。任海偉等[19]認為接種異常畢赤酵母能有效減少玉米秸稈與白菜(Brassica campestris)混貯料的營養(yǎng)組分損失,降低纖維組分含量,改善混貯品質(zhì)。因此,異常畢赤酵母可以作為一種調(diào)控青貯效果的策略選擇,但其用于甜高粱青貯過程以及作為預(yù)處理對后續(xù)厭氧消化產(chǎn)甲烷影響的研究還鮮有報道。

本文以甜高粱的青貯保存和生物甲烷化利用為目標,選用異常畢赤酵母、纖維素酶作為青貯添加劑,系統(tǒng)研究不同添加劑組合對甜高粱青貯質(zhì)量、生物甲烷潛力(BMP)、厭氧消化動力學(xué)、消化系統(tǒng)穩(wěn)定性及其微生物群落的影響,進而探討不同添加劑對甜高粱青貯質(zhì)量和產(chǎn)甲烷潛力的調(diào)控效果,最后通過經(jīng)濟性分析篩選適宜的生物強化添加劑。

1 材料與方法

1.1 材料

鮮綠全株甜高粱取自中國科學(xué)院近代物理研究所白銀種植基地,甜高粱植株收獲后迅速運回實驗室,鍘刀切碎至1～2 cm 長度。青貯用纖維素酶(參照GB/T 35808-2018 測得羧甲基纖維素酶活力50 000 U·g-1)購自寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司,最適溫度35 ℃,最適pH 4.4;3 g 纖維素酶溶于70 mL的蒸餾水。青貯用異常畢赤酵母菌(CICC 1716)購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心,按照說明書活化后接種至PDA 培養(yǎng)基,于28 ℃培養(yǎng)72 h 制成菌懸液。厭氧消化污泥取自甘肅荷斯坦奶牛示范中心沼氣工程發(fā)酵罐[(35±1) ℃],取回實驗室后馴化處理、100 目尼龍紗布過濾備用[20]。厭氧消化用的接種污泥干物質(zhì)(DM)和揮發(fā)性固體(VS)含量分別為(30.8±1.02) g·kg-1(FW)和(10.9±0.58) g·kg-1(DM)。

1.2 試驗方法

1.2.1 甜高粱青貯試驗設(shè)計

準確稱取4 kg 甜高粱碎段,依據(jù)青貯原理,添加劑加入量均以原料鮮重(fresh weight,FW)為基礎(chǔ),每1 kg 甜高粱使用噴壺均勻噴灑不同的生物添加劑或是等體積蒸餾水調(diào)節(jié)秸稈水分至70%～75%;再每份0.33 kg 裝入聚乙烯袋(45 cm×30 cm),用真空包裝機抽真空密封,于室溫[(20±2) ℃]避光貯藏21 d 后完成青貯發(fā)酵,第22 天開封取樣分析有機組分和發(fā)酵特性等指標[21]。試驗設(shè)置1 個對照組(SS 組,每袋原料均勻噴灑70 mL 的蒸餾水)和3 個添加劑處理組: 異常畢赤酵母組(Pa 組,異常畢赤酵母接種量為1×106CFU·g-1,每袋原料均勻噴灑70 mL 濃度為1.43×107CFU·mL-1的異常畢赤酵母菌懸液)、纖維素酶組(Cx 組,纖維素酶添加量為0.3%,每袋原料均勻噴灑70 mL 濃度為0.04 g·mL-1纖維素酶溶液)和菌酶協(xié)同處理組(PC 組,同時添加異常畢赤酵母和纖維素酶,添加量同上,每袋原料均勻噴灑35 mL 濃度為2.86×107CFU·mL-1異常畢赤酵母菌懸液和35 mL濃度為0.08 g·mL-1纖維素酶溶液),每組3 個平行。

1.2.2 青貯前后的甜高粱產(chǎn)甲烷潛力評價

利用AMPTSII 全自動甲烷潛力系統(tǒng)評價新鮮或青貯甜高粱的產(chǎn)甲烷性能。厭氧消化條件: 發(fā)酵罐的裝罐率為80%,底物添加量VS接種污泥∶VS底物=2∶1,添加蒸餾水補足發(fā)酵體積至400 mL,攪拌速率80 r·min-1,攪拌頻率10 min·h-1。厭氧消化底物為1 個未青貯原料(CK)和4 個處理組(SS、Pa、Cx 和PC)完成21 d 青貯發(fā)酵的材料,每組材料3 個平行。過濾并混合均勻的接種物與消化底物按比例添加迅速搖勻后通入3 min 氮氣以排除多余空氣,中溫[(37±0.5) ℃]進行20 d 的厭氧消化試驗,分別于消化反應(yīng)的第1 天、第3 天、第5 天、第7 天、第10 天、第15 天和第20 天使用10 mL 的注射器從發(fā)酵罐上方取樣口抽取10 mL 均勻的發(fā)酵液測定反應(yīng)體系的pH、化學(xué)需氧量(chemical oxygen demand,COD)、揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)、氨氮(NH4+-N)等,且當(dāng)日產(chǎn)甲烷量小于累計產(chǎn)甲烷量1% (BMP 1%)時認為反應(yīng)停止[22-23]。儀器自動記錄產(chǎn)氣量,當(dāng)日產(chǎn)氣量需去除當(dāng)日對照組產(chǎn)量。

1.2.3 厭氧消化動力學(xué)

利用修正Gompertz 方程對各試驗組累計產(chǎn)甲烷量進行擬合,求解產(chǎn)甲烷動力學(xué)擬合參數(shù)[24],計算公式為:

式中:Y是t時刻的累計產(chǎn)甲烷量[mL(CH4)·g-1(VS)];Ym是最大甲烷累計產(chǎn)量[mL(CH4)·g-1(VS)];Rm是最大產(chǎn)甲烷速率[mL(CH4)·g-1(VS)];λ表示遲滯期(d)。用R2表示動力學(xué)模型擬合曲線的程度。

1.3 分析方法

1.3.1 青貯質(zhì)量分析

青貯發(fā)酵完成后從每個青貯聚乙烯袋中取2～3 g樣品在105 ℃下進行干物質(zhì)(DM)含量測定。再取部分樣品在65 ℃條件下烘干粉碎,過100 目篩子后,采用蒽酮硫酸比色法測定可溶性碳水化合物(WSC)[24];采用K9840 凱氏定氮儀測定總氮(TN),粗蛋白(CP)含量=總氮×6.25;中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)和酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)采用范氏(Van Soest)洗滌法測定。纖維素(CL)、半纖維素(HC)含量[25]、生物降解潛力(BDP)以及干物質(zhì)損失率(LDM)的計算公式如下:

