• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    熒光PCR探針熔解曲線技術(shù)檢測(cè)痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥性的研究

    2023-11-23 10:52:42王嫩寒趙琰楓田麗麗陳雙雙陳昊任怡宣李傳友代小偉
    實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志 2023年20期
    關(guān)鍵詞:異煙肼結(jié)核位點(diǎn)

    王嫩寒 趙琰楓 田麗麗 陳雙雙 陳昊 任怡宣 李傳友 代小偉

    北京市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室(北京 100035)

    異煙肼是重要的抗結(jié)核藥物[1]。目前,由于沒(méi)有耐受性良好的抗結(jié)核藥物出現(xiàn),異煙肼仍作為重要的一線抗結(jié)核藥物在使用[2]。異煙肼被結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)的過(guò)氧化氫-過(guò)氧化物酶KatG過(guò)氧化活化為異煙堿?;杂苫梢耘c烯?;€原酶-NAD復(fù)合體(MTB細(xì)胞壁的主要成分——分枝菌酸的生化合成途徑中的關(guān)鍵成分)相結(jié)合,從而抑制其活性,最終通過(guò)影響MTB細(xì)胞壁的正常合成途徑,使MTB喪失增殖等功能而達(dá)到抑菌的目的[3-4]。2018年,WHO的一份研究報(bào)道,據(jù)估計(jì),全世界約8%的結(jié)核病患者為異煙肼耐藥結(jié)核?。?]。2020年,全球結(jié)核病報(bào)告中指出,在活動(dòng)性肺結(jié)核患者中,異煙肼耐藥肺結(jié)核占15%,需盡快發(fā)現(xiàn)這部分患者,并選擇合適的替代治療方案[6]。然而,異煙肼耐藥比單利福平耐藥更常見(jiàn),并可能嚴(yán)重影響抗結(jié)核治療[7]。

    傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)建立在患者標(biāo)本培養(yǎng)陽(yáng)性的基礎(chǔ)上,耗時(shí)長(zhǎng),易延誤治療。近年來(lái),利用分子生物學(xué)方法檢測(cè)耐藥的技術(shù)迅速發(fā)展,但大多選擇菌株進(jìn)行檢測(cè),時(shí)效性較差。若能直接檢測(cè)患者標(biāo)本,則能及時(shí)得到藥敏結(jié)果,為患者制定個(gè)體化治療方案贏取寶貴時(shí)間。本研究應(yīng)用MeltPro技術(shù)對(duì)痰標(biāo)本直接進(jìn)行MTB異煙肼耐藥檢測(cè),評(píng)價(jià)該方法直接對(duì)肺結(jié)核患者痰標(biāo)本進(jìn)行MTB異煙肼耐藥篩查的應(yīng)用價(jià)值。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料收集2021年5月至2022年5月在北京市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病門診就診的初治肺結(jié)核患者痰標(biāo)本,納入標(biāo)準(zhǔn):(1)GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果MTB陽(yáng)性;(2)痰標(biāo)本量> 3 mL。對(duì)收集到的痰標(biāo)本進(jìn)行涂片鏡檢及分枝桿菌分離培養(yǎng),培養(yǎng)陽(yáng)性菌株進(jìn)行異煙肼比例法藥敏檢測(cè);用MeltPro技術(shù)及Hain試驗(yàn)對(duì)痰標(biāo)本直接進(jìn)行MTB異煙肼耐藥檢測(cè)。

    1.2 檢測(cè)方法

    1.2.1 涂片鏡檢按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[8],選取適量痰標(biāo)本進(jìn)行涂片,隨后進(jìn)行萋-尼氏抗酸染色(染液由珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)),100倍油鏡下進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分級(jí),即“陰性”、“1 ~ 8條/300視野”、“1+”、“2+”、“3+”、“4+”。

    1.2.2 分枝桿菌分離培養(yǎng)按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》,吸取1 nL痰標(biāo)本放入前處理管中,加入1 ~ 2倍體積4% NaOH,旋緊處理管螺旋蓋,震蕩混勻,使痰標(biāo)本充分液化,室溫下靜置15 min后,均勻接種于酸性羅氏培養(yǎng)基(河南賽諾特生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))上,每支0.1 ~ 0.15 mL,旋緊螺旋蓋,在(36 ± 1)℃孵育,直至長(zhǎng)出可視菌落,記錄生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)8周無(wú)菌落生長(zhǎng)者報(bào)告“陰性”。

    1.2.3 結(jié)核分枝桿菌比例法藥敏試驗(yàn)參照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》的結(jié)核分枝桿菌固體藥敏試驗(yàn)操作,使用細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀BAC spreader 1100C(廣東希格生物科技有限公司)、中性羅氏培養(yǎng)基、含藥培養(yǎng)基(異煙肼,0.2 μg/nL),對(duì)培養(yǎng)陽(yáng)性菌株進(jìn)行異煙肼比例法藥敏試驗(yàn),同時(shí)用對(duì)硝基苯甲酸/噻吩-2羥酸肼(PNB/TCH)培養(yǎng)基鑒定是否為結(jié)核分枝桿菌。所用培養(yǎng)基均由河南賽諾特生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。TCH培養(yǎng)基上有菌落生長(zhǎng),PNB培養(yǎng)基上無(wú)菌落生長(zhǎng)者為結(jié)核分枝桿菌;PNB培養(yǎng)基上有菌落生長(zhǎng),TCH培養(yǎng)基上無(wú)菌落生長(zhǎng)者為非結(jié)核分枝桿菌。耐藥百分比(%)=含藥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)/對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)×100%。若耐藥百分比> 1%,則認(rèn)為受試菌對(duì)該藥耐藥。

