氧化應(yīng)激相關(guān)因子Nrf2、HSP70在妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥胎盤組織中的表達意義及相關(guān)性分析*

張雪梅 李陽 陳麗 蔡燕

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,四川 南充 637000)

妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(Intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)是妊娠中晚期特有疾病,以血清總膽汁酸升高為主要特征[1-2]。ICP可影響新生兒預(yù)后,如自發(fā)性早產(chǎn)、新生兒窒息、顱內(nèi)出血、神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥等,使圍產(chǎn)兒病死率升高[3-4],其中不可預(yù)料的胎死宮內(nèi)是最嚴(yán)重的不良妊娠結(jié)局,是臨床醫(yī)生面臨的一大難題。目前關(guān)于ICP的病因及發(fā)病機制尚不清楚,有報道認(rèn)為ICP的發(fā)病可能與高膽汁酸刺激下,滋養(yǎng)細胞發(fā)生氧化應(yīng)激(Oxidation stress,OS)反應(yīng)有關(guān)[5]。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2),作為抗氧化應(yīng)激代表之一,參與細胞各種生命活動,可直接感應(yīng)并響應(yīng)活性氧(Reactive oxygen species, ROS)引起的線粒體功能變化,發(fā)揮重要抗氧化應(yīng)激作用[6-7]。熱休克蛋白70(Heat Shock Protein,HSP70)是機體的一種保護蛋白,以高濃度存在于細胞質(zhì)和細胞核中,發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激等重要生物功能[8-9]。基于此,本研究通過探討氧化應(yīng)激相關(guān)因子Nrf2、HSP70在孕婦胎盤組織中的表達情況,分析二者之間的相關(guān)性,及滋養(yǎng)細胞氧化應(yīng)激在ICP發(fā)病機制中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年3月—2019年12月我院收治的臨產(chǎn)前剖宮產(chǎn)終止妊娠的ICP孕婦60例,分為輕度組30例,重度組30例。納入標(biāo)準(zhǔn):均符合最新版《妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥指南》[2]的診斷及分類標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并內(nèi)外科疾病,如妊娠期心臟病、妊娠合并糖尿病、妊娠合并病毒性肝炎、妊娠合并急性闌尾炎等。②合并其他妊娠并發(fā)癥,如妊娠期高血壓疾病、胎膜早破、前置胎盤等。③多胎妊娠。另選取同期正常妊娠孕婦30例為正常妊娠組。所有產(chǎn)婦及家屬均對本研究知情,并簽署知情通知書。本研究獲川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)通過(2018NO.0315)。