1.3.2 發(fā)酵品質(zhì)分析

根據(jù)四分法均勻準確地稱取10 g 樣品置于勻漿機內(nèi),按料液比1∶9 加入蒸餾水進行勻漿,以8000 r·min-1勻漿5 min 后用4 層紗布過濾勻漿液,所得濾液以3900 r·min-1離心10 min,定性濾紙二次過濾得到澄清青貯浸提液,用于測定pH、氨態(tài)氮(AN)、乳酸(LA)和乙酸(AA)等指標。青貯pH 測定采用UB-7 酸度計;氨氮(AN)測試采用苯酚-次氯酸鈉比色法;乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PPA)等有機酸產(chǎn)物分析采用安捷倫1200 高效液相色譜儀檢測,配置KC-811 離子柱和DAD 檢測器,柱溫50 ℃,流動相3 mmol·L-1HClO4溶液,進樣量5 μL[26]。

1.3.3 青貯質(zhì)量的綜合分析評價

采用隸屬函數(shù)法綜合評價4 個青貯組的青貯質(zhì)量,以全部指標隸屬函數(shù)值平均值大小進行排序,綜合評價值越高代表質(zhì)量越好[27]。其中DM、WSC、CP、CL、HC、LA 和AA 為正向指標,LDM、ADL、ADF、NDF 和pH 為負向指標。計算公式如下:

式中:Uxi為某指標的隸屬函數(shù)值,Xi為某指標測定值,Xmin和Xmax分別為某指標最小測定值和最大測定值。

1.3.4 厭氧消化特征參數(shù)分析

取厭氧發(fā)酵液10 mL 在12 000 r·min-1狀態(tài)下離心6 min,將上清液過0.45 μm 水系濾膜后加入25%的偏磷酸(浸提液與偏磷酸的體積比為5∶1),靜置30 min,在1500 r·min-14 ℃狀態(tài)下離心15 min,再過0.22 μm 纖維素乙酸酯濾膜去除大分子雜質(zhì)。采用高效氣相色譜測定原料厭氧發(fā)酵過程中的揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids,VFAs)濃度變化以及總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度。測定條件為: FID 檢測器,采用WondaCapFFAP (30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細管柱,分流比為5∶1,FID 溫度為250 ℃[28]。

取樣品離心后的上清液,使用5B-3C-V8 雙參數(shù)測定儀(蘭州連華科技)測定COD 和NH4+-N。采用T960 全自動電位滴定儀(山東海能儀器)測定碳酸氫鹽堿度(PA)、揮發(fā)酸堿度(IA)和pH。有機元素采用Vario EL/microcube 分析儀(德國Elementar Inc.)測定后得到C、H、O、N 的含量,再將其轉(zhuǎn)化為分子式CaHbOcNd表示,可通過下列方程得到單位理論甲烷產(chǎn)量(TMP)的甲烷理論產(chǎn)量和生物降解性(BI)[29]。分子式和計算公式如下:

式中: TMP 為理論甲烷 產(chǎn) 量[mL(CH4)·g-1(VS)],EMP為實際累計甲烷產(chǎn)量[mL(CH4)·g-1(VS)]。n 是C 元素所占百分比,a 是H 元素所占百分比,b 是O 元素所占百分比,c 是N 元素所占百分比。

1.3.5 厭氧消化微生物菌群分析

取厭氧發(fā)酵液 6 mL,通過冷凍高速離心留沉淀物于-80 ℃保存。采用CTAB 法提取樣本基因組DNA,利用細菌特征引物341F (5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’)和806 (5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’)對16S rRNA 基因V3+V4 區(qū)域進行PCR 擴增。利用古細菌特征引物Arch519F (5’-CAGCCGCCGCGGTAA-3’)和Arch 915R (5’-GTGC TCCCCCGCCAATTCCT-3’)對16S RNA 基因V4+V5 區(qū)域進行PCR 擴增。用Illumina 公司NovaSeq 6000 PE250 平臺上機測序,微科盟云平臺對測序結(jié)果進行微生物群落組成分析[30]。

1.4 經(jīng)濟性能指標分析

根據(jù)成本收益理論構(gòu)建青貯預(yù)處理成本收益模型,對甜高粱青貯預(yù)處理所需纖維素酶、異常畢赤酵母增加的經(jīng)濟成本,以及青貯預(yù)處理所增加的甲烷產(chǎn)量進行經(jīng)濟性能分析,計算公式為:

式中:Ii表示第i種青貯預(yù)處理方式的甜高粱純收益,Mi表示第i種青貯預(yù)處理消化組的甲烷產(chǎn)量,M0表示原料消化組的甲烷產(chǎn)量,P表示生物沼氣提純后的甲烷價格,Ei表示第i種青貯預(yù)處理甜高粱青貯成本(含添加劑)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標準差表示,使用SPSS 20.0 軟件進行雙因素方差分析,采用Origin 2021 軟件制圖并利用修正Gompertz 方程擬合累計產(chǎn)甲烷曲線,利用單因子ANOVO 模型處理和Duncan 方法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加劑對甜高粱青貯質(zhì)量的分析

從表1 可知,青貯處理以及添加青貯添加劑均對甜高粱的青貯品質(zhì)有顯著影響(P＜0.05),如對干物質(zhì)、可溶性碳水化合物、粗蛋白等的營養(yǎng)物質(zhì)的保存效果不同,從而甜高粱的青貯質(zhì)量也有所差距。4 個青貯組的DM 含量均顯著低于原料甜高粱組(P＜0.05),3 個添加劑組的LDM 顯著低于空白SS 組(P＜0.05),尤其Cx 組和Pa 組的LDM 相對最低。與原料甜高粱相比,青貯甜高粱WSC 含量均顯著下降(P＜0.05),但Pa 和PC 組WSC 含量均顯著高于SS 組(P＜0.05)。從CP 含量變化情況來看,除了Pa 組與原料組差異不顯著,其他青貯組的CP 含量均顯著低于原料組,另外2 個添加劑青貯組Cx 組和PC 組的CP 含量也均顯著高于SS 組(P＜0.05)。

表1 不同添加劑處理下甜高粱青貯前后理化性質(zhì)的變化Table 1 Physicochemical properties of sweet sorghum before and after ensiling with different additives

