慢性活動(dòng)性EBV感染患者外周血淋巴細(xì)胞表達(dá)水平及預(yù)后危險(xiǎn)因素分析*

張葉萌 張瑩 張延霞

(東營(yíng)市人民醫(yī)院1.輸血科;2.檢驗(yàn)科,山東 東營(yíng) 257000)

EB病毒(Epstein-barr virus,EBV)是人類(lèi)已知的皰疹病毒之一,其世界范圍內(nèi)感染率超過(guò)90%[1]。研究表明,EBV的原發(fā)感染多為急性感染,患者可無(wú)典型臨床癥狀或進(jìn)展為傳染性單核細(xì)胞增多癥(Infectious mononucleosis,IM)[2-3]。部分無(wú)明顯免疫缺陷的患者,在感染EBV后,可表現(xiàn)為病毒持續(xù)活動(dòng)性的復(fù)制,而不進(jìn)入潛伏感染狀態(tài),或者在進(jìn)入潛伏感染狀態(tài)后病毒再次大量復(fù)制,促使患者IM癥狀反復(fù)出現(xiàn),并導(dǎo)致間質(zhì)性肺炎、噬血細(xì)胞綜合征、彌漫性血管內(nèi)凝血等并發(fā)癥的發(fā)生,同時(shí)伴有EBV抗體異常改變及病毒載量顯著上升,臨床將這一階段稱(chēng)為慢性活動(dòng)性EBV(Chronic active Epstein-Barr virus infection,CAEBV)感染[4]。CAEBV的發(fā)病機(jī)制目前尚待明確,研究認(rèn)為可能與患者免疫功能異常密切相關(guān)[5]。既往關(guān)于CAEBV的診療無(wú)統(tǒng)一金標(biāo)準(zhǔn),臨床上主要采用血清學(xué)特異性抗體檢測(cè)、血清EBV-DNA定量檢測(cè)等方式,但均存在一定不足,因此探討其生物學(xué)指標(biāo)表達(dá)水平及影響預(yù)后的危險(xiǎn)因素具有十分重要的臨床意義[6-9]。研究發(fā)現(xiàn),EBV可通過(guò)感染T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等導(dǎo)致機(jī)體的免疫機(jī)制出現(xiàn)紊亂,故本研究認(rèn)為外周血淋巴細(xì)胞表達(dá)水平在一定程度上可反映CAEBV患者的病情[10-11]?；诖?本研究通過(guò)探討CAEBV感染患者外周血淋巴細(xì)胞表達(dá)水平及影響預(yù)后的危險(xiǎn)因素,旨在為臨床診治CAEBV提供相關(guān)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月—2021年1月我院收治的64例CAEBV患者為CAEBV組,同期64例IM患者為IM組,64例體檢健康人群為對(duì)照組。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào):2016023)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)及納入、排除標(biāo)準(zhǔn) IM診斷標(biāo)準(zhǔn)為[12]:①出現(xiàn)急性發(fā)熱、咽峽炎、肝脾大、淋巴結(jié)腫大等臨床癥狀。②血象結(jié)果顯示淋巴細(xì)胞比例上升(>50%),異型淋巴細(xì)胞比例上升(>10%)。③EBV衣殼抗原抗體陽(yáng)性或外周血EBV DNA檢測(cè)陽(yáng)性。④排除HIV、CMV等病毒感染。CAEBV患者符合2005年Okano等制定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[12]:①患者表現(xiàn)為持續(xù)性或者復(fù)發(fā)性IM癥狀。②早期抗原以及EBV衣殼抗原抗體上升或外周血EBV DNA水平上升。③慢性病程無(wú)法用其他已知疾病解釋。納入標(biāo)準(zhǔn):①I(mǎi)M組符合IM診斷標(biāo)準(zhǔn),CAEBV組符合CAEBV診斷標(biāo)準(zhǔn),對(duì)照組為近1個(gè)月內(nèi)體檢健康者。②研究對(duì)象及其家屬知情且簽署知情同意書(shū)。③未合并其他嚴(yán)重疾病者。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并心肌炎、血小板減少癥、肝炎等疾病者。②近3個(gè)月內(nèi)服用糖皮質(zhì)激素或使用免疫抑制劑者。③合并感染性、免疫系統(tǒng)等其他嚴(yán)重疾病者。④依從性差者。