1.2 主要試劑和儀器 兔抗人HSP70多克隆抗體(abcam公司),兔抗Nrf2多克隆抗體(novus公司),封閉用正常山羊血清工作液,一步法聚合物免疫組化檢測試劑(PV-6043),DAB顯色試劑盒(以上均購于北京中杉有限公司),總RNA抽提Trizol試劑(美國Ambion公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司),高通量實時熒光定量分析系統(tǒng)(德國Qiagen公司),引物基因均購于美國Invitrogen公司,QuantiNova SYBR Green PCR Kit購于德國Qiagen公司,輪轉(zhuǎn)式切片機(徠卡RM2135 徠卡儀器有限公司),PHY-III病理組織漂烘儀(常州市中威電子有限公司),DM500型徠卡顯微鏡(徠卡儀器有限公司),DHP420型電熱恒溫培養(yǎng)箱(重慶永恒實驗儀器廠),OLYMPUS顯微鏡照相系統(tǒng)(OLYMPUS公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集與保存 兩組實驗標(biāo)本均在剖宮產(chǎn)胎盤娩出后5 min內(nèi)采集,無菌操作下避開胎盤梗死、壞死及鈣化灶,取母體面近臍帶處胎盤組織4～6份,每份50～100 mg,生理鹽水充分沖洗,無菌紗布吸去生理鹽水,其中3份分別裝入1.5 mL離心管(裝有1 mL RANstore液),做好標(biāo)記存于-80 ℃冰箱,另外3份用10%甲醛固定24 h后石蠟包埋,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 免疫組化 將制備好的切片在60 ℃的電熱恒溫箱中烤片30 min,依次置于二甲苯I、II中脫蠟,各10 min,然后梯度酒精水化;加入蛋白酶修復(fù)液,加熱煮沸30 min進行抗原修復(fù),自然冷卻后,自來水、蒸餾水及PBS液浸洗;山羊血清封閉抗原,室溫孵化30 min,傾去多余液體,滴加一抗,4 ℃濕盒過夜,然后加入二抗,37 ℃水浴恒溫箱內(nèi)孵育30 min,PBS沖洗;經(jīng)過DAB顯色5 min,蘇木素染色1 min,1%鹽酸酒精分化10 s,45 ℃溫水內(nèi)返藍10 min;最后梯度酒精脫水各2 min,二甲苯II、二甲苯I內(nèi)各1 min,自來水沖洗5 min,干燥,封片。染色結(jié)果評估:將制作好的切片在高倍鏡下選取5個不同視野評分,以細胞染色強度得分:未著色為0分、黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分;陽性細胞百分率得分:<5%為0分、5%～24%為1分、25%～50%為2分、>50%為3分。細胞染色強度及細胞陽性百分率得分為免疫組化積分:0分為陰性(-),1～2分為(+),3～4分為(++),5～6分為(+++);(+)～(+++)為陽性表達。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR) 總RNA提取:分別稱量約50 mg胎盤組織,放入液氮制冷研缽內(nèi)至粉末狀。取1 mL Trizol液與粉末狀胎盤組織充分混合。按照制備試劑盒說明書提取胎盤組織中總RNA,獲取cDNA。運用Primer 3.0軟件設(shè)計特異性引物。每個樣本均設(shè)復(fù)孔,最終檢測結(jié)果取平均值。RT-qPCR:采用SYBR Green檢測模式,測定實驗組與對照組的胎盤組織中Nrf2、HSP70 mRNA的表達水平。RT-qPCR反應(yīng)體系為:總體積20 μL,上游引物和下游引物各0.4 μL,模板DNA 2 μL,2×Qu1antiNova SYBR Green PCR Kit 10 μL,QN ROX Reference Dye 0.1 μL,dd H2O 7.1 μL。熒光定量PCR儀為:QS 12K Flex ABI。反應(yīng)條件為:95 ℃ 預(yù)變性2 min,95 ℃變性5 s,60 ℃退火10 s,共40個循環(huán),并且做擴增及溶解曲線分析。每個樣品目的基因CT值用內(nèi)參基因GAPDH來進行標(biāo)化(ΔCT=CT目的基因-CT內(nèi)參),運用2-ΔΔCT對結(jié)果進行相對定量判讀[10]。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 ICP組與正常妊娠組臨床資料比較 ICP組與正常妊娠組孕婦平均年齡比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);ICP組平均孕周顯著低于正常妊娠組(P<0.01)。見表2。

表2 ICP組與正常妊娠組年齡、孕周比較

2.2 ICP組與正常妊娠組中Nrf2的表達 ICP輕、重度組胎盤組織中Nrf2陽性表達率、Nrf2 mRNA表達水平均高于正常妊娠組(P<0.01)。進一步兩兩比較,ICP重度組Nrf2陽性表達率、Nrf2 mRNA表達水平均高于輕度組,ICP輕度組Nrf2陽性表達率、Nrf2 mRNA表達水平均高于正常妊娠組(P<0.05)。見表3、圖1。

圖1 Nrf2在胎盤組織中的表達(400×)

表3 ICP組與正常組Nrf2的表達水平

2.3 ICP組與正常妊娠組中HSP70 mRNA的表達水平 ICP輕、重度組和正常妊娠組胎盤組織中均有HSP70 mRNA表達,表達存在差異且有統(tǒng)計學(xué)意義(F=11.063,P<0.01),進一步兩兩比較,ICP輕、重度組的表達水平均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);ICP重度組表達水平高于輕度組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 HSP70在胎盤組織中的表達(400×)

表4 ICP組與正常妊娠組HSP70 mRNA的表達水平

2.4 Nrf2 mRNA與HSP70 mRNA表達水平的相關(guān)性分析 ICP胎盤組織中Nrf2 mRNA與HSP70 mRNA均呈高表達,對其表達情況進行Pearson相關(guān)分析,結(jié)果提示二者呈正相關(guān)(r=0.980,P<0.05)。推測滋養(yǎng)細胞中的Nrf2、 HSP70可能在抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮協(xié)同作用,共同參與了ICP的發(fā)生發(fā)展。見圖3。

圖3 Nrf2、HSP70 mRNA表達情況的相關(guān)性分析

3 討論

ICP是妊娠中、晚期特有疾病,以皮膚瘙癢,血清膽汁酸升高為主要臨床表現(xiàn)[1],可出現(xiàn)黃疸、脂肪瀉、凝血功能異常、葡萄糖耐量異常等情況,從而使孕婦患妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓、產(chǎn)后出血等疾病的風(fēng)險相對增高[4,11],但最主要危害是導(dǎo)致突發(fā)胎死宮內(nèi)、羊水糞染等嚴(yán)重不良妊娠結(jié)局[3,12],其發(fā)病機制仍然是目前研究的熱點及難點。