木質(zhì)纖維組分變化結(jié)果顯示,4 個青貯組ADF、NDF 和ADL 含量均顯著低于原料組(P＜0.05),且3個添加劑組均顯著低于SS 組(P＜0.05)。同時,Cx 組和PC 組的ADL 含量最低,Pa 組的NDF 含量顯著低于其他試驗組(P＜0.05)。上述組分變化使4 個青貯組的CL 和HC 含量明顯高于原料組(P＜0.05),這些碳水化合物獲得有效保存,為后續(xù)的厭氧消化產(chǎn)甲烷過程奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

由表1 可知,青貯處理以及添加青貯添加劑均對甜高粱青貯發(fā)酵的pH 和有機酸含量具有顯著影響(P＜0.05)。其中,4 個青貯組的pH 均顯著下降,遠低于原料組(P＜0.05);并且4 個青貯組的pH 遠低于或趨近于最優(yōu)青貯(pH 4.20)。從甜高粱青貯發(fā)酵的有機酸組成來看,4 個青貯組的LA 含量顯著增加(P＜0.05),尤其Pa 組的LA 和AA 含量均明顯高于其他組(P＜0.05)。添加異常畢赤酵母的兩個青貯組AA 含量顯著高于其他青貯處理組。

采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對青貯21 d 的甜高粱進行青貯質(zhì)量綜合評價,選取12 個指標隸屬函數(shù)值的平均值進行排名,平均值越大,代表綜合質(zhì)量越高。由表1 可知,4 個青貯組排名依次為PC 組＞Pa 組＞Cx 組＞SS 組,并且PC 組(0.66)和Pa 組(0.63)的綜合評價值遠高于其他試驗組。

2.2 添加劑對青貯甜高粱厭氧消化產(chǎn)甲烷過程的影響

由圖1a 可知,5 個試驗組的日產(chǎn)甲烷量均呈現(xiàn)雙峰特征。在消化第1 天出現(xiàn)產(chǎn)氣高峰,新鮮甜高粱CK 組的日產(chǎn)甲烷量為78.04 mL(CH4)·g-1(VS),明顯低于4 個青貯高粱消化組,PC 組的日產(chǎn)甲烷量最高,達86.59 mL(CH4)·g-1(VS),其次是Pa 組[83.25 mL(CH4)·g-1(VS)]、Cx 組 [82.52 mL(CH4)·g-1(VS)]。消化反應(yīng)進行到第5 天時出現(xiàn)第2 個產(chǎn)氣峰值。此時CK 組日產(chǎn)甲烷量為50.00 mL(CH4)·g-1(VS),依然低于4 個青貯組,Pa 組[63.74 mL(CH4)·g-1(VS)]最高,緊隨其后的是PC 組[63.07 mL(CH4)·g-1(VS)]、Cx 組[60.29 mL(CH4)·g-1(VS)]。隨著消化反應(yīng)持續(xù),第6 天日產(chǎn)甲烷量快速降低,第11 天進入穩(wěn)定期,第20 天消化反應(yīng)結(jié)束(BMP 1%)。從圖1b 可以看出,消化第20 天4 個青貯組的累計產(chǎn)甲烷量明顯高于原料CK 組[351.72 mL(CH4)·g-1(VS)],其中PC 組累計產(chǎn)氣量最高,為457.70 mL(CH4)·g-1(VS),Pa 組為455.56 mL(CH4)·g-1(VS),Cx 組為441.53 mL(CH4)·g-1(VS)。顯而易見,青貯預(yù)處理對甜高粱的厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷量有顯著提升效果,尤其是添加異常畢赤酵母和或纖維素酶的青貯預(yù)處理使得甲烷產(chǎn)量提升25.53%～30.13%。

圖1 不同添加劑對青貯甜高粱日產(chǎn)甲烷量(a)和累計產(chǎn)甲烷量(b)的影響Fig.1 Effect of different additives on daily methane production (a) and cumulative methane production (b) of sweet sorghum silage

圖2 顯示,青貯處理后甜高粱的實際甲烷產(chǎn)量均高于CK 組,且生物降解指數(shù)也顯著高于CK 組(52.59%,P＜0.05),其中PC 組最高,為73.39%,這與圖1產(chǎn)甲烷量的結(jié)果一致;Pa 組、Cx 組以及SS 組的生物降解指數(shù)差異不顯著,為65%～68%。

圖2 不同添加劑對青貯甜高粱生物降解指數(shù)的影響Fig.2 Effect of different additives on the biodegradability index of sweet sorghum silage

2.3 添加劑對青貯甜高粱厭氧發(fā)酵動力學(xué)的影響

如表2 所示,5 個厭氧消化組的模型決定系數(shù)R2值均在0.99 以上,擬合程度能較好地說明產(chǎn)甲烷實際特征。4 個青貯消化組的最大累計產(chǎn)甲烷量(Ym)和最大產(chǎn)甲烷速率(Rm)均顯著高于CK 組(P＜0.05),其中PC 組和Cx 組的Ym增幅最顯著,Pa組的Rm較CK 組提升33.57%。4 個青貯消化組的遲滯期(λ)值明顯低于CK 組(P＜0.05),尤其PC 組和Cx 組的遲滯期最短,這與圖1 產(chǎn)氣特征吻合。

表2 不同添加劑處理下青貯甜高粱的厭氧消化產(chǎn)甲烷動力學(xué)擬合參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of methane production during anaerobic digestion of sweet sorghum silage under different additive treatments

2.4 添加劑對青貯甜高粱厭氧消化系統(tǒng)穩(wěn)定性的影響

由圖3a 可知,接種物的初始pH 為8.1,處于弱堿環(huán)境。加入物料啟動消化反應(yīng)后pH 迅速下降至7.60 左右,隨著發(fā)酵的進行呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢并穩(wěn)定在7.90～8.10。結(jié)合圖3b 可知,4 個青貯消化組的初始總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)含量比原料組提升3.93%～15.41%。隨著TVFA 被產(chǎn)甲烷菌群代謝利用,第10 天體系中TVFA 幾乎被消耗殆盡。另外,PC 組的TVFA 含量整體低于其他3 個青貯組,這與該組累計產(chǎn)甲烷量結(jié)果吻合。

圖3 不同添加劑對青貯甜高粱厭氧消化系統(tǒng)pH 和總揮發(fā)性脂肪酸含量(TVFA)的影響Fig.3 Effect of different additives on the pH and total volatile fatty acid content (TVFA) during anaerobic digestion of sweet sorghum silage

由圖4 可知,5 個試驗組的消化液中化學(xué)需氧量(COD)濃度均隨消化反應(yīng)進行而呈現(xiàn)整體下降趨勢,尤其前10 d 的COD 濃度降幅最快。值得注意的是,Cx 組和PC 組的COD 濃度在消化第3 天略有上升。消化第10 天 COD 濃度維持在900～1100 mg·L-1,對應(yīng)體系的產(chǎn)甲烷量進入平穩(wěn)期。

