非洲豬瘟診斷技術(shù)研究進展

張華瑩，符樂，王曉芳，王亞文

（河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北保定 071000）

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒感染所有品種和年齡的野豬和家豬的病毒性疾病， 該病的特征是高燒、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)嚴(yán)重出血、高死亡率和高傳染性。 以感染豬發(fā)熱、精神抑郁、食欲不振、便血和鼻出血為主要臨床特征； 以患病豬全身組織器官廣泛性出血和脾臟發(fā)黑、 異常腫大為主要病理變化[1]。 1921 年，非洲肯尼亞首次發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟，隨后，全球多個國家報告了非洲豬瘟疫情。2018 年8 月，中國沈陽市首次發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟，經(jīng)檢驗并確定其流行毒株為基因II 型，與俄羅斯流行的毒株在同一分支[2]。 首次暴發(fā)以來，截止現(xiàn)在， 非洲豬瘟幾乎在我國所有省份和地區(qū)都有發(fā)生， 并對我國的畜牧業(yè)造成了不可挽回的損失。 據(jù)估計，2018 年至2019 年有超過3000 萬頭生豬被撲殺， 給全球生豬生產(chǎn)造成了約20 億美元的經(jīng)濟損失，截止到2022 年，非洲豬瘟造成的損失約為550 億～1300 億美元。

雖然近年來，非洲豬瘟的流行趨勢平緩，但是散發(fā)和亞臨床感染情況仍然存在， 我國的防控形勢依然不容樂觀。 由于沒有特效藥物和疫苗，因此，科學(xué)有效的檢測和早期診斷對于疫情控制至關(guān)重要， 發(fā)現(xiàn)并立即撲殺感染豬以及執(zhí)行嚴(yán)格的生物安全措施是我國目前防控非洲豬瘟的主要措施。 非洲豬瘟的實驗室診斷主要分為兩類，一類為病原學(xué)診斷，主要為病毒和病毒核酸的檢測方法；另一類為血清學(xué)診斷，主要為診斷機體因抗原刺激而產(chǎn)生的抗體或因病毒感染而產(chǎn)生的抗原。 在非洲豬瘟暴發(fā)初期，普遍采用PCR 等病原學(xué)檢測以確診病例[3]。非洲豬瘟的血清學(xué)診斷在疫情監(jiān)測中也起著關(guān)鍵作用，幾種包被p72、p54、p30、p12 等蛋白的ELISA 已被證實可用于非洲豬瘟的流行病學(xué)調(diào)查[4]。 但是當(dāng)血清保存不良或使用血液代替血清時， 這些ELISA 的敏感性可能會降低。在非洲豬瘟呈地方流行趨勢后，特別是弱毒株的出現(xiàn)，加大了非洲豬瘟病毒的檢測難度， 病原學(xué)和血清學(xué)診斷的結(jié)合應(yīng)用對可疑豬只、 隱性感染豬只的確診更加有利。 本文重點討論了非洲豬瘟實驗室診斷技術(shù)的研究進展， 以期為非洲豬瘟的防控工作提供有價值的參考。

1 非洲豬瘟的病原學(xué)診斷

非洲豬瘟因其發(fā)病快、病程短、死亡率高，臨床表現(xiàn)和病理變化與經(jīng)典豬瘟和豬繁殖與呼吸綜合征等豬病相似，主要包括高熱、大面積出血、呼吸和生殖障礙等，使得這三種豬病的鑒別診斷非常困難， 需要通過實驗室診斷進一步區(qū)分[5]。