1.3 方法 ①所有研究對(duì)象均于入組時(shí)(IM組及CAEBV組為未接受治療前)抽取靜脈血5 mL×3管,采用乙二胺四乙酸抗凝。②一管采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀( XN 2000,日本希森美康)檢測(cè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。③一管采用流式細(xì)胞儀(EPICS-XL型,美國(guó)Beckman公司)檢測(cè)CD3+(抗體克隆號(hào):RM-11)、CD4+(抗體克隆號(hào):RM-11)、CD8+(抗體克隆號(hào):RM-17)、CD4+/CD8+(抗體克隆號(hào):RM-22)、CD4+CD28+(抗體克隆號(hào):RM-31)、CD8+CD28+(抗體克隆號(hào):RM-19)、CD4+CD25+(抗體克隆號(hào):RM-47)、DR+CD8+(抗體克隆號(hào):RM-42)、CD38+CD8+(抗體克隆號(hào):RM-47)、初始CD4+CD62L+CD45RA+(抗體克隆號(hào):RM-18)、初始CD8+CD62L+CD45RA+(抗體克隆號(hào):RM-26)、效應(yīng)記憶CD4+CD62L-CD45RO+(抗體克隆號(hào):RM-23)、效應(yīng)記憶CD8+CD62L-CD45RO+(抗體克隆號(hào):RM-54)、NK細(xì)胞、B細(xì)胞水平。各檢測(cè)管中加入10 μL待檢測(cè)指標(biāo)FITC標(biāo)記的單克隆抗體,并加入100 μL全血,振蕩混勻后,室溫孵育,洗滌,調(diào)節(jié)并校正流式細(xì)胞儀光路和液路,確定變異系數(shù)值<2%,設(shè)立熒光染色陰陽(yáng)分界線(xiàn),每管讀取5000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)本檢測(cè),根據(jù)各類(lèi)細(xì)胞FoxP3表達(dá)情況設(shè)置門(mén)邏輯,計(jì)算各類(lèi)細(xì)胞相對(duì)表達(dá)比例。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。所有淋巴細(xì)胞單克隆抗體均購(gòu)于美國(guó)eBioscience公司。④一管采用熒光定量PCR法檢測(cè)DNA水平,采用DNA提取試劑盒提取外周血淋巴細(xì)胞EBV DNA,通過(guò)EBV檢測(cè)試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)(TC100 PCR儀,Bio-Rad公司,美國(guó)),檢測(cè)下限為500拷貝/mL,反應(yīng)體系為:95 ℃ 預(yù)變性30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,循環(huán)35次。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。試劑盒均購(gòu)于德國(guó)Simga公司,所有試驗(yàn)嚴(yán)格按照質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。⑤對(duì)CAEBV組患者隨訪(fǎng)1年,記錄患者存活狀態(tài)。并根據(jù)是否存活分為存活組(n=49)和死亡組(n=15)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 主要指標(biāo):①比較3組CD3+、CD4+、CD8+水平。②比較3組T細(xì)胞功能亞群、調(diào)節(jié)亞群及激活亞群水平(CD4+CD28+、CD8+CD28+、CD4+CD25+、DR+CD8+、CD38+CD8+)。③比較3組CD4+和CD8+初始T細(xì)胞、記憶T細(xì)胞亞群水平。

1.4.2 次要指標(biāo):①比較3組白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)水平、外周血NK細(xì)胞、B細(xì)胞水平。②對(duì)CAEBV患者進(jìn)行隨訪(fǎng),根據(jù)患者結(jié)局分為存活組和死亡組,收集兩組一般資料,包括年齡、性別、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、總膽紅素、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、白蛋白、血清鐵蛋白及T淋巴細(xì)胞亞群水平。

2 結(jié)果

2.1 3組一般資料比較 3組在年齡、性別構(gòu)成、BMI等資料上比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),見(jiàn)表1。