圖4 不同添加劑對青貯甜高粱厭氧消化系統(tǒng)穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of different additives on the systems stability of anaerobic digestion of sweet sorghum silage

5 個消化組的氨氮(NH4+-N)濃度均維持在1600～1700 mg·L-1,未產(chǎn)生氨抑制現(xiàn)象。揮發(fā)酸堿度(IA)代表揮發(fā)性脂肪酸的緩沖能力,碳酸氫鹽堿度(BA)代表碳酸氫鹽和氨氮的緩沖能力,揮發(fā)酸堿度/碳酸氫鹽堿度IA/BA 可作為監(jiān)測消化系統(tǒng)緩沖能力、判斷系統(tǒng)運行穩(wěn)定性的預(yù)警指標。當(dāng)IA/BA＞0.5 時系統(tǒng)趨于失穩(wěn),介于0.3～0.5 時具有較強緩沖能力,系統(tǒng)穩(wěn)定[31]。試驗中,5 個消化組的IA/BA 值隨消化反應(yīng)進行逐漸下降至0.5 以下,為產(chǎn)甲烷菌群繁殖代謝提供了穩(wěn)定環(huán)境,直至消化結(jié)束時(20 d) IA/BA 值穩(wěn)定在0.3 左右。

2.5 添加劑對青貯甜高粱厭氧消化系統(tǒng)微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.5.1 細菌多樣性分析

如圖5a 所示,接種物中細菌門主要有厚壁菌門(Firmicutes,54.05%)、擬桿菌門(Bacteroidetes,31.52%)以及少量纖維桿菌門(Fibrobacteres,7.04%)、變形菌門(Proteobacteria,3.41%)和互養(yǎng)菌門(Synergistetes,2.2%)等。通過圖可知,與CK 組中微生物群落組成相比,4 個青貯消化組的細菌群落結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生大的變化,但是各種功能菌門的比例有所變化。厭氧消化反應(yīng)啟動后,5 個消化組的消化液中厚壁菌門和擬桿菌門始終占據(jù)絕對優(yōu)勢,這與接種物中的優(yōu)勢細菌門相同;但3 個添加劑預(yù)處理的消化組的厚壁菌門和擬桿菌門的豐度之和減少,而軟壁菌門(Tenericutes)的豐度增加近50%,彎曲菌門(Epsilonbacteraeota)、念珠菌門(Patescibacteria)等功能菌也表現(xiàn)出增加的趨勢。隨著反應(yīng)進行,互養(yǎng)菌門的豐度均為“先減后增”趨勢,于發(fā)酵第5 天達最低值。除PC 組外,其余4 個組的厚壁菌、擬桿菌和互養(yǎng)菌豐度之和均呈現(xiàn)“先增后減”趨勢,第3 天豐度均達最高值96.60%～96.29%;而PC 組中3 類細菌豐度之和在消化第1 天達最高值97.47%,遠高于其他處理組,隨后豐度逐漸降低。

圖5 不同添加劑對青貯甜高粱消化過程中細菌群落門水平(a)和屬水平(b)相對豐度的影響Fig.5 Effect of different additives on the relative abundances of bacterial communities at phylum level (a) and genus level (b)during anaerobic digestion of sweet sorghum silage

如圖5b 所示,接種物的優(yōu)勢細菌屬包括梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1,7.31%)、發(fā)酵單胞菌屬(Fermentimonas,6.91%)、DMER64(7.32%)和瘤胃梭菌屬(Ruminiclostridium_1,5.48%)等。消化反應(yīng)啟動后,CK 組發(fā)酵單胞菌屬相對豐度增至11.11%,梭狀芽孢桿菌屬相對豐度增至23.33%,DMER64則降至3.97%。4 個青貯消化組的發(fā)酵單胞菌屬相對豐度增至13.09%～19.97%,梭狀芽孢桿菌屬相對豐度增至15.34%～19.90%,且二者在PC 組中的豐度均高于SS 組、Cx 組和Pa 組。隨著消化進程的推進,CK 組和SS 組的梭狀芽孢桿菌屬呈現(xiàn)先降低再升高趨勢,第5 天時豐度最低,分別為6.82%和9.93%;而Cx 組和Pa 組則呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢。另一方面,5 個消化組在前5 d 發(fā)酵單胞菌屬相對豐度較高,10 d 后均明顯下降;而魯氏絲狀桿菌屬(Ruminofilibacter)和DMER64在5 d 時的相對豐度則明顯高于發(fā)酵初期。此外,消化體系還有少量沉積菌屬(Sedimentibacter) (2%～3%)、瘤胃梭菌屬(0.5%～2%)和葡萄球菌(Turicibacter,0.3%～4.6%)。

2.5.2 古菌多樣性分析

如圖6a 所示,無論是接種物還是不同處理組的厭氧發(fā)酵消化液中的絕對優(yōu)勢菌門均為廣古菌門(Euryarchaeota),平均豐度高達98%以上。反應(yīng)啟動初期(1～3 d),CK 組、Cx 組和Pa 組存在少量泉古菌門(Crenarchaeota,2.67%～3.10%)。結(jié)合圖6b 分析,接種物中優(yōu)勢古菌屬包括甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina,42.75 %)、甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter,39.28 %)以及甲烷桿菌屬(Methanobacterium,7.08%)、甲烷球菌屬(Methanosphaera,8.06%)和少量的甲烷鬃菌屬(Methanosaeta,0.11%)、甲烷粒菌屬(Methanocorpusculum,0.8%)、vadinCA11(1.09%)。消化反應(yīng)啟動后,3 個添加劑預(yù)處理的消化組中甲烷八疊球菌屬豐度持續(xù)升高,并在消化后期(10～20 d)占據(jù)優(yōu)勢地位,相對豐度高達89.03%～97.04%。甲烷短桿菌屬、甲烷桿菌屬和甲烷球菌屬的豐度在消化后期均持續(xù)下降。另外,消化前期出現(xiàn)的甲烷鬃菌屬在PC 組中相對豐度最高。

圖6 不同添加劑對青貯甜高粱消化過程中古菌群落門水平(a)和屬水平(b)相對豐度的影響Fig.6 Effect of different additives on the relative abundances of archaeal communities at phylum level (a) and genus level (b)during the anaerobic digestion of sweet sorghum silage