    1.2.4 MeltPro技術(shù)耐藥檢測(cè)使用廈門致善生物科技股份有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌耐藥試劑盒,以及SLAN-96S Real-Time PCR System(上海宏石醫(yī)療科技有限公司)進(jìn)行MTB異煙肼耐藥檢測(cè)及結(jié)果分析。吸取1 mL痰標(biāo)本加入到50 mL圓底離心管內(nèi),再加入1 ~ 2 mL前處理液(NALC-NaOH),室溫下震蕩混勻15 min,加入40 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)中和離心(3 000 ×g離心18 min),棄上清,加1 mL的PBS進(jìn)行重懸沉淀,10 000 ×g離心1 min,棄上清。在沉淀中加入300 μL試劑盒中提供的TB-DNA提取液,90 ℃加熱10 min,10 000 ×g離心1 min,吸取上清液,得到結(jié)核分枝桿菌DNA。按說(shuō)明書要求配置PCR反應(yīng)液,在20 μL反應(yīng)液中加入5 μL結(jié)核分枝桿菌DNA,使用SLAN-96S Real-Time PCR System進(jìn)行MTB異煙肼的耐藥檢測(cè)及結(jié)果分析,反應(yīng)程序參照說(shuō)明書。通過(guò)比較所檢測(cè)樣本與陽(yáng)性對(duì)照樣本之間熔解曲線熔點(diǎn)(Tm)值的差異判斷樣本是否發(fā)生突變:樣本的熔點(diǎn)與陽(yáng)性對(duì)照的熔點(diǎn)一致,誤差不超過(guò)1 ℃時(shí),判定為野生型,待檢樣本對(duì)所檢測(cè)藥物敏感;樣本的熔點(diǎn)低于陽(yáng)性對(duì)照2 ℃及以上時(shí)(ΔTm≥ 2 ℃),判定為突變型,待檢樣本對(duì)所測(cè)藥物耐藥。若結(jié)果為結(jié)核分枝桿菌未檢出或耐藥不明確,則檢測(cè)不成功,需重復(fù)檢測(cè)。

    1.2.5 Hain試驗(yàn)用德國(guó)海因生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及耐藥基因突變檢測(cè)試劑盒(PCR-線性雜交酶顯色法)試劑盒以及生物梅里埃公司的GT-Biot48結(jié)核分枝桿菌耐藥快速檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行Hain試驗(yàn)。將方法4中提取的結(jié)核分枝桿菌DNA 5 μL加入45 μL擴(kuò)增混合物中,按照說(shuō)明書的擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后取20 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交,雜交過(guò)程包括化學(xué)變性、雜交孵育、洗滌、偶聯(lián)和顯色等。根據(jù)顯色結(jié)果進(jìn)行耐藥情況的判讀。判讀標(biāo)準(zhǔn):所有野生條帶均顯色且突變條帶無(wú)顯色時(shí)為敏感;野生條帶缺失不顯色或突變條帶顯色為耐藥。

    1.2.6 GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)儀及試劑盒由美國(guó)賽沛公司生產(chǎn)。按照GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)說(shuō)明書要求操作,取1 nL痰標(biāo)本置于螺旋蓋前處理管中,加入2倍體積的檢測(cè)樣品試劑,旋緊前處理管,室溫下振蕩混勻15 min,使痰標(biāo)本充分液化,打開(kāi)檢測(cè)匣,取2 mL處理后的樣品,由加樣孔緩慢加入檢測(cè)匣中,放置到檢測(cè)模塊,儀器開(kāi)始自動(dòng)化檢測(cè)。該技術(shù)針對(duì)rpoB基因81 bp利福平耐藥核心區(qū)間(RRDR)設(shè)計(jì)引物和探針,檢測(cè)其是否發(fā)生突變,用于輔助診斷是否為結(jié)核分枝桿菌,以及是否對(duì)利福平耐藥?;跇颖局蠱TB的Ct值,MTB結(jié)果以高、中、低和極低顯示,Ct值 < 16為MTB含量高,Ct值在16 ~22之間為MTB含量中等,Ct值在22 ~ 28之間為MTB含量低,Ct值 > 28為MTB含量極低。