1.1 病毒的分離與紅細(xì)胞吸附試驗

病毒的分離和紅細(xì)胞吸附試驗是非洲豬瘟活病毒檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”。 該病毒既可以在原代細(xì)胞如：豬外周血單核細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞等中增值， 又可以在傳代細(xì)胞系中增殖。 有研究報道， 非洲豬瘟病毒在肺泡巨噬細(xì)胞中的易感性比外周血單核細(xì)胞高近5 倍。 此外，該病毒可在感染細(xì)胞中產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)和紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象[6]，這是非洲豬瘟病毒感染細(xì)胞特有的現(xiàn)象，其他豬病毒無法引起單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吸附紅細(xì)胞， 因此紅細(xì)胞吸附試驗可用于非洲豬瘟的診斷。 野外采集樣本的質(zhì)量與病毒生存成正相關(guān)， 由于樣本質(zhì)量不佳導(dǎo)致病毒分離難度加大。 還有研究發(fā)現(xiàn)，有些毒株不產(chǎn)生紅細(xì)胞吸附但是可以產(chǎn)生細(xì)胞病變， 導(dǎo)致了出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，同時紅細(xì)胞吸附試驗鑒定過程相對較長，無法滿足臨床的快速診斷。

1.2 病毒核酸檢測

1.2.1 PCR 及qPCR 檢測

病毒核酸檢測是病毒檢測最常用的方法之一，具有特異性良好、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。 非洲豬瘟核酸檢測方法主要包括PCR、熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增。其中PCR 和熒光定量PCR 是實驗室診斷最常用的實驗技術(shù)， 后者的靈敏度更高，速度更快，應(yīng)用也更廣泛。 寶梅英[7]等通過增加探針內(nèi)標(biāo)物及優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了非洲豬瘟病毒雙重?zé)晒馓结楶CR 檢測方法，該方法最低每微升可檢測28 個拷貝，高于PCR 方法40 倍以上，重復(fù)性、穩(wěn)定性和特異性較好，不于其他病毒核酸交叉反應(yīng)。 王彩霞[8]等利用CD2v 基因建立了非洲豬瘟病毒實時熒光PCR 檢測方法，通過條件的優(yōu)化，確定該方法的R2=0.988，最低每微升可檢測到10 個拷貝,且該方法的重復(fù)性和特異性良好， 不于其他豬病發(fā)生交叉反應(yīng)， 為非洲豬瘟病毒檢測提供了新的檢測技術(shù)。

1.2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增是一種新的核酸擴增技術(shù)，具有快速、簡便和高特異性等優(yōu)點，已被廣泛地應(yīng)用于病原微生物檢測和傳染性疾病診斷等領(lǐng)域， 對于疫病的現(xiàn)場診斷具有非常重要的意義。 雖然世界動物衛(wèi)生組織推薦的非洲豬瘟診斷方法是熒光定量PCR， 盡管該技術(shù)已經(jīng)被廣泛驗證，并且是檢測病毒有用工具，但是由于昂貴的儀器和專業(yè)的操作系統(tǒng)，仍然不方便。 另外，還有研究學(xué)者利用p72 基因，設(shè)計了3 對擴增引物和1 條環(huán)介導(dǎo)等溫擴增探針引物， 建立了非洲豬瘟病毒實時熒光的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法，該方法的靈敏度高，并且該方法與OIE 推薦的PCR 方法進行比較，符合率高度一致[9]。

1.2.3 熒光抗體試驗

免疫熒光試驗可分為直接免疫熒光法和間接免疫熒光法，該方法特異性強、敏感性高，相對于紅細(xì)胞吸附試驗，免疫熒光試驗更加省時、方便， 并且可對不能產(chǎn)生紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象的非洲豬瘟病毒進行診斷。 該方法被OIE 列為非洲豬瘟的輔助診斷方法， 用于其他檢測試驗的補充。 免疫熒光試驗需要用熒光素對特異性抗體進行標(biāo)記，但對熒光素的特異性要求較高，非特異性的熒光素染色會造成陽性檢出率增高；并且對于急性ASF 檢出率較高， 對于亞急性和慢性的檢出率較低。 此外，該試驗對檢測人員有較高的技術(shù)要求，結(jié)果判定需要借助熒光顯微鏡，不適用于現(xiàn)場檢測。