2.5.3 細菌和古菌與厭氧消化液特征參數(shù)相關(guān)性分析

由圖7a 可知,發(fā)酵單胞菌屬(Fermentimonas)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Fastidiosipia、羅姆布茨菌屬(Romboutsia)、Ruminiclostridium-1、Paeniclostridium和葡萄球菌屬(Turicibacter)等細菌與pH 呈負相關(guān)(P＜0.001),與COD、TVFA 呈正相關(guān)(P＜0.001)。DMER64、瘤胃梭菌屬(Ruminiclostridium)、沉積菌屬(Ruminofilibacter)、克里斯滕森菌屬(Christensenellaceae-R-7-group)、硫代單胞菌屬(Thiopseudomonas)和鈣桿菌屬(Caldicoprobacter)等細菌豐度與pH 呈正相關(guān)(P＜0.001),與COD 和TVFA 含量呈負相關(guān)(P＜0.001),氨氮與細菌的硫代單胞菌屬呈正相關(guān)(P＜0.05)。

圖7 厭氧消化液中細菌(a)和古菌(b)屬水平豐度與反應(yīng)特性參數(shù)的相關(guān)性分析Fig.7 Correlation analysis of bacterial (a) and archaea (b) with anaerobic digestion characteristics parameters

由圖7b 可知,甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)與COD 和TVFA 呈負相關(guān),與pH 呈正相關(guān)。甲烷桿菌屬(Methanobacterium)、甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)和甲烷球菌屬(Methanosphaera)等古菌與COD 和TVFA 濃度呈正相關(guān)關(guān)系,與pH 呈負相關(guān)關(guān)系。甲烷粒屬(Methanocorpusculum)與氨氮呈正相關(guān),與pH 呈負相關(guān)。

2.6 不同添加劑預(yù)處理下高粱秸稈產(chǎn)甲烷經(jīng)濟性能分析

本文中,僅以甜高粱秸稈以及青貯預(yù)處理所增加的經(jīng)濟成本及青貯預(yù)處理所增加的甲烷產(chǎn)量做經(jīng)濟性分析。在計算過程中,計算基準為1 t 甜高粱,以每噸VS 為一個計量單位進行計算,纖維素酶價格為60 ￥·kg-1。沼氣提純后的甲烷價格取3.5 ￥·m-3。由表3 可知,甜高粱經(jīng)不同青貯預(yù)處理增產(chǎn)甲烷的綜合理論經(jīng)濟收益差異較為明顯,不同預(yù)處理效益由高到低依次為Pa 組、SS 組、PC 組和Cx 組。

表3 青貯預(yù)處理前后的經(jīng)濟性能分析Table 3 Economic performance analysis before and after ensiling pretreatment

3 討論

3.1 添加劑對青貯甜高粱營養(yǎng)成分及發(fā)酵品質(zhì)的影響

甜高粱中的干物質(zhì)(DM)、粗蛋白(CP)和可溶性碳水化合物(WSC)等的含量高低能綜合反映青貯質(zhì)量優(yōu)劣,這些組分的含量越高說明營養(yǎng)物質(zhì)損失越少,青貯品質(zhì)越好。本試驗中,4 個青貯組的DM顯著低于新鮮甜高粱,這是由于青貯過程中微生物菌群所參與的生化反應(yīng)需要消耗大量可溶性糖、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)作為代謝底物,并產(chǎn)生CO2和有機酸等揮發(fā)物所致。與此同時,3 個添加劑組的干物質(zhì)損失率(LDM)均顯著低于空白SS 組,尤其Cx 組和Pa 組的LDM 相對較低。這是因為一方面,添加纖維素酶能有效分解植物細胞壁中的纖維素和半纖維素等結(jié)構(gòu)性碳水化合物,為乳酸菌等有益微生物活動提供充足的發(fā)酵底物,促進發(fā)酵進程。同時,隨著乳酸等有機酸積累和pH 降低,也抑制了其他不良微生物活性,進而減少干物質(zhì)損耗[32]。另一方面,Pa 組中添加的異常畢赤酵母代謝產(chǎn)生的蛋白或糖蛋白毒素也能有效抑制或殺死不良微生物,更好地保存青貯營養(yǎng)物質(zhì)[18]。當(dāng)異常畢赤酵母和纖維素酶同時添加能進一步強化青貯發(fā)酵強度,二者協(xié)同加速了甜高粱的結(jié)構(gòu)性碳水化合物消耗,產(chǎn)生過多的乳酸和乙酸等揮發(fā)性物質(zhì),導(dǎo)致PC 組的干物質(zhì)損失率高于單一添加劑組[33]。

一般而言,青貯原料WSC 低于60～70 g·kg-1(DM)則不利于青貯發(fā)酵,本試驗選用的甜高粱原料完全滿足該條件[2]。青貯21 d,3 個添加劑組WSC 含量均顯著高于SS 組,說明單獨或組合添加異常畢赤酵母和纖維素酶均能有效減少碳水化合物損失,其中菌酶協(xié)同的PC 組效果更佳。這是因為一方面纖維素酶能有效破壞植物細胞壁,將纖維素水解為寡糖和葡萄糖等[7]。另一方面,異常畢赤酵母分泌的嗜殺蛋白能與靶細胞壁的β-葡聚糖結(jié)合,通過水解細胞壁的主要成分來誘發(fā)毒性作用,從而抑制腐敗菌生長,減少糖分損失[14]。Zhao 等[8]認為青貯水稻(Oryza sativa)秸稈中添加纖維素酶能提高碳水化合物含量。任海偉等[19]也認為添加異常畢赤酵母能顯著提高干玉米秸稈與廢棄白菜混貯料碳水化合物含量。就粗蛋白含量而言,由于青貯體系本身存在分解蛋白質(zhì)的微生物和蛋白酶,使得青貯組(除Pa 組外) CP 含量均明顯低于原料;但Pa 組的CP 含量與原料差異不顯著,說明青貯中添加異常畢赤酵母可以減少蛋白質(zhì)損失。因為異常畢赤酵母獨特的嗜殺作用不僅能有效抑制青貯體系的蛋白分解菌,還能降低不良微生物與有益乳酸菌的營養(yǎng)競爭,促進低pH 環(huán)境快速形成,致使蛋白酶失活,減少蛋白水解[15]。同時,異常畢赤酵母菌體自身富含微生物蛋白,且在產(chǎn)生嗜殺因子的同時還能產(chǎn)生植酸酶和單細胞蛋白,使得Pa 組中粗蛋白含量幾乎未受損失[18]?？梢?青貯發(fā)酵過程中添加異常畢赤酵母可以有效減少甜高粱營養(yǎng)物質(zhì)損失。