    1.3 質(zhì)量控制按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》相關(guān)規(guī)定,完成涂片鏡檢及分枝桿菌分離培養(yǎng)的質(zhì)量評(píng)估,項(xiàng)目質(zhì)量合格。藥敏試驗(yàn)所用培養(yǎng)基均用標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv進(jìn)行含藥培養(yǎng)基質(zhì)量控制。實(shí)驗(yàn)室每年參加中國(guó)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室組織的藥敏試驗(yàn)熟練度測(cè)試,成績(jī)優(yōu)秀。MeltPro技術(shù)耐藥性檢測(cè)選用含有相應(yīng)野生型靶擴(kuò)增基因的質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照,既完成了結(jié)果的判讀,又保證了檢測(cè)的質(zhì)量。每次Hain試驗(yàn)都用標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv與其他標(biāo)本一起完成檢測(cè)。每個(gè)測(cè)試條都包含5個(gè)質(zhì)控條帶:(1)標(biāo)記物質(zhì)控帶:用于確認(rèn)探針試紙條上的標(biāo)記物結(jié)合情況及正確的顯色反應(yīng);(2)擴(kuò)增質(zhì)控帶:用于確認(rèn)PCR擴(kuò)增反應(yīng)是否成功;(3)3個(gè)基因位點(diǎn)質(zhì)控帶,用于確認(rèn)每個(gè)基因位點(diǎn)反應(yīng)的最佳敏感度。GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)每個(gè)檢測(cè)匣包括樣本處理質(zhì)控(SPC),確保樣品經(jīng)過(guò)正確處理;以及探針檢查質(zhì)控(PCC),保證探針檢查合格。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料呈偏態(tài)分布時(shí)以[M(Q1,Q3)]描述,計(jì)數(shù)資料以“例數(shù)”和“百分率/構(gòu)成比(%)”描述,采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法及Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異的比較,以P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以比例法藥敏結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算MeltPro技術(shù)檢測(cè)異煙肼的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和Kappa值。Kappa值用于一致性檢測(cè),0 ~ 0.2為一致性極低,0.21 ~ 0.4為一致性一般,0.41 ~ 0.60為中等一致,0.61 ~ 0.80為基本一致,0.81 ~ 1.00為幾乎完全一致。

    2 結(jié)果

    2.1 一般情況本研究共收集157例MTB陽(yáng)性痰標(biāo)本,其中男115(73.2%)例,女42(26.8%)例。年齡范圍16 ~ 88歲,年齡中位數(shù)(四分位)為46(31,64)歲。157例MTB陽(yáng)性的痰標(biāo)本,經(jīng)分枝桿菌分離培養(yǎng),獲得陽(yáng)性菌株130株,培養(yǎng)陽(yáng)性率為82.8%(130/157)。培養(yǎng)陰性19例,污染8例。污染率為5.1%(8/157)。130株陽(yáng)性菌株均進(jìn)行了比例法異煙肼藥敏試驗(yàn)。用MeltPro技術(shù)進(jìn)行異煙肼耐藥篩查,檢測(cè)成功132例,失敗25例,檢測(cè)成功率為84.1%(132/157)。Hain試驗(yàn)異煙肼耐藥檢測(cè)成功125例,失敗32例,檢測(cè)成功率為79.6%(125/157)。同時(shí)有MeltPro技術(shù)異煙肼耐藥檢測(cè)和比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果的115例;同時(shí)有Hain試驗(yàn)異煙肼耐藥檢測(cè)和比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果的109例。在27例培養(yǎng)陰性的標(biāo)本中,MeltPro技術(shù)檢測(cè)MTB異煙肼耐藥基因突變9例,敏感8例,檢測(cè)不成功10例。見(jiàn)圖1。

    圖1 標(biāo)本檢測(cè)情況Fig.1 Sample testing process

    2.2 痰標(biāo)本荷菌量對(duì)MeltPro技術(shù)耐藥檢測(cè)的影響157例MTB陽(yáng)性的痰標(biāo)本中,MeltPro技術(shù)異煙肼耐藥檢測(cè)成功的比例隨著痰涂片結(jié)果等級(jí)的升高而升高,各等級(jí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=24.169,P= 0.000)。見(jiàn)表1。檢測(cè)成功率也隨著GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌等級(jí)的升高而升高,各等級(jí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H= 27.763,P= 0.000),見(jiàn)表2。

    表1 痰涂片不同等級(jí)與MeltPro技術(shù)異煙肼耐藥檢測(cè)成功的關(guān)系Tab.1 The relationship between different grades of sputum smear and the success of Isoniazid resistance detection by MeltPro technique例(%)

    表2 GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)MTB不同等級(jí)與MeltPro技術(shù)異煙肼耐藥檢測(cè)的關(guān)系Tab.2 The relationship between the different grades of MTB detected by GeneXpert MTB/RIF and the detection of Isoniazid resistance by MeltPro technique例(%)

    2.3 MeltPro技術(shù)異煙肼耐藥基因突變的檢測(cè)效能MeltPro技術(shù)的異煙肼耐藥檢出率為22.0%(29/132),Hain試驗(yàn)的異煙肼耐藥檢出率為15.3%(19/124),比例法的異煙肼耐藥檢出率為14.6%(19/130),三者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 2.997,P= 0.223)。

    以比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo),MeltPro技術(shù)檢測(cè)異煙肼耐藥的靈敏度為84.6%(11/13),特異度為91.2%(93/102),陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為55%(11/20),陰性預(yù)測(cè)值為97.9%(93/95),MeltPro技術(shù)檢測(cè)異煙肼耐藥與比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致性Kappa值0.614,為基本一致。見(jiàn)表3。