2 ASF 的血清學(xué)診斷

2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）主要是依靠包被的抗原或抗體， 抓取待檢樣本中的特異性抗原或抗體， 再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗原或抗體結(jié)合成抗原抗體復(fù)合物， 最后使底物和酶發(fā)生顏色反應(yīng)， 通過測定吸光度值即可對結(jié)果進行判定。 根據(jù)檢測方法的不同可分為間接ELISA[4]、阻斷ELISA[10]和夾心ELISA[11]等。ELISA檢測抗原的方法相對于PCR 檢測方法， 其檢測成本更低、操作便捷、可同時檢測大批量樣本。但是與PCR 相比，ELISA 檢測抗原的方法，特異性較差、靈敏性稍低，易于出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。如果待檢樣品保存不當(dāng)， 如保存溫度較高或保存時間較長均會對結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響。ELISA 抗體檢測方法具有特異性強、 敏感性高、重復(fù)性好和檢測速度相對較快等優(yōu)點， 因此非常適用于 “群體” 檢測和流行病學(xué)調(diào)查， 此外ELISA 也是OIE 推薦的首選血清學(xué)檢測方法。

張文燕[4]等以截短p72 基因作為包被抗原，建立了非洲豬瘟抗體檢測的間接ELISA 方法，經(jīng)過條件的優(yōu)化， 最終確立該方法的包被濃度為每毫升0.5 微克，最佳待檢測血清做1∶100 稀釋，HRP 標(biāo)記的二抗最佳稀釋倍數(shù)為1∶5000，該方法不于其他抗體發(fā)生反應(yīng)， 且該方法與蛋白質(zhì)印跡的檢出率一致， 證明了建立的該方法可在非洲豬瘟的臨床檢測和流行病學(xué)調(diào)查用有極大的應(yīng)用潛力。

2.2 免疫膠體金技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型膜檢測技術(shù)。 膠體金標(biāo)記的特異性抗原或抗體在毛細(xì)作用下，可以在硝酸纖維素膜中移動， 與相應(yīng)的抗體或抗原結(jié)合，從而使膠體金顆粒大量聚集，而呈現(xiàn)出顯色反應(yīng)。 隨著各類新技術(shù)的發(fā)展，免疫膠體金技術(shù)也在不斷更新?lián)Q代，因其操作方法簡便，不需要專業(yè)設(shè)備和人員進行操作、快速、便宜且測試結(jié)果明確等特點在非洲豬瘟的檢測中有廣大的前景。張鑫宇[12]等建立了非洲豬瘟p54 抗體檢測膠體金方法，該方法的靈敏度較高、反應(yīng)時間較短（10 分鐘內(nèi)）。 張麗[13]等通過原核表達、純化獲得了非洲豬瘟病毒p54 蛋白， 制備了膠體金檢測試紙條， 與西班牙INGENASA 公司的試紙條的檢測限敏感性高10 倍。

2.3 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)

化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是基于抗原、抗體免疫反應(yīng)的原理， 結(jié)合化學(xué)發(fā)光而建立的一種免疫分析技術(shù)。 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是以化學(xué)發(fā)光作為指示系統(tǒng)， 使用相關(guān)的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記特異性抗體或抗原， 與待檢樣本特異性結(jié)合，再加入能使發(fā)光物發(fā)光的物質(zhì)，根據(jù)發(fā)光物發(fā)射光的信號強弱判定待檢樣本的濃度[14]?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)具有靈敏度高、檢測范圍廣、反應(yīng)速度快、分析時間短、操作簡單等特點。 憑借其高靈敏度和特異性， 不斷促進對科學(xué)技術(shù)和研究領(lǐng)域的新理解。 現(xiàn)如今，該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到疫病的臨床診斷中，

3 其他檢測技術(shù)

