miR-155-5p和TRIP13在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系

徐陽(yáng) 李紅云 史銘 何波

(解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心腫瘤科,北京 100039)

我國(guó)結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)發(fā)病率位于惡性腫瘤第三位,且死亡率占據(jù)惡性腫瘤第二位,近年來(lái)其發(fā)病率、死亡率仍然有上升的趨勢(shì)[1]。CRC早期癥狀不明顯,大多數(shù)患者在中晚期時(shí)才發(fā)現(xiàn)患癌,對(duì)患者生存及生活質(zhì)量造成了一定影響。目前,隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入,腫瘤標(biāo)志物已在腫瘤診斷、患者病情的監(jiān)測(cè)或預(yù)后判斷中廣泛地應(yīng)用[2]。微小RNA(microRNA,miRNA)在病理和生理過程中起重要作用,其中包括細(xì)胞的凋亡和代謝過程。miR-155-5p位于染色體21q21上,研究表明miR-155-5p的表達(dá)水平與膽囊癌[3]、胃腺癌[4]、宮頸癌[5]、胰腺癌[6]等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及不良預(yù)后有關(guān)。另有研究指出,靶向下調(diào)miR-155-5p可能對(duì)CRC的治療具有有效的作用[7]。甲狀腺激素受體相互作用因子13(Thyroid hormone receptor interactor 13,TRIP13)屬于蛋白編碼基因,在細(xì)胞減數(shù)分裂、細(xì)胞增殖等過程中扮演著重要的角色[8]。目前,miR-155-5p、TRIP13在多種惡性腫瘤組織中異常表達(dá),但二者是否可共同參與CRC發(fā)病及對(duì)患者預(yù)后的價(jià)值尚未清楚?；诖?本研究主要探討miR-155-5p、TRIP13在CRC發(fā)生發(fā)展過程中的表達(dá)情況及預(yù)后的關(guān)系,并分析與臨床指標(biāo)、預(yù)后的關(guān)系,旨在為CRC預(yù)后評(píng)價(jià)、病理機(jī)制解析提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年1月—2017年5月本院確診的78例CRC患者為研究對(duì)象?；颊吣挲g31～72歲,平均(51.33±6.58)歲;男性42例,女性36例;按照《惡性腫瘤TNM分期》進(jìn)行臨床分期[9],其中19例TNM I期患者,38例Ⅱ期患者,21例Ⅲ期患者;腫瘤大小2.3～6.9 cm,平均(4.2±2.1)cm;腫瘤位置:結(jié)腸45例,直腸33例;浸潤(rùn)深度:T1患者14例,T2患者15例,T3患者26例,T4患者23例;腫瘤分化程度低、中、高患者分別為19例、46例和13例;無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者49例,發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者29例。納入標(biāo)準(zhǔn):①所有患者經(jīng)手術(shù)后診斷為CRC。②接受術(shù)后切除或淋巴掃除治療。③術(shù)前未接受化療、生物治療等輔助治療。④患者神志清楚且積極配合研究。⑤患者及家屬知情且簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他腫瘤。②全身感染。③合并重要器官病變。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批號(hào):20150326)。

1.2 主要試劑與儀器 Trizol試劑(貨號(hào):15596018)購(gòu)自中國(guó)深圳子科生物;miScript SYBR?Green qPCR Kit(貨號(hào):330509)購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;超微量分光光度計(jì)購(gòu)自中國(guó)上海昂拉儀器;RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào):P0101)購(gòu)自吉賽生物;引物由上海生工生物工程有限公司合成;兔抗人TRIP13多克隆抗體(貨號(hào):ab204331)購(gòu)自中國(guó)abcam公司;Envision二步法檢測(cè)試劑盒與二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine,DAB)顯色劑(貨號(hào):E-IR-R213)購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物。

1.3 方法

1.3.1 組織樣本采集 采集所有患者腫瘤組織和癌旁組織,離體后迅速置于液氮中,然后做好標(biāo)記并保存于-80 ℃冰箱中。

1.3.2 qRT-PCR檢測(cè)組織中miR-155-5p、TRIP13 mRNA相對(duì)表達(dá)水平 將患者組織加入Trizol試劑進(jìn)行RNA提取,氯仿溶解。采用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)為cDNA,采用miScript SYBR?Green qPCR Kit試劑盒檢測(cè)miR-155-5p、TRIP13 mRNA的表達(dá)水平。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 2 min,94 ℃ 15 s,55 ℃ 30 s,70 ℃ 34 s,總計(jì)40個(gè)循環(huán),分別以U6和GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔct計(jì)算組織中miR-155-5p、TRIP13 mRNA相對(duì)表達(dá)水平,序列見表1。以CRC患者miR-155-5p、TRIP13 mRNA平均值為界線,高于平均值為高表達(dá),低于平均值為低表達(dá)。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 免疫組化法檢測(cè)組織中TRIP13蛋白表達(dá)水平 首先用10%中性甲醛固定CRC組織以及癌旁組織。石蠟包埋之后進(jìn)行4 μm切片。包埋好的石蠟切片常規(guī)脫蠟,修復(fù)抗原,室溫封閉后,加入兔抗人TRIP13抗體(1∶500)4 ℃過夜,之后添加山羊抗兔lgG(1∶1000)37 ℃孵育1 h,DAB進(jìn)行染色,蘇木素復(fù)染,然后用酸酒精進(jìn)行短暫分化,之后脫水、透明、封片。

