非洲豬瘟檢測技術(shù)研究進展

魏澤華，韋景平，殷克勇，馬宏偉，張騰帥，梁稼燁，王宏宇，韓慶安

（河北省動物疫病預防控制中心，河北石家莊050035）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是一種感染豬的高度傳染性和高度致死性傳染病。 該病于1921 年首次在肯尼亞報道，之后陸續(xù)在多個國家流行， 并于2018 年首次在我國發(fā)生，給各國養(yǎng)豬行業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。 盡管目前已有很多關(guān)于非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）潛在疫苗株的報道，但尚未有商品化的疫苗可供選擇， 防制ASF 的主要手段仍然是非免疫方法。ASF 在臨床癥狀和病理變化上與經(jīng)典豬瘟（Classical swine fever，CSF）相似，臨床診斷難以區(qū)分。 實驗室檢測可以很容易的區(qū)分ASF 和CSF，而且在感染豬表現(xiàn)出臨床癥狀之前即可檢測到ASFV， 是目前ASF 診斷的主要手段。 ASFV 的檢測方法主要包括病原學方法和血清學方法， 目前最常用的是實時熒光PCR 技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）技術(shù)。 實驗室檢測方法具有快速、靈敏、準確的優(yōu)點，在ASF 的防控、監(jiān)測和疫情處置方面具有重要意義。

1 簡介

ASF 是由ASFV 引起豬的一種急性、高度接觸性傳染病，致死率高，臨診特征以高熱、皮膚發(fā)紺以及內(nèi)臟器官和淋巴結(jié)嚴重出血為主，死亡率可達100%。 ASF 在臨診癥狀和病理變化上與CSF、PRRS、PDNS 等出血性疾病相似，臨診鑒別診斷難度較大，ASF 確診必須借助實驗室手段。 ASFV 病毒分離必須在生物安全三級（Biological Safety Level 3，BSL-3）及以上生物安全實驗室中進行， 低級別生物安全實驗室不具備分離ASFV 的條件，因此基于病毒分離的檢測方法無法廣泛應用。 但是， 作為ASF 確診的必要流程，病毒分離在ASFV 防控工作中仍具有重要意義。 常用的熒光PCR 方法具有較高的靈敏性和特異性， 且能夠檢測出樣品中痕量的病毒基因組。但熒光PCR 相關(guān)的儀器設備價格高昂，對操作人員的專業(yè)水平要求較高， 這限制了該技術(shù)的廣泛應用。 傳統(tǒng)ELISA 方法流程繁瑣、耗時較長。 試紙條化的診斷技術(shù)可以降低對設備的要求，且實驗時間大幅縮短，但其敏感性和準確率可能略低于傳統(tǒng)方法。 在實際應用中，應針對具體情況選擇適宜的診斷方法。

2 病原學診斷技術(shù)

2.1 病毒分離技術(shù)

體外培養(yǎng)時，ASFV 可在豬白細胞、 豬骨髓細胞、PK-15 等豬源傳代細胞和Vero、BHK-21等非豬源傳代細胞上增殖，并引起細胞病變，在感染細胞中可觀察到包涵體。用作ASFV 培養(yǎng)的通常是豬肺泡巨噬細胞， 但細胞制備面臨倫理問題。 有研究表明利用腎源性初代巨噬細胞對ASFV 進行培養(yǎng)也可取得很好的效果，且能夠避免倫理限制。 ASFV 可在雞胚卵黃囊中增殖，并引起雞胚死亡。感染ASFV 的單核細胞或巨噬細胞可以吸附豬紅細胞， 因此可用血細胞吸附試驗鑒別ASFV 感染。熒光抗體試驗亦可作為ASF診斷的一種輔助方法。

2.2 分子生物學診斷技術(shù)

聚合酶鏈式反應 （Polymerase Chain Reaction，PCR）具有特異性強、靈敏度高、操作時間短的優(yōu)點，是目前ASFV 檢測最常用的方法。 常規(guī)PCR 是一種相對經(jīng)典的方法，由于步驟繁瑣、耗時較長， 已逐漸被熒光PCR 代替。 相比于熒光PCR， 常規(guī)PCR 的優(yōu)勢在于可以合成更長的序列， 因此更適用于不同分離株的基因分型。B646L 是編碼p72 蛋白的基因， 對此基因3’末端進行序列分析，可將ASFV 分為24 個基因型，是ASFV 基因分型的主要方法。

實時熒光PCR 比常規(guī)PCR 更省時、操作更簡便、結(jié)果更直觀，各類基于水解探針方法的商品化試劑盒層出不窮。 一種基于水解探針的檢測方法可以將檢出限降低至6.91 copies/reaction，優(yōu)化后的反應時間大約50 分鐘，相較于一般的熒光PCR 方法具有更高的敏感性和更快的檢測速度。 基于SYBR Green I 染料的可視化PCR 方法可以在35℃15 分鐘的條件下檢測ASFV。 此方法的最低檢出限為103copies/μl，根據(jù)反應體系的顏色變化， 實驗人員可以肉眼觀察結(jié)果，降低了對設備的要求。