    表3 MeltPro技術(shù)和Hain 試驗(yàn)檢測(cè)異煙肼耐藥性的效能Tab.3 Efficacy of MeltPro technique and Hain test in detecting Isoniazid resistance

    2.4 異煙肼耐藥基因突變情況157例(份)標(biāo)本中,MeltPro技術(shù)檢測(cè)異煙肼耐藥基因突變29例,Hain試驗(yàn)檢測(cè)異煙肼耐藥基因突變19例,具體突變位點(diǎn)見(jiàn)表4。異煙肼耐藥基因突變而比例法藥敏結(jié)果敏感的12例,耐藥基因無(wú)突變而比例法藥敏結(jié)果耐藥的7例。

    表4 異煙肼耐藥突變位點(diǎn)及藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Isoniazid resistance mutation site and drug sensitivity test results

    3 討論

    表型藥敏試驗(yàn)包括固體藥敏和液體藥敏(MGIT960藥敏試驗(yàn)和優(yōu)化肉湯微孔板法藥敏試驗(yàn))。固體藥敏試驗(yàn)需4周以上得到藥敏結(jié)果,液體藥敏試驗(yàn)也需要7 ~ 21 d才能得到結(jié)果,耗時(shí)均較長(zhǎng)[9]。MeltPro技術(shù)是一種快速檢測(cè)耐藥基因突變的方法,檢測(cè)利福平和異煙肼耐藥的試劑平均成本約200元/人份,耗時(shí)約3 h。大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。2008年,WHO推薦使用第一代線性探針技術(shù)進(jìn)行快速耐多藥診斷[10]。Hain試驗(yàn)可同時(shí)檢測(cè)異煙肼和利福平耐藥情況,試劑平均成本約230元/人份,檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)約6 h。與之相比,MeltPro技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)異煙肼、利福平、氟喹諾酮類藥物、鏈霉素及乙胺丁醇的耐藥情況,能更快篩查出MDR-TB及Pre-XDR-TB。為臨床醫(yī)生因人施治提供依據(jù)。

    本研究選用157例MTB陽(yáng)性的痰標(biāo)本進(jìn)行MeltPro耐藥檢測(cè),涂片陰性痰標(biāo)本檢測(cè)成功率64.8%,涂片1 ~ 8條/300視野痰標(biāo)本檢測(cè)成功率89.5%,涂片“1+”痰標(biāo)本檢測(cè)成功率89.7%,涂片“2+”痰標(biāo)本檢測(cè)成功率96.9%,涂片“3+”及“4+”痰標(biāo)本檢測(cè)成功率均100%,隨著涂片陽(yáng)性等級(jí)升高,檢測(cè)成功的比例相應(yīng)升高。涂片陽(yáng)性痰標(biāo)本檢測(cè)成功率較高,能獲得可靠的耐藥信息。與趙國(guó)連等[11]報(bào)告的結(jié)果基本一致。因此MeltPro技術(shù)可以直接用于痰標(biāo)本的耐藥檢測(cè)。該比例也隨GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)MTB等級(jí)的升高而升高。結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性等級(jí)達(dá)到“中”和“高”時(shí),檢測(cè)成功率分別為95.8%和96.4%。本實(shí)驗(yàn)采用粗提法從痰標(biāo)本中提取結(jié)核分枝桿菌DNA,操作簡(jiǎn)便快捷,適用于基層實(shí)驗(yàn)室。但粗提法提取效能有限,不能保證DNA純度及濃度,可能會(huì)干擾耐藥檢測(cè)結(jié)果[12]。另外,病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果的敏感性與痰標(biāo)本質(zhì)量密切相關(guān)[13],若能提高痰標(biāo)本質(zhì)量,勢(shì)必能提高M(jìn)eltPro技術(shù)的檢測(cè)效能。

    在本研究中,MeltPro技術(shù)檢測(cè)異煙肼靈敏度為84.6%,特異度91.2%,敏感度高于劉春平等[14]報(bào)道的數(shù)據(jù),特異度稍低(72.9%,100%);與Hain試驗(yàn)相比較,敏感度較高,特異度稍低(55.6%,92.3%);與比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致性比較,kappa0.614,為基本一致。

    本研究中,在27例MTB陽(yáng)性但培養(yǎng)陰性、無(wú)法進(jìn)行傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)的標(biāo)本中,MeltPro技術(shù)檢測(cè)MTB異煙肼耐藥基因突變9例,敏感8例,檢測(cè)不成功10例。提示MeltPro技術(shù)對(duì)痰標(biāo)本直接進(jìn)行檢測(cè),可為培養(yǎng)陰性結(jié)核病患者提供耐藥篩查結(jié)果,彌補(bǔ)了因無(wú)陽(yáng)性菌株造成藥敏結(jié)果缺失的不足。