表1 3組一般資料比較

2.2 3組白細(xì)胞計(jì)數(shù)及淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)水平比較 結(jié)果顯示,相較于對(duì)照組,IM組白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)水平更高,而CAEBV組白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)水平更低。IM組及CAEBV組白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)水平比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),見(jiàn)圖1。

圖1 3組白細(xì)胞計(jì)數(shù)及淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)水平比較

2.3 3組B細(xì)胞、NK細(xì)胞及CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞水平比較 相較于對(duì)照組,IM組CD3+、CD4+、CD8+水平更高,而NK細(xì)胞、B細(xì)胞水平更低(P<0.05);CAEBV組CD3+、CD4+、CD8+、NK細(xì)胞、B細(xì)胞水平均更低(P<0.05)。IM組及CAEBV組CD3+、CD4+、CD8+、NK細(xì)胞、B細(xì)胞水平比較水平均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 3組B細(xì)胞、NK細(xì)胞及CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞水平比較

2.4 3組T細(xì)胞功能亞群、調(diào)節(jié)亞群及激活亞群水平比較 相較于對(duì)照組,IM組CD4+CD25+、DR+CD8+、CD38+CD8+水平更高,而CD4+CD28+、CD8+CD28+水平更低(P<0.05);相較于對(duì)照組,CAEBV組CD4+CD28+、CD8+CD28+水平更低,而CD4+CD25+、DR+CD8+、CD38+CD8+水平更高(P<0.05)。IM組及CAEBV組CD4+CD28+、CD8+CD28+、CD4+CD25+、DR+CD8+、CD38+CD8+水平比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),見(jiàn)表3、圖2。

圖2 流式細(xì)胞圖

表3 3組T細(xì)胞功能亞群、調(diào)節(jié)亞群及激活亞群水平比較

2.5 3組CD4+和CD8+初始T細(xì)胞、記憶T細(xì)胞亞群水平比較 相較于對(duì)照組,IM組效應(yīng)記憶CD4+CD62L-CD45RO+、效應(yīng)記憶CD8+CD62L-CD45RO+更高,而初始CD4+CD62L+CD45RA+、初始CD8+CD62L+CD45RA+水平更低(P<0.05);相較于對(duì)照組,CAEBV組初始CD4+CD62L+CD45RA+、初始CD8+CD62L+CD45RA+水平更低,而效應(yīng)記憶CD4+CD62L-CD45RO+、效應(yīng)記憶CD8+CD62L-CD45RO+更高(P<0.05)。IM組及CAEBV組各CD4+和CD8+初始T細(xì)胞、記憶T細(xì)胞亞群水平比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),見(jiàn)表4。

表4 3組CD4+和CD8+初始T細(xì)胞、記憶T細(xì)胞亞群水平比較

2.6 存活組及死亡組各指標(biāo)水平比較 結(jié)果顯示,截止隨訪(fǎng),共15例患者死亡,存活組與死亡組在EBV DNA拷貝數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、總膽紅素、AST、白蛋白、血清鐵蛋白、CD4+CD28+、CD38+CD8+、初始CD4+CD62L+CD45RA+、初始CD8+CD62L+CD45RA+水平上比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),見(jiàn)表5。

表5 存活組及死亡組各指標(biāo)水平比較

2.7Logistic回歸分析結(jié)果 對(duì)單因素分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的指標(biāo)進(jìn)行賦值:EBV DNA>105拷貝/mL為1,EBV DNA≤105拷貝/mL為0;血小板計(jì)數(shù)<50×1012/L為1;血小板計(jì)數(shù)≥50×1012/L為0;AST>75.92 U/L為1,AST≤75.92 U/L為0;白蛋白<30 g/L為1,白蛋白≥30 g/L為0;血清鐵蛋白>5 000 μg/L為1,血清鐵蛋白≤5 000 μg/L為0;CD4+CD28+<91.94%為1,CD4+CD28+≥91.94%為0;CD38+CD8+>33.94%為1;CD38+CD8+≤33.94%為0;初始CD4+CD62L+CD45RA+<29.87%為1;初始CD4+CD62L+CD45RA+≥29.87%為0;初始CD8+CD62L+CD45RA+<18.94%為1;初始CD8+CD62L+CD45RA+≥18.94%為0。進(jìn)行Logistic回歸分析,條件為:向前,LR。結(jié)果顯示,EBV DNA>105拷貝/mL、血小板計(jì)數(shù)<50×1012/L、白蛋白<30 g/L以及血清鐵蛋白>5 000 μg/L是CAEBV患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),見(jiàn)表6。