木質(zhì)纖維組分是影響生物質(zhì)利用和厭氧消化產(chǎn)甲烷效能的重要因素。纖維素(CL)和半纖維素(HC)是結(jié)構(gòu)性碳水化合物含能組分,酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)是影響生物降解性能的主要屏障;較高的ADL 含量會影響降解效率和產(chǎn)甲烷效能[34]。本試驗中,3 個添加劑組酸性洗滌纖維(ADF)和中性洗滌纖維(NDF)含量均呈現(xiàn)下降趨勢且顯著低于CK 組,這與趙政等[32]報道的玉米秸稈青貯中添加纖維素酶可降低NDF、ADF 和ADL 含量的研究結(jié)果一致?？梢?青貯發(fā)酵對木質(zhì)纖維組分降解確實具有一定的預(yù)處理作用,而且菌酶聯(lián)合添加更有利于破壞木質(zhì)纖維分子聚合物之間的酯鍵,增加生物降解可及性。與此同時,Cx 組和PC 組的ADL 含量最低,說明添加纖維素酶青貯能有效降低木質(zhì)素含量,進而提高生物可及性。另外,Pa 組的NDF 含量顯著低于其他試驗組,這可能是源于異常畢赤酵母對細胞壁的降解作用,能產(chǎn)生對木質(zhì)纖維素具有優(yōu)先水解作用的內(nèi)切葡聚糖酶,有助于降解木質(zhì)纖維組分[15],這與試驗中WSC、CP、NDF、ADF、CL 和 HC 等組分變化趨勢相吻合。因此,添加纖維素酶和異常畢赤酵母均有助于青貯甜高粱的木質(zhì)纖維組分降解,為后續(xù)的厭氧消化產(chǎn)甲烷過程奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

青貯發(fā)酵過程產(chǎn)生的小分子有機酸不僅對青貯質(zhì)量優(yōu)劣有重要影響,同時也是厭氧產(chǎn)甲烷菌群的重要代謝底物。一般認為優(yōu)良青貯的pH 在3.70～4.30,本試驗4 個青貯組的pH 均符合優(yōu)質(zhì)青貯范圍。這與Nkosi 等[35]在甜高粱中添加纖維素酶和乳酸菌青貯后pH 低于3.9 結(jié)果類似,同時也與Borling 等[36]發(fā)現(xiàn)添加異常畢赤酵母、纖維素酶以及乳酸菌與大麥(Hordeum vulgare)青貯中pH 顯著降低的結(jié)果相似。青貯微生物代謝所產(chǎn)生的乳酸[酸度系數(shù)(pKa)=3.86]和乙酸(pKa=4.74)積累是pH 下降的主要原因。青貯發(fā)酵后的乳酸含量顯著增加,均接近或高于30 g·kg-1(DM),達到優(yōu)質(zhì)青貯標準。優(yōu)質(zhì)青貯含有較多的乳酸(占有機酸含量60 %以上)和少量乙酸,幾乎不含丙酸和丁酸[37]。并且乙酸具有抗真菌活性,對提高青貯有氧穩(wěn)定性和保存性能具有積極作用。本試驗中,Pa 組的乳酸和乙酸含量均明顯高于其他組,這是因為一方面異常畢赤酵母對有害微生物生長具有抑制作用,減少有害微生物對乳酸的分解[15];另一方面異常畢赤酵母還可以釋放乙酸乙酯,而后者易水解生成乙酸[38]。再者,異常畢赤酵母與青貯乳酸菌群存在互利共生機制,能協(xié)同促進有益乳酸菌群的活動[39]。Sun 等[40]認為木質(zhì)纖維降解率與有機酸(尤其是乳酸)的產(chǎn)生呈正相關(guān)關(guān)系,這也是本試驗Pa 組NDF 含量最低的原因之一。另外,高粱秸稈表面有硅氧蠟質(zhì)層,不僅對纖維素酶和纖維素接觸產(chǎn)生空間阻斷作用,還能夠競爭性吸附纖維素酶,影響有機酸生成量,導(dǎo)致Cx 組的乳酸和乙酸含量相對較低[4]。利用隸屬函數(shù)法對甜高粱青貯質(zhì)量綜合評價,發(fā)現(xiàn)PC 組和Pa 組的綜合評價值相近且遠高于其他試驗組。

3.2 添加劑對青貯甜高粱厭氧發(fā)酵過程的影響

將青貯21 d 的甜高粱和新鮮甜高粱分別作為厭氧消化的原料,進行批次厭氧發(fā)酵試驗分析其產(chǎn)沼氣效能。經(jīng)青貯預(yù)處理后的甜高粱木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)被破壞,部分半纖維素、纖維素被水解產(chǎn)生還原糖,進而降解為乳酸、乙酸等小分子有機酸和氨氮等物質(zhì);同時還保存有一定量能被產(chǎn)甲烷菌菌群直接利用的可溶性糖等組分,很容易被消化代謝轉(zhuǎn)化為CH4,使得消化第1 天即出現(xiàn)產(chǎn)氣高峰。消化反應(yīng)第5 天時,底物中較難降解的纖維素和半纖維素等大分子物質(zhì)經(jīng)厚壁桿菌和擬桿菌等微生物水解、酸化,進而轉(zhuǎn)化為更多能夠被產(chǎn)甲烷菌群利用的小分子底物,從而出現(xiàn)第2 個產(chǎn)氣峰值。隨著消化反應(yīng)持續(xù),能被產(chǎn)甲烷菌群利用的營養(yǎng)物質(zhì)開始減少,第6 天開始日產(chǎn)甲烷量快速降低直至反應(yīng)結(jié)束。PC 組的日產(chǎn)甲烷潛力明顯高于其他添加劑,累計產(chǎn)甲烷量最高且較未青貯CK 組提高30.13%。這與該組較低的木質(zhì)素含量和較高的WSC、CP 以及有機酸含量等青貯質(zhì)量指標密切相關(guān),也印證了菌酶聯(lián)合強化青貯甜高粱對其產(chǎn)甲烷能力的促進效果更為顯著。此外,青貯后甜高粱的生物降解指數(shù)明顯增加,尤其PC 組顯著優(yōu)于其他青貯組。說明青貯過程能夠提升纖維素、半纖維素的降解率,降低抗降解屏障組分含量;也進一步證實菌酶聯(lián)合強化青貯預(yù)處理能改善高粱的生物降解性能,促進厭氧消化產(chǎn)甲烷效能。