    本研究中,有些標(biāo)本的分子耐藥檢測(cè)與比例法藥敏結(jié)果不一致,均已進(jìn)行了重復(fù)實(shí)驗(yàn)。MeltPro技術(shù)檢測(cè)異煙肼耐藥與表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果有19例不符,其中基因型檢測(cè)敏感而表型藥敏耐藥的7例,基因型耐藥突變而表型藥敏敏感12例。造成基因型和表型耐藥結(jié)果不符的原因可能有:(1)MeltPro技術(shù)檢測(cè)的基因突變的區(qū)域位點(diǎn)為ahpC啟動(dòng)子區(qū)(-40 ~ -30及-15 ~ 3位點(diǎn)),inhA94密碼子,inhA啟動(dòng)子區(qū)(-17 ~ -8)位點(diǎn)和KatG315密碼子區(qū)。除此之外,已知的異煙肼的耐藥突變位點(diǎn)還有fabGl、kasA、iniA/B/C、ndh、fadE、furA、Rvl592c和Rvl772及其啟動(dòng)子區(qū)等[15]。在KHAN等[16]的研究中,最常見(jiàn)的異煙肼突變位點(diǎn)為katG S315T,其次為fabG1-15C>T(inhA啟動(dòng)子)和inhA-154G>A。另外,CHEN等[17]對(duì)WHO提供的耐藥MTB菌株的數(shù)據(jù)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)雖然91%的異煙肼耐藥菌株存在已知的耐藥位點(diǎn)基因突變,仍有9%的耐藥菌株存在未知的突變位點(diǎn)。所以,造成本研究中出現(xiàn)7例樣本基因型敏感而表型藥敏結(jié)果耐藥的原因可能為存在該方法涵蓋的突變位點(diǎn)之外的耐藥基因突變。(2)根據(jù)說(shuō)明書中的陳述,MeltPro技術(shù)檢測(cè)異煙肼耐藥野生型的檢測(cè)限為2 × 103菌/nL,突變型檢測(cè)限為104菌/nL。本研究采用粗提法提取MTB的DNA,提取效能有限,可能造成核酸濃度低于該方法的檢測(cè)限,未能檢測(cè)到突變位點(diǎn)的存在,導(dǎo)致表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果耐藥而基因型檢測(cè)結(jié)果為敏感。(3)抗菌藥物折點(diǎn)是用來(lái)判斷病原菌對(duì)藥物敏感、中介或耐藥的MIC值[18],多年來(lái),抗結(jié)核藥物的折點(diǎn)幾經(jīng)修訂,目前,中國(guó)和WHO推薦的異煙肼表型耐藥的折點(diǎn)為0.2 μg/mL,CLSI的推薦標(biāo)準(zhǔn)為0.25/1.0 μg/mL。一些耐藥相關(guān)基因會(huì)產(chǎn)生低水平耐藥[19],本研究采用比例法藥敏檢測(cè)為標(biāo)準(zhǔn),異煙肼耐藥培養(yǎng)基只有一個(gè)藥物濃度,可能導(dǎo)致表型耐藥而基因型檢測(cè)敏感。(4)若患者存在敏感菌和耐藥菌的混合感染,通常在培養(yǎng)過(guò)程中,敏感菌生長(zhǎng)優(yōu)于耐藥菌,導(dǎo)致培養(yǎng)物中耐藥菌的比例下降,出現(xiàn)表型結(jié)果假陰性[20]。后續(xù)可對(duì)菌株進(jìn)行MeltPro技術(shù)耐藥篩查,探討異質(zhì)性耐藥對(duì)分子耐藥檢測(cè)和表型藥敏結(jié)果的影響。(5)本研究中,基因型耐藥突變而表型藥敏敏感的比例為9.23%(12/130),龔蘭等[21]研究發(fā)現(xiàn),9.79%的異煙肼敏感結(jié)核分枝桿菌株發(fā)生的katG、inhA基因突變,研究結(jié)果基本一致。本研究采用粗提法提取MTB的DNA,若能提高痰標(biāo)本質(zhì)量,并對(duì)粗提DNA進(jìn)行純化或采用提取效能高的方法或儀器進(jìn)行核酸的提取,可極大提高M(jìn)eltPro技術(shù)的檢測(cè)成功率。再者,對(duì)表型藥敏試驗(yàn)與分子耐藥結(jié)果不符合的標(biāo)本,應(yīng)進(jìn)一步行全基因組測(cè)序等檢測(cè),分析不一致的原因;本研究受經(jīng)費(fèi)和課題時(shí)間的限制,耐藥標(biāo)本收集數(shù)量有限,在后續(xù)條件允許的情況下,將收集更多耐藥痰標(biāo)本進(jìn)行深入研究。

    總體來(lái)說(shuō),對(duì)GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)為MTB的肺結(jié)核患者,直接使用MeltPro技術(shù)對(duì)痰標(biāo)本進(jìn)行異煙肼耐藥篩查具有靈敏度高,特異性強(qiáng),操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn),可縮短檢測(cè)時(shí)間,為臨床提供快速準(zhǔn)確的耐藥結(jié)果。同時(shí),MeltPro技術(shù)對(duì)DNA的濃度及純度有較高要求,若能保證DNA濃度及純度,可以極大提高檢測(cè)的成功率。