表6 Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

研究表明,EBV感染人體后,病毒胞膜糖蛋白可與B淋巴細(xì)胞膜受體CD21相結(jié)合,進(jìn)而潛伏感染,促進(jìn)EBV的復(fù)制。而T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)可對(duì)受到感染的B淋巴細(xì)胞進(jìn)行清除[13-15]。因此通過(guò)輔助檢查T(mén)淋巴細(xì)胞表達(dá)水平對(duì)于疾病的診治具有十分重要的臨床意義。

白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞在抵御外界因素刺激中具有重要作用,而NK細(xì)胞則是機(jī)體天然免疫的主要承擔(dān)者。T淋巴細(xì)胞亞群在機(jī)體免疫機(jī)制中發(fā)揮著重要作用,其中CD3+細(xì)胞以及CD4+細(xì)胞可促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng),而CD8+T細(xì)胞具有抑制機(jī)體免疫應(yīng)答的功能。正常生理?xiàng)l件下,CD4+與CD8+處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示,相較于正常人群,IM患者及CAEBV患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、B細(xì)胞、NK細(xì)胞水平及T淋巴細(xì)胞亞群水平均存在一定差異,提示兩種疾病患者的免疫功能均存在紊亂情況。其中IM患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均有所上升,而B(niǎo)細(xì)胞及NK細(xì)胞水平則有所下降。研究表明,EBV病毒可使NK細(xì)胞失去清除病毒的能力,且在入侵機(jī)體后,可促使T細(xì)胞大量增殖,并形成強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng),從而識(shí)別被感染的B淋巴細(xì)胞,并促進(jìn)其凋亡[16-17]。此外該過(guò)程還可抑制B淋巴細(xì)胞的增殖、分化過(guò)程[18-19]。因此,在EBV感染急性期,患者可表現(xiàn)為T(mén)淋巴水平顯著上升,而B(niǎo)細(xì)胞和NK細(xì)胞水平顯著下降。而當(dāng)患者未及時(shí)得到有效治療時(shí),T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞之間的作用將會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng),并導(dǎo)致B細(xì)胞活動(dòng)進(jìn)一步受限,導(dǎo)致B細(xì)胞水平進(jìn)一步下降[20]。本研究結(jié)果顯示,CAEBV患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、B細(xì)胞及NK細(xì)胞計(jì)數(shù)水平均顯著下降,這也說(shuō)明CAEBV患者的免疫功能紊亂情況更為嚴(yán)重。T淋巴細(xì)胞亞群中,相較于正常人群,IM組患者CD3+、CD4+、CD8+水平均顯著上升,而CAEBV患者則CD3+、CD4+、CD8+水平均有所減少。這提示IM患者CD3+、CD4+、CD8+在高度活化,從而有利于EBV的清除。而CAEBV患者由于T淋巴細(xì)胞處于下降狀態(tài),導(dǎo)致難以清除EBV病毒,引起EBV的持續(xù)感染。