利用修正Gompertz 模型對產(chǎn)甲烷過程進行擬合,確定產(chǎn)甲烷動力學(xué)常數(shù),模擬發(fā)酵動態(tài)過程得到最大甲烷累計產(chǎn)量(Ym)、最大產(chǎn)甲烷速率(Rm)、遲滯期(λ)和R2等參數(shù)。λ值能直接反映消化系統(tǒng)啟動速度,間接反映產(chǎn)甲烷菌群增殖狀況[33]。與原料組相比,4 個青貯消化組的λ 值明顯縮短并且Ym和Rm均顯著提高,說明青貯預(yù)處理能夠提高消化反應(yīng)啟動速率,尤其PC 組的遲滯期最短以及Pa 組Rm提升最大,這不僅與圖1 的產(chǎn)氣特征相吻合,也進一步證明添加異常畢赤酵母進行青貯預(yù)處理能有效提高厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的產(chǎn)氣速率。

厭氧消化體系pH 直接影響細胞質(zhì)膜滲透性、穩(wěn)定性、營養(yǎng)物質(zhì)溶解性,進而影響微生物代謝過程和途徑;化學(xué)需氧量(COD)主要源自大分子有機物在水解、酸化階段轉(zhuǎn)化而成的溶解性有機物,是表征消化體系中能量多寡的重要指標;氨氮主要以游離氨或銨鹽形式存在,氨氮濃度低于1700 mg·L-1時有利于產(chǎn)甲烷菌的繁殖,能有效提高緩沖能力和穩(wěn)定性[3]。在厭氧消化第1 天,青貯甜高粱中大分子有機物被快速水解酸化,總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)累積pH 迅速下降。隨后產(chǎn)甲烷菌群能快速消化體系中的水溶性有機質(zhì),TVFA 被逐漸消耗轉(zhuǎn)化為甲烷,pH 有所升高,COD 濃度降幅加快,這與產(chǎn)甲烷趨勢相吻合。10 d 后,pH 基本保持穩(wěn)定在7.90～8.10,COD濃度維持在900～1100 mg·L-1,水解酸化反應(yīng)與TVFA消耗逐漸趨于平衡,對應(yīng)的產(chǎn)甲烷量進入平穩(wěn)期。在整個厭氧發(fā)酵過程中,氨氮含量波動在1600 mg·L-1左右,這是造成厭氧發(fā)酵環(huán)境呈弱堿性的原因之一。同時,揮發(fā)性酸堿度/碳酸氫鹽堿度(IA/BA)為0.3～0.5,表明消化系統(tǒng)運行20 d 一直處于穩(wěn)定狀態(tài)并且緩沖能力較高。因此,青貯預(yù)處理能為產(chǎn)甲烷菌群提供充足代謝底物(如揮發(fā)性脂肪酸)和適宜發(fā)酵環(huán)境(pH＜8.0),確保系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

3.3 添加劑對青貯甜高粱厭氧消化微生物群落的影響

在甜高粱青貯中加入生物強化劑作為厭氧消化產(chǎn)甲烷的預(yù)處理,本質(zhì)上是利用生物強化劑提高青貯發(fā)酵品質(zhì),有效保存厭氧消化所需的營養(yǎng)物質(zhì)的同時優(yōu)化重組青貯甜高粱的木質(zhì)纖維組分,了解生物強化劑對厭氧消化系統(tǒng)內(nèi)和木質(zhì)纖維素降解有關(guān)的功能菌群的影響是至關(guān)重要的。通過高通量測序技術(shù)分別對接種物、青貯前后的甜高粱厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷的發(fā)酵液進行微生物群落分析。在細菌群落變化方面,5 個消化組的厚壁菌門Firmicutes 和擬桿菌門Bacteroidetes 豐度之和在反應(yīng)啟動后明顯增加并始終占據(jù)絕對優(yōu)勢,這與張蕾等[41]研究結(jié)果一致,Li等[31]研究結(jié)果也顯示厚壁菌門和擬桿菌門是秸稈消化過程主要的水解酸化菌。厚壁菌對纖維類物質(zhì)的底物有較強的降解能力,隨著厭氧發(fā)酵的進行,木質(zhì)纖維素類物質(zhì)因降解而含量降低,導(dǎo)致該門細菌也會因生長繁殖所需的底物缺乏,從而導(dǎo)致豐富度降低;擬桿菌門有降解大分子碳水化合物產(chǎn)酸功能[42]。互養(yǎng)菌門豐度占比增加,這是因為互養(yǎng)菌門富集有利于與厭氧發(fā)酵體系中的氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌構(gòu)建良好的互營合作,可將長鏈脂肪酸降解生成乙酸、丙酸等有機酸;并且是極端厭氧互養(yǎng)產(chǎn)乙酸菌,同時與甲烷菌呈共養(yǎng)關(guān)系,將丁酸鹽轉(zhuǎn)化為甲烷和二氧化碳[43]。這3 個門下的微生物在甲烷發(fā)酵系統(tǒng)水解酸化過程中發(fā)揮極為重要的作用,尤其對木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)具有較好的降解性能,在發(fā)酵系統(tǒng)中能成為優(yōu)勢菌屬。隨著反應(yīng)進行,厚壁菌、擬桿菌和互養(yǎng)菌豐度之和均呈現(xiàn)“先增后減”趨勢,不難推斷消化體系中的細菌代謝能力旺盛,有效促進了乙酸代謝,這也可能是日產(chǎn)氣量呈雙峰趨勢的原因之一。而PC 組在第1 天3 類細菌豐度之和即達到最高值且遠高于其他處理組,這與其日產(chǎn)甲烷量始終高于其他處理組、生物降解指數(shù)最高以及其產(chǎn)甲烷動力學(xué)擬合參數(shù)中遲滯期最短的結(jié)果均吻合。此外,纖維桿菌主要水解木質(zhì)纖維類物質(zhì);變形菌可將蛋白質(zhì)和多糖分解成短鏈脂肪酸并為甲烷生成提供必要底物;軟壁菌門可以降解結(jié)構(gòu)碳水化合物;ε-變形菌門來源于變形菌門,可以利用NO3-N 作為電子受體進行厭氧呼吸;念珠菌門公認的水解發(fā)酵細菌,其相對豐度在厭氧發(fā)酵前期顯著增長[42,44-45]。可以看出以青貯甜高粱為底物進行的厭氧發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi),在以優(yōu)勢的厚壁菌門和擬桿菌門的水解酸化菌為主的體系中,同時富集其他微生物,這些細菌門均是以在纖維類為底物的厭氧消化體系中常見的細菌門,主要負責(zé)纖維素的水解酸化等過程。