    猜你喜歡
    異煙肼結(jié)核位點(diǎn)
    鎳基單晶高溫合金多組元置換的第一性原理研究
    上海金屬(2021年6期)2021-12-02 10:47:20
    CLOCK基因rs4580704多態(tài)性位點(diǎn)與2型糖尿病和睡眠質(zhì)量的相關(guān)性
    異煙肼糖漿劑的制備及穩(wěn)定性研究
    山東化工(2020年20期)2020-11-25 11:29:34
    二項(xiàng)式通項(xiàng)公式在遺傳學(xué)計(jì)算中的運(yùn)用*
    一度浪漫的結(jié)核
    特別健康(2018年4期)2018-07-03 00:38:26
    層次分析模型在結(jié)核疾病預(yù)防控制系統(tǒng)中的應(yīng)用
    gp10基因的原核表達(dá)及其聯(lián)合異煙肼的體外抗結(jié)核菌活性
    對(duì)氨基水楊酸異煙肼在耐多藥結(jié)核病中抑菌效能的觀察
    中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核感染的中醫(yī)辨治思路
    高劑量異煙肼與延長(zhǎng)強(qiáng)化期對(duì)結(jié)核性腦膜炎的療效研究
    婷婷色综合大香蕉| 亚州av有码| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久精品国产自在天天线| 午夜a级毛片| 久久久久久久久久黄片| 欧美一区二区国产精品久久精品| 丝袜美腿在线中文| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲成人久久爱视频| 欧美中文日本在线观看视频| 天堂网av新在线| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 亚洲综合色惰| 嫩草影院新地址| 精品无人区乱码1区二区| 内地一区二区视频在线| 亚洲最大成人中文| 国产一区二区在线观看日韩| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲美女搞黄在线观看 | 麻豆成人av在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 两人在一起打扑克的视频| 久久久国产成人免费| 久久久精品欧美日韩精品| 久久中文看片网| 午夜影院日韩av| 一区二区三区激情视频| 国产黄片美女视频| 国产探花极品一区二区| 日本黄大片高清| 国产真实伦视频高清在线观看 | 欧美成人一区二区免费高清观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 午夜福利高清视频| 亚洲人成伊人成综合网2020| 男插女下体视频免费在线播放| 中亚洲国语对白在线视频| 色在线成人网| 成年女人看的毛片在线观看| 国产三级在线视频| 久久亚洲精品不卡| 天堂√8在线中文| 综合色av麻豆| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲精华国产精华精| 人妻少妇偷人精品九色| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲精品456在线播放app | 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲电影在线观看av| 欧美又色又爽又黄视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 两个人视频免费观看高清| 日韩欧美精品免费久久| 国产视频内射| 国产欧美日韩精品一区二区| 在线a可以看的网站| 久久久久久九九精品二区国产| 日本色播在线视频| av在线天堂中文字幕| 俺也久久电影网| 成年免费大片在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美人与善性xxx| 在线天堂最新版资源| 亚洲 国产 在线| 97超视频在线观看视频| 乱人视频在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 一级黄色大片毛片| 在线天堂最新版资源| 免费看a级黄色片| 精品一区二区免费观看| 亚洲精品国产成人久久av| 夜夜爽天天搞| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产色爽女视频免费观看| 搞女人的毛片| 日本免费一区二区三区高清不卡| 草草在线视频免费看| 精品久久国产蜜桃| 亚洲成人精品中文字幕电影| АⅤ资源中文在线天堂| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 一级av片app| 久久久久久久亚洲中文字幕| 婷婷亚洲欧美| 欧美又色又爽又黄视频| 综合色av麻豆| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产av一区在线观看免费| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲av二区三区四区| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 午夜福利在线观看吧| 人妻少妇偷人精品九色| 久久精品国产亚洲av天美| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 日韩高清综合在线| aaaaa片日本免费| 国产成人影院久久av| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 午夜视频国产福利| 国产 一区精品| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲乱码一区二区免费版| 校园人妻丝袜中文字幕| 在线播放国产精品三级| av.在线天堂| 亚洲自拍偷在线| 国产高清视频在线观看网站| 桃色一区二区三区在线观看| 欧美最新免费一区二区三区| 国产精品三级大全| 99热这里只有精品一区| 人妻夜夜爽99麻豆av| a级毛片免费高清观看在线播放| 在线看三级毛片| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 精品一区二区免费观看| x7x7x7水蜜桃| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产私拍福利视频在线观看| 好男人在线观看高清免费视频| 国产av麻豆久久久久久久| 97碰自拍视频| 深爱激情五月婷婷| 日本三级黄在线观看| 欧美区成人在线视频| 天堂动漫精品| 在线看三级毛片| 免费看光身美女| 国产伦精品一区二区三区视频9| 高清毛片免费观看视频网站| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 高清毛片免费观看视频网站| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久这里只有精品中国| 人妻少妇偷人精品九色| 网址你懂的国产日韩在线| 国产91精品成人一区二区三区| 在现免费观看毛片| 搞女人的毛片| 国产男人的电影天堂91| 在线看三级毛片| 成年版毛片免费区| 国国产精品蜜臀av免费| 国产真实乱freesex| 国产69精品久久久久777片| 国产亚洲av嫩草精品影院| 性色avwww在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 给我免费播放毛片高清在线观看| 成人二区视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 欧美日韩精品成人综合77777| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 亚洲三级黄色毛片| 国产成人一区二区在线| 国产午夜福利久久久久久| 欧美日韩精品成人综合77777| a级毛片a级免费在线| 男人的好看免费观看在线视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 看黄色毛片网站| 免费在线观看影片大全网站| 99热只有精品国产| 69人妻影院| 国产69精品久久久久777片| 国产精品人妻久久久久久| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产精品日韩av在线免费观看| 99riav亚洲国产免费| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美日韩综合久久久久久 | 