結(jié)合了重組酶輔助擴增（Recombinase-aided Amplification，RAA）技術(shù)和側(cè)向流試紙條的檢測方法可用于臨床樣本的快速檢測。 此種方法的基本原理是先利用RAA 技術(shù)擴增樣品中的目的基因片段， 此過程中使用的一對引物在5’末端經(jīng)過特殊蛋白的標記。 擴增后的產(chǎn)物作為待檢樣品加入試紙條的樣品槽中， 樣品沿試紙條定向流動， 經(jīng)過一個類似夾心ELISA 方法的反應過程，產(chǎn)生最終結(jié)果。 此種方法適用于經(jīng)煮沸法提取核酸的豬血液樣本， 降低了對設備的需求，減少了工作時間，可用于臨床樣本的現(xiàn)場檢測、大批量樣本的初步篩查等。

借助CRISPR 技術(shù)開發(fā)的ASF 診斷方法具有較高的靈敏度。 經(jīng)過CRISPR RNA 重新編程后，CRISPR-lwCas13a 可以特異性地結(jié)合靶RNA，之后lwCas13a 的側(cè)枝裂解功能被激活，進而降解帶有標記的RNA。 此方法理論上可檢出單拷貝的質(zhì)粒或ASFV 基因組DNA。 基于此方法研制的試紙條適用于檢測病毒載量較低的樣品，最低檢出限可達102copies/微升。

環(huán)介導等溫擴增技術(shù) （Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP） 是用于DNA 擴增的單管技術(shù)， 使用兩套或三套引物和一種具有復制活性、高鏈置換活性珠聚合酶，可在15～60 分鐘，60℃～65℃的恒定溫度下擴增靶序列，是一種更簡便、快速、精確的擴增方法。 該方法無需核酸提取，不依賴精密儀器，可避免因病毒的單個基因突變引起的假陰性問題。

3 血清學檢測技術(shù)

ELISA 方法適用于檢測樣品中的抗原或抗體，目前市場上已有針對ASFV 的商品化試劑盒可供選擇。 影響ELISA 實驗效果的主要因素是包被的抗原或抗體，高特異性、互作效應強、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的包被物可以提高實驗的準確率和靈敏度。 目前，關(guān)于p30、p54 和p72 蛋白的相應抗體檢測方法研究較多，但仍需要探索更多的ASFV抗原。

pB602L 作為一種晚期非結(jié)構(gòu)蛋白， 具有較強的抗原性， 可以使感染豬產(chǎn)生較高水平的抗體。 基于此蛋白建立的間接ELISA 方法可在稀釋6400 倍后的血清樣品中檢出ASFV 抗體，具有較高的靈敏度。 將重組結(jié)構(gòu)域缺失跨膜蛋白p22△TM 和p30 蛋白混合后作為抗原進行包被， 由此建立的間接ELISA 方法具有較高的靈敏度和特異性。

一種通過納米等離子體生物傳感器建立的檢測方法可以快速檢測血清樣品中的p30 抗體。 此種方法是將納米金標記在純化的p30 蛋白上，將蛋白與血清樣品混合后再滴加到96 孔板上，進一步反應后讀數(shù)分析。 與傳統(tǒng)ELISA 方法相比，此種方法不需要標記抗體，因此拮抗劑和抗體的選擇范圍更廣。

P17 是一種位于ASFV 內(nèi)包膜上的跨膜蛋白， 對病毒膜前體向二十面體中間體的發(fā)展至關(guān)重要。 利用此蛋白建立的間接ELISA 方法可以檢測出1∶1280 稀釋后的ASFV 陽性血清。

4 討論

本文對檢測ASFV 的基本檢測技術(shù)做了概述， 總結(jié)了一些新報道的具有不同特點的檢測技術(shù)。 目前較為常用的檢測方法仍是熒光PCR和ELISA，相應的商品化試劑盒種類繁多，對操作人員的專業(yè)性要求也越來越低。 商品化試劑盒提高了檢測工作的效率， 但同時也在一定程度上阻礙了使用者對專業(yè)技術(shù)的深入了解。 便捷快速的試劑盒會讓操作人員不愿費力了解實驗技術(shù)的基本原理， 但實際上各種實驗技術(shù)都有其優(yōu)勢和局限性。 例如，由于過長的DNA 雙鏈本身會影響熒光信號的采集， 熒光PCR 要求靶序列的長度盡可能短， 一般在50～150bp 之間。 這意味著熒光PCR 的產(chǎn)物可能不適用于測序分析，而常規(guī)PCR 則不受此限制，理論上可擴增任意長度的片段。 因此，時至今日，即使僅考慮病原檢測鑒定方面， 熒光PCR 技術(shù)仍不能完全取代常規(guī)PCR。

常用的各類檢測方法在靈敏度、特異性、檢測用時等方面各有特點，對于研發(fā)人員來說，在開發(fā)新的檢測方法時需要在各項指標中尋找平衡點。 新的檢測方法往往比傳統(tǒng)方法具有一定的優(yōu)勢， 但從方法的提出到實際應用仍需要很長時間。