從細菌屬水平角度看,梭狀芽孢桿菌屬是厭氧消化系統(tǒng)中降解木質(zhì)纖維素的水解細菌,能分泌多酶復(fù)合體,有助于植物細胞壁降解[46]。發(fā)酵單胞菌相對豐度先上升后下降;魯氏絲狀桿菌屬和梭菌DMER64屬在第5 天時的相對豐度明顯高于發(fā)酵初期,這幾種細菌的動態(tài)變化與產(chǎn)甲烷趨勢基本吻合,也是產(chǎn)氣遲滯期大幅縮短的原因之一。魯氏絲狀桿菌屬能將小分子碳源和半纖維素分解為小分子酸和酯,以提供微生物生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)[47]。DMER64不僅能直接參與菌種間電子傳遞,促進電子從產(chǎn)酸菌轉(zhuǎn)移到產(chǎn)甲烷菌,從而提高產(chǎn)甲烷速率;還能在發(fā)酵系統(tǒng)中利用乙酸和乳酸產(chǎn)生氫氣[48]。此外,消化體系還有少量沉積菌屬(2%～3%)和葡萄球菌屬(0.3%～4.6%),其中沉積菌屬能以氨基酸為底物生長繁殖,葡萄球菌能分解糖和蛋白質(zhì)產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸、乙醇、二氧化碳和氫氣[49]?？傊?豐富的水解酸化細菌為青貯甜高粱的厭氧消化反應(yīng)順利進行提供了保障。

從古菌角度看,本試驗結(jié)果與李海紅等[42]報道的厭氧消化過程中產(chǎn)甲烷古菌種類較為單一的結(jié)論相吻合。添加劑預(yù)處理促進了乙酸營養(yǎng)型甲烷菌(甲烷八疊球菌屬和甲烷鬃菌屬)、氫營養(yǎng)型甲烷菌(嗜溫古菌、甲烷桿菌屬和甲烷粒菌屬)以及甲基營養(yǎng)型甲烷菌(甲烷球菌屬)的生長。一般而言,他們利用H2和CO2通過古菌的Wood-Ljungdahl pathway(WLP)和甲基CoM 還原的甲基分枝生成甲烷[45]。其中,甲烷八疊球菌屬和甲烷鬃菌屬能將甲基部分從甲醇或甲胺轉(zhuǎn)移形成甲基輔酶M 作為產(chǎn)甲烷的重要中間體,同時也是僅以乙酸為代謝物,終產(chǎn)物均為甲烷的菌屬[42]。嗜溫古菌和甲烷粒菌屬能利用甲酸鹽和H2/CO2作為CH4生產(chǎn)底物[50]。另外,甲烷鬃菌屬具有較強的產(chǎn)甲烷能力[51],這是PC 組甲烷產(chǎn)量顯著提升的原因之一。雖然生物強化劑不能使甜高粱厭氧發(fā)酵系統(tǒng)古細菌群落組成發(fā)生變化,但可以改變其古菌群落的結(jié)構(gòu)。

厭氧消化系統(tǒng)中的微生物群落均與pH、COD和TVFA 等發(fā)酵參數(shù)密切相關(guān)。細菌屬水平中8 種細菌與pH 呈負相關(guān),與COD、TVFA 呈正相關(guān)。其中,Rikenellaceae_RC9_gut_group屬于 Rikenellaceae,已被報道是一種纖維降解相關(guān)細菌[46];Wang 等[52]研究發(fā)現(xiàn)羅姆布茨菌屬可以利用單糖、二糖等糖類物質(zhì)進行消化,其發(fā)酵產(chǎn)物主要為乙酸和乙醇;Paeniclostridium是一種具有高效分解木質(zhì)纖維素能力的細菌[47]。由此,這8 種細菌均為水解產(chǎn)酸細菌,能將大分子有機物分解為揮發(fā)性有機酸,從而影響消化體系pH,并且促進乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的活性[30,53]。另一方面,6 種細菌豐度與pH 呈正相關(guān),與COD 和TVFA 含量呈負相關(guān)。其中,鈣原桿菌屬和瘤胃梭菌屬能產(chǎn)生耐高溫的木聚糖酶和纖維素降解酶,將秸稈中大分子有機物水解為乙酸、H2和CO2等,從而促進氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌活性和CO2/H2產(chǎn)甲烷途徑[54]。氨氮與硫代單胞菌屬呈正相關(guān)關(guān)系,這與Guan 等[55]報道的硫代單胞菌屬可以利用硝酸鹽作為厭氧污泥中的電子受體,與產(chǎn)甲烷菌直接進行電子傳遞,從而提高產(chǎn)甲烷效率的結(jié)果相吻合。古菌屬水平上,甲烷八疊球菌與COD 和TVFA 呈負相關(guān),與pH 呈正相關(guān)。甲烷八疊球菌主要利用乙酸產(chǎn)甲烷且在乙酸濃度較高時更易成為優(yōu)勢菌[42],本試驗以乙酸營養(yǎng)型代謝途徑為主來生產(chǎn)甲烷。

4 結(jié)論

纖維素酶和異常畢赤酵母均可以作為甜高粱強化青貯預(yù)處理的添加劑,無論是單獨添加其中之一或是二者聯(lián)合添加,均能顯著提高青貯甜高粱的發(fā)酵品質(zhì),有效破壞木質(zhì)纖維組分以及降低木質(zhì)素含量,縮短厭氧消化產(chǎn)甲烷過程遲滯期,促進甜高粱產(chǎn)甲烷潛力釋放,實現(xiàn)其高效甲烷化利用。究其本質(zhì),異常畢赤酵母在青貯過程中不僅可以抑制部分腐敗微生物的生長繁殖,有效保存厭氧消化所需要的營養(yǎng)物質(zhì),同時還可以優(yōu)化重組青貯甜高粱的木質(zhì)纖維組分。在甜高粱青貯中添加生物強化劑的預(yù)處理不僅促進了厚壁菌門、擬桿菌門以及甲烷八疊球菌優(yōu)勢細菌等微生物菌群在消化過程中協(xié)同演變,同時豐富的水解酸化細菌為青貯甜高粱的厭氧消化反應(yīng)順利進行提供了保障,產(chǎn)甲烷菌的富集對青貯甜高粱的產(chǎn)甲烷潛力釋放起到積極調(diào)控作用。總之,從青貯質(zhì)量、產(chǎn)甲烷效能和經(jīng)濟成本等角度綜合考慮,推薦實際生產(chǎn)中選擇異常畢赤酵母作為青貯預(yù)處理的生物添加劑,該添加劑兼具成本收益和預(yù)處理高效的雙重優(yōu)勢。