非洲豬瘟因發(fā)病快、傳播廣等特點，已成為當(dāng)今養(yǎng)豬業(yè)的首號威脅者，因此，建立特異、便捷、 快速的檢測方法對于非洲豬瘟的防控工作至關(guān)重要。 該病毒檢測技術(shù)的研究，可以為不同地區(qū)在特定非洲豬瘟疫情流行背景下選擇合適的診斷試劑提供參考， 促使各個領(lǐng)域的檢測技術(shù)迅速進入動物醫(yī)學(xué)行業(yè)。謝青云[15]等為了建立快速、敏感的現(xiàn)場診斷檢測方法，制備了基于量子點微球偶聯(lián)非洲豬瘟p30 蛋白的檢測用探針， 和量子點微球偶聯(lián)的兔抗雞的IgY 質(zhì)控探針，建立量子點免疫試紙條，該試紙條以豬的咽拭子為檢測對象，待檢液做2 倍稀釋，該方法的敏感性較好，且不于其他豬病交叉反應(yīng)，20 分鐘內(nèi)即可完成檢測，最早可在感染后6 天檢測出，為非洲豬瘟的早起診斷提供技術(shù)支持。 另外，岳懷寧[16]等建立了非洲豬瘟重組酶輔助擴增和膠體金試紙條相結(jié)合的可視化檢測方法， 該方法通過反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定在38℃下反應(yīng)20 分鐘即可完成該病的核酸檢測， 并且不與其他豬病發(fā)生交叉反應(yīng)，最低可檢測到48.75 個拷貝的病毒核酸，該方法操作便捷，反應(yīng)時間短，極適合非洲豬瘟的臨床快速診斷。

4 總結(jié)與展望

近期研究報道， 在中國豬體內(nèi)檢測到自然發(fā)生的基因I 型和基因II 型非洲豬瘟重組體，動物試驗也表明了， 這些病毒具有高度致命性和傳染性， 且以基因Ⅱ型病毒為基礎(chǔ)的減毒活疫苗不能對這些重組病毒提供保護， 非洲豬瘟對我國養(yǎng)豬業(yè)造成的危害進一步增大，所以，檢測方法的研究對于非洲豬瘟病毒早期診斷至關(guān)重要。

PCR、 膠體金試紙條、ELISA 等檢測方法雖然方便、快捷，但是不同檢測方法的靈敏度和特異性不同。 國內(nèi)外多位研究學(xué)者報道了ASF 的檢測方法，可以對該病進行有效的鑒別診斷，但是其中多數(shù)檢測方法屬于基礎(chǔ)性研究， 缺乏大量的臨床樣本應(yīng)用， 甚至有的檢測方法對檢測環(huán)境或檢測儀器設(shè)備有較高的要求， 很難在實際應(yīng)用中有效推廣。PCR 及qPCR 檢測方法需要對樣本進行前處理才能進行核酸提取和擴增，整個流程時間較長、 核酸提取和擴增相關(guān)儀器價格昂貴，適合實驗室診斷，不利于現(xiàn)場快速診斷。 ELISA 檢測技術(shù)需要儀器設(shè)備相對較少，檢測時間短， 一次可檢測大量樣本， 適合群體檢測。 但是，因為抗體產(chǎn)生的時間不同，很難通過抗體檢測篩查處于潛伏期的豬只。 膠體金試紙條檢測時間短，適合用于現(xiàn)場檢測，但其敏感性和特異性還需要繼續(xù)優(yōu)化。

本文總結(jié)了非洲豬瘟不同檢測方法， 并對各檢測方法的優(yōu)點和不足進行了總結(jié)。 針對這些存在的問題，未來的研究應(yīng)集中于低成本、工業(yè)化、高通量、高性能等方向，分子學(xué)檢測方法在提高該病的檢測性能方面十分有效， 將分子學(xué)檢測方法與目前免疫學(xué)方法等相結(jié)合可以降低成本、提高檢測通量和靈敏度。 隨著非洲豬瘟不斷傳播及不同毒株的重組， 使得該病毒的危害不斷增強，因此，迫切需要開發(fā)出敏感性高、特異性好，并且適合現(xiàn)場快速診斷檢測方法。

（基金項目： 河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系奶/肉牛綜合試驗推廣站（HBCT2023180406）；河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊保定綜合試驗推廣站（HBCT2023170404））