ICP患者主要特征表現(xiàn)是高膽汁酸,膽汁酸濃度與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān),高膽汁酸可通過OS發(fā)揮細胞毒性作用,造成胎盤功能障礙,出現(xiàn)膽汁酸轉(zhuǎn)運、代謝異常,對胎兒造成嚴(yán)重不良影響,因此,認(rèn)為ICP的發(fā)病與高膽汁酸刺激引起的OS可能有關(guān)[13-14]。近年來,OS在子癇前期、妊娠期糖尿病、流產(chǎn)等妊娠相關(guān)性疾病中已有一定研究,但在ICP中研究較少。

Nrf2作為防御ROS的基礎(chǔ),參與細胞各種生命活動,控制細胞對內(nèi)源性和外源性氧化應(yīng)激的適應(yīng)性,當(dāng)受到氧化應(yīng)激刺激(ROS累積)時,Nrf2水平升高并轉(zhuǎn)運至細胞核中發(fā)揮其生物活性,調(diào)控抗氧化劑基因轉(zhuǎn)錄和II相解毒過程,發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的重要生物功能[15-16]。YU等[17]發(fā)現(xiàn)子癇前期孕婦胎盤中,Nrf2可激活抗氧化相關(guān)基因,通過介導(dǎo)相應(yīng)轉(zhuǎn)運蛋白避免子癇前期患者胎盤受侵襲;在ICP大鼠胎盤中線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷與Nrf2表達呈負相關(guān),Nrf2發(fā)揮了其抗氧化應(yīng)激功能[18]。本研究發(fā)現(xiàn)OS因子Nrf2在ICP患者胎盤組織中高表達,且重度組表達明顯高于輕度組。因此,認(rèn)為ICP的發(fā)病機制可能與滋養(yǎng)細胞OS有關(guān),且ICP重度組比輕度組發(fā)生OS更明顯,細胞損傷更嚴(yán)重,導(dǎo)致胎盤功能障礙也越明顯,更易發(fā)生不良妊娠結(jié)局。

HSP70是熱休克蛋白家族研究最多的應(yīng)激蛋白,可以通過改善線粒體的生物功能發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[19]。HSP70在子癇前期、妊娠期糖尿病、胎兒生長受限、流產(chǎn)、早產(chǎn)等妊娠相關(guān)疾病中已有較多研究[20]。Li等[21]發(fā)現(xiàn),應(yīng)激狀態(tài)下HSP70通過對肝管內(nèi)膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白起重要作用,從而防止膽汁酸在肝細胞內(nèi)累積產(chǎn)生毒性,減少細胞損傷。HSP70在ICP發(fā)病機制中的研究相對較少,本研究從分子角度研究測定出HSP70在ICP患者胎盤中高表達,發(fā)揮其抗氧化作用,進一步證實ICP發(fā)病機制可能與滋養(yǎng)細胞線粒體OS有關(guān)。

Nrf2、HSP70作為抗氧化應(yīng)激代表,二者之間有一定相關(guān)性,Du等[22]證實了激活的Nrf2調(diào)控轉(zhuǎn)錄基因表達上調(diào),使HSP70表達增加,二者共同作用減弱OS,減少細胞的氧化損傷。Alani等[23]認(rèn)為,Nrf2可以非特異性地調(diào)節(jié)HSP70的轉(zhuǎn)錄,從而影響HSP70的表達,調(diào)控細胞凋亡。Nrf2也能通過靶基因調(diào)控HSP70表達上調(diào)誘導(dǎo)抗氧化防御系統(tǒng),減弱OS[24]。本研究發(fā)現(xiàn)ICP胎盤組織中Nrf2 mRNA與HSP70 mRNA均呈高表達,進行相關(guān)分析提示二者呈正相關(guān)(r=0.980,P<0.05),與相關(guān)文獻[25]的研究結(jié)果相符。因此認(rèn)為,ICP患者滋養(yǎng)細胞發(fā)生OS時,Nrf2、HSP70表達增高,相互影響,共同作用,增強抗氧化功能。

4 結(jié)論

氧化應(yīng)激相關(guān)因子Nrf2、HSP70在ICP患者胎盤組織中均呈高表達,且呈正相關(guān),表明ICP的發(fā)病機制可能與高膽汁酸刺激下滋養(yǎng)細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān),其中Nrf2、HSP70可能共同參與了ICP的發(fā)生、發(fā)展。因此,通過對Nrf2、HSP70在ICP患者胎盤組織中的表達研究,為進一步探索氧化應(yīng)激相關(guān)因子對ICP的診斷、防治提供幫助,為ICP研究方向及疾病防治提供一定的理論基礎(chǔ)。