午夜免费激情av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲最大成人av| 国产成人影院久久av| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 女同久久另类99精品国产91| 中文字幕av成人在线电影| 国产精品爽爽va在线观看网站| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 免费在线观看影片大全网站| 天天躁日日操中文字幕| 日韩欧美在线乱码| 亚洲av免费在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲最大成人av| 黄色丝袜av网址大全| 久久久久久九九精品二区国产| 国产高清有码在线观看视频| 免费人成在线观看视频色| 欧美日韩精品成人综合77777| 在现免费观看毛片| h日本视频在线播放| 九色成人免费人妻av| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 男人舔奶头视频| 亚洲黑人精品在线| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 欧美成人a在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 男女下面进入的视频免费午夜| 99在线视频只有这里精品首页| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 88av欧美| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 精品一区二区三区人妻视频| 国模一区二区三区四区视频| 国内精品一区二区在线观看| 国产一区二区激情短视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 日本欧美国产在线视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 精品久久久久久久久av| av黄色大香蕉| 婷婷色综合大香蕉| 一边摸一边抽搐一进一小说| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美色欧美亚洲另类二区| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲无线观看免费| 中文字幕av成人在线电影| 国产免费av片在线观看野外av| 天天躁日日操中文字幕| 天堂影院成人在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 麻豆国产av国片精品| 国产伦精品一区二区三区四那| 午夜福利在线在线| 制服丝袜大香蕉在线| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产高清激情床上av| 亚洲国产精品成人综合色| 国产在视频线在精品| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 午夜福利高清视频| 俺也久久电影网| 欧美激情国产日韩精品一区| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲三级黄色毛片| 99热只有精品国产| 日韩欧美在线二视频| 国产三级在线视频| 好男人在线观看高清免费视频| 看十八女毛片水多多多| 深爱激情五月婷婷| 中文字幕高清在线视频| 国产精品久久久久久精品电影| 无人区码免费观看不卡| 我的老师免费观看完整版| 亚洲国产精品成人综合色| 少妇的逼水好多| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产精品久久久久久久电影| 69av精品久久久久久| 免费一级毛片在线播放高清视频| 长腿黑丝高跟| 国产又黄又爽又无遮挡在线| av国产免费在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产 | 亚洲国产色片| 动漫黄色视频在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 成年版毛片免费区| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产亚洲精品av在线| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| av在线观看视频网站免费| 麻豆国产av国片精品| 女同久久另类99精品国产91| 一区二区三区免费毛片| 黄色日韩在线| 亚洲精品影视一区二区三区av| 尾随美女入室| 淫秽高清视频在线观看| 久久久久久久久中文| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲av.av天堂| 国产精品久久久久久久久免| 深夜a级毛片| 免费在线观看成人毛片| ponron亚洲| 高清毛片免费观看视频网站| 久久香蕉精品热| 久久6这里有精品| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 淫妇啪啪啪对白视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲av中文av极速乱 | 国产三级在线视频| 桃色一区二区三区在线观看| 国产精品福利在线免费观看| 乱系列少妇在线播放| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 色精品久久人妻99蜜桃| 在线a可以看的网站| 久久久久久久精品吃奶| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲国产精品成人综合色| 国产探花极品一区二区| 亚洲av第一区精品v没综合| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产探花在线观看一区二区| 变态另类丝袜制服| 成人美女网站在线观看视频| 十八禁网站免费在线| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 欧美bdsm另类| 精品午夜福利视频在线观看一区| 美女大奶头视频| 久久精品国产亚洲网站| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产日本99.免费观看| ponron亚洲| av女优亚洲男人天堂| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 欧美在线一区亚洲| 亚洲av二区三区四区| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 欧美日韩国产亚洲二区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产伦在线观看视频一区| 乱人视频在线观看| 亚洲,欧美,日韩| 欧美一区二区亚洲| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 我的女老师完整版在线观看| 午夜久久久久精精品| 黄色女人牲交| 久久精品国产亚洲av天美| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 少妇丰满av| 极品教师在线视频| 欧美bdsm另类| 国产av一区在线观看免费| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 成人亚洲精品av一区二区| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲图色成人| 免费电影在线观看免费观看| 国内精品久久久久精免费| 亚洲av成人av| 欧美潮喷喷水| АⅤ资源中文在线天堂| 赤兔流量卡办理| 欧美性猛交黑人性爽| 中文字幕高清在线视频| 免费大片18禁| 少妇高潮的动态图| 日本 欧美在线| 精品福利观看| 午夜福利在线观看吧| 国产高清不卡午夜福利| 俺也久久电影网| 亚洲国产高清在线一区二区三| 美女cb高潮喷水在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 一级a爱片免费观看的视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 欧美另类亚洲清纯唯美| 免费av毛片视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 