CD28為T(mén)細(xì)胞正常激活的第二信號(hào),既往有研究發(fā)現(xiàn),急性早期EBV感染患者存在CD28細(xì)胞下調(diào)暫時(shí)無(wú)能狀態(tài),這可能與T細(xì)胞在參與對(duì)病毒的免疫應(yīng)答過(guò)程中,已活化的T細(xì)胞暫時(shí)無(wú)反應(yīng)狀態(tài)有關(guān)[21]。本研究結(jié)果顯示,相較于正常人群,IM患者CD4+CD28+、CD8+CD28+水平有所下降,而CAEBV患者CD4+CD28+、CD8+CD28+水平雖有所下降,但高于IM組水平。其可能機(jī)制為CAEBV缺乏急性早期感染階段中的CD28細(xì)胞下調(diào)無(wú)能狀態(tài)階段,而這可能也是EBV感染慢性活動(dòng)性的病程特點(diǎn)。CD25分子參與抑制過(guò)度活化的自身免疫反應(yīng),CD4+CD25+細(xì)胞作為T(mén)細(xì)胞調(diào)節(jié)亞群可抑制免疫反應(yīng)和維持機(jī)體的耐受。本研究結(jié)果顯示,IM患者CD4+CD25+水平有所上升,而CAEBV患者水平介于IM患者和正常人群之間。這可能與CAEBV患者過(guò)度自身免疫炎性反應(yīng)慢性化存在一定聯(lián)系。DR+CD8+、CD38+CD8+是病毒導(dǎo)致細(xì)胞免疫激活的標(biāo)志物之一[22]。本研究結(jié)果顯示,相較于正常人群,IM和CAEBV患者DR+CD8+、CD38+CD8+水平均顯著上升,而CAEBV患者水平低于IM組,這可能與疾病的急性早期病毒清除機(jī)制和進(jìn)入慢性活動(dòng)期存在一定聯(lián)系,但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。初始T細(xì)胞在受到抗原刺激后可轉(zhuǎn)化為效應(yīng)記憶T細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示,相較于正常人群,IM組和CAEBV組初始T細(xì)胞水平均有所下降,而效應(yīng)記憶T細(xì)胞水平有所上升,這與邢燕等[23]的研究結(jié)果較為一致,其可能機(jī)制與免疫逃逸機(jī)制導(dǎo)致初始T細(xì)胞生成障礙有關(guān)。而相較于IM組,CAEBV組初始T細(xì)胞水平更高,而效應(yīng)記憶T細(xì)胞水平更低,表明這與CAEBV的慢性活動(dòng)期存在一定聯(lián)系。

本研究進(jìn)一步探討了影響CAEBV預(yù)后的可能危險(xiǎn)因素。結(jié)果顯示,EBV DNA>105拷貝/mL、血小板計(jì)數(shù)<50×1012/L、白蛋白<30 g/L以及血清鐵蛋白>5 000 μg/L是CAEBV患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。病毒載量過(guò)高往往提示患者可能存在持續(xù)性感染,導(dǎo)致病情加重。而血小板在凝血功能、血管內(nèi)皮細(xì)胞再生及修復(fù)中具有重要意義。當(dāng)血小板水平顯著下降時(shí)可能導(dǎo)致內(nèi)臟器官的自發(fā)性出血,嚴(yán)重危及生命[24]。白蛋白水平下降一方面可能會(huì)導(dǎo)致內(nèi)分泌失調(diào),增加感染風(fēng)險(xiǎn),另一方面白蛋白水平下降往往提示機(jī)體全身性消耗嚴(yán)重,提示患者預(yù)后較差[25]。而血清鐵蛋白與機(jī)體炎性反應(yīng)存在密切聯(lián)系,其水平越高往往代表患者炎性反應(yīng)越嚴(yán)重。因此,在臨床診治過(guò)程中,需密切關(guān)注上述因素,及時(shí)采取控制措施。

本研究的創(chuàng)新點(diǎn)包括:①通過(guò)分析CAEBV及IM患者淋巴細(xì)胞水平差異,從而進(jìn)一步為臨床上診斷CAEBV提供新的思路。②通過(guò)隨訪(fǎng)獲得了影響CAEBV死亡的危險(xiǎn)因素,為臨床上采取針對(duì)性治療措施提供相關(guān)依據(jù)。但本研究也存在以下不足:①研究納入樣本量較小。②未對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),難以獲得連續(xù)數(shù)據(jù)進(jìn)一步探討其可能機(jī)制。因此,仍需后續(xù)大樣本研究加以證實(shí)。

4 結(jié)論

CAEBV患者存在淋巴細(xì)胞亞群失衡及免疫功能紊亂,EBV DNA>105拷貝/mL、血小板計(jì)數(shù)<50×1012/L、白蛋白<30 g/L以及血清鐵蛋白>5 000 μg/L是影響患者死亡的危險(xiǎn)因素,需及時(shí)采取控制措施。