我的女老师完整版在线观看| av在线老鸭窝| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲人成网站高清观看| АⅤ资源中文在线天堂| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 中文资源天堂在线| 天美传媒精品一区二区| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲黑人精品在线| 欧美区成人在线视频| 国产精华一区二区三区| 1000部很黄的大片| 国内精品久久久久久久电影| 无遮挡黄片免费观看| 成人二区视频| 久久99热这里只有精品18| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产精品一区二区三区四区久久| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品三级大全| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久6这里有精品| 亚洲av二区三区四区| 国产成人影院久久av| 不卡一级毛片| 亚洲人与动物交配视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 精品久久久久久成人av| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲在线观看片| 成年女人永久免费观看视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲精华国产精华精| 免费观看在线日韩| 国内精品宾馆在线| 亚洲专区国产一区二区| 精品免费久久久久久久清纯| 日本在线视频免费播放| 亚洲专区中文字幕在线| 一个人免费在线观看电影| 国产av麻豆久久久久久久| 国产免费av片在线观看野外av| 嫩草影视91久久| 久久午夜福利片| 久久久久久久久久成人| 国产黄a三级三级三级人| 国产精品伦人一区二区| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲精华国产精华精| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲无线在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 啦啦啦观看免费观看视频高清| 成人特级av手机在线观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产高潮美女av| 桃色一区二区三区在线观看| 热99在线观看视频| 亚洲av成人精品一区久久| 丰满乱子伦码专区| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| av天堂中文字幕网| 简卡轻食公司| 午夜福利18| 久久精品国产亚洲av天美| 国产高清视频在线观看网站| 搡老熟女国产l中国老女人| 日日干狠狠操夜夜爽| 欧美最新免费一区二区三区| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲美女黄片视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 欧美黑人欧美精品刺激| 免费av观看视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲成人免费电影在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| av中文乱码字幕在线| 成熟少妇高潮喷水视频| 波多野结衣高清作品| 午夜日韩欧美国产| av视频在线观看入口| 国产精品久久久久久久电影| 韩国av在线不卡| avwww免费| 九色国产91popny在线| 久久久久久大精品| 亚洲色图av天堂| 久久国内精品自在自线图片| 男人舔奶头视频| 欧美极品一区二区三区四区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲无线观看免费| www.www免费av| 国产爱豆传媒在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 少妇的逼水好多| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 精品一区二区三区人妻视频| 国产单亲对白刺激| 丰满的人妻完整版| 人人妻人人看人人澡| 免费搜索国产男女视频| av在线蜜桃| 国产亚洲欧美98| 99热网站在线观看| 成人精品一区二区免费| 国产精品久久久久久av不卡| 日本免费一区二区三区高清不卡| 成熟少妇高潮喷水视频| 天堂√8在线中文| 一个人看视频在线观看www免费| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久热精品热| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 久久久久久国产a免费观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 国内精品宾馆在线| 国产真实伦视频高清在线观看 | 色吧在线观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| av中文乱码字幕在线| 香蕉av资源在线| 欧美极品一区二区三区四区| 午夜福利在线在线| 乱系列少妇在线播放| 一进一出抽搐gif免费好疼| 一夜夜www| 特级一级黄色大片| 亚洲七黄色美女视频| 波多野结衣巨乳人妻| 久久久久久久午夜电影| 日日夜夜操网爽| 成人三级黄色视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 少妇人妻一区二区三区视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 最好的美女福利视频网| 又爽又黄无遮挡网站| 久久精品国产自在天天线| 99久久成人亚洲精品观看| 大型黄色视频在线免费观看| 日本 欧美在线| 久久香蕉精品热| 亚洲欧美清纯卡通| 一区二区三区激情视频| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 精品久久久久久,| 亚洲一区高清亚洲精品| 精品久久久久久,| 亚洲人与动物交配视频| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 1024手机看黄色片| 1000部很黄的大片| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产高清视频在线播放一区| 午夜爱爱视频在线播放| 色在线成人网| 91麻豆av在线| 香蕉av资源在线| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 少妇的逼好多水| 在线国产一区二区在线| 欧美一区二区亚洲| 亚洲国产精品合色在线| 色播亚洲综合网| av天堂中文字幕网| 午夜精品在线福利| 成人av一区二区三区在线看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲乱码一区二区免费版| 老司机福利观看| 香蕉av资源在线| 欧美最黄视频在线播放免费| 有码 亚洲区| 色5月婷婷丁香| 夜夜爽天天搞| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲国产色片| 午夜福利18| 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产精品人妻久久久影院| 中文字幕高清在线视频| 嫩草影院新地址| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲成人久久爱视频| 国产精品无大码| 九九爱精品视频在线观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 九九在线视频观看精品| 国产精品伦人一区二区| 国产一区二区激情短视频| 国产老妇女一区| 欧美3d第一页| 有码 亚洲区| 欧美日韩综合久久久久久 | 网址你懂的国产日韩在线| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 美女黄网站色视频| 黄色配什么色好看| 国产美女午夜福利| 久久中文看片网| 黄色一级大片看看| 无人区码免费观看不卡| 99热只有精品国产| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 欧美精品国产亚洲| 婷婷精品国产亚洲av| 真人一进一出gif抽搐免费| 男人舔女人下体高潮全视频|