1.3.4 結(jié)果判定 顯微鏡下拍照,并對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行分析評(píng)分;評(píng)分規(guī)則如下,由陽(yáng)性細(xì)胞所占比例和染色強(qiáng)度共同決定,其中染色強(qiáng)度評(píng)分:0分(無(wú)染色),1分(淺黃色),2分(黃褐色),3分(棕褐色);陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分:<5%(0分)、5%～25%(1分)、26%～50%(2分)、51%～75%(3分)、>75%(4分),染色強(qiáng)度積分與染色面積積分的乘積為總得分,其中0～4分為陰性表達(dá),5～12分為陽(yáng)性表達(dá)[10]。

1.3.5 隨訪 對(duì)所有治療出院后的患者進(jìn)行復(fù)查或電話隨訪,隨訪時(shí)間為60個(gè)月,在2022年5月31日結(jié)束隨訪,記錄CRC患者隨訪期間生存情況。

2 結(jié)果

2.1 miR-155-5p、TRIP13 mRNA在CRC組織及癌旁組織中的表達(dá) CRC組織中miR-155-5p、TRIP13 mRNA表達(dá)水平均明顯高于癌旁組織(P<0.05),見表2。

表2 CRC組織及癌旁組織miR-155-5p、TRIP13 mRNA表達(dá)水平比較

2.2 CRC組織及癌旁組織中TRIP13蛋白表達(dá)比較 TRIP13蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核(圖1);CRC組織中TRIP13蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織(P<0.05),見表3。

圖1 CRC組織及癌旁組織中TRIP13蛋白表達(dá)(200×)

表3 CRC組織及癌旁組織中TRIP13蛋白表達(dá)比較[n(×10-2) ]

2.3 CRC組織中miR-155-5p與TRIP13 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示,CRC組織中miR-155-5p與TRIP13 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.491,P<0.001),見圖2。

圖2 CRC組織中miR-155-5p與TRIP13 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性

2.4 CRC組織中miR-155-5p、TRIP13蛋白與臨床病理特征的相關(guān)性 以CRC組織中miR-155-5p表達(dá)平均數(shù)(5.12)分為高表達(dá)組40例,低表達(dá)組38例,TRIP13蛋白表達(dá)分為陽(yáng)性表達(dá)組46例,陰性表達(dá)組32例。結(jié)果表明CRC組織中miR-155-5p、TRIP13蛋白表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置、浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)(P>0.05),與患者TNM分期、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05),見表4。

表4 CRC組織中miR-155-5p、TRIP13蛋白與臨床病理特征的相關(guān)性[n]

2.5 CRC組織中miR-155-5p、TRIP13蛋白表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響 對(duì)CRC患者進(jìn)行出院后隨訪,miR-155-5p高表達(dá)組5年內(nèi)生存率(42.50%)低于低表達(dá)組(71.05%)(Log Rank2=6.314,P=0.012);TRIP13蛋白陽(yáng)性組5年內(nèi)生存率(43.48%)低于陰性組(75.00%)(Log Rank2=7.330,P=0.007),見圖3。

圖3 CRC組織中miR-155-5p、TRIP13蛋白表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響

2.6 CRC患者預(yù)后的多因素分析 以單因素分析中差異顯著的浸潤(rùn)深度、腫瘤分化程度、miR-155-5p、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TRIP13為自變量,將預(yù)后作為因變量,Cox回歸分析顯示,腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-155-5p、TRIP13是CRC患者預(yù)后的影響因素(P<0.05)。見表5。

表5 CRC預(yù)后的多因素分析

3 討論

隨著生活質(zhì)量及飲食水平的不斷提高,CRC的發(fā)生率、死亡率均趨于年輕化,人們的身體健康和生命安全不斷受到威脅。目前,手術(shù)切除是治療CRC的首選方法,早期CRC患者在進(jìn)行手術(shù)切除之后,5年生存率高達(dá)90%,但是CRC發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者5年生存率只有8.1%[11]。所以,探究與CRC預(yù)后相關(guān)的因子,對(duì)患者生存時(shí)間延長(zhǎng)、改善患者預(yù)后具有十分重要的意義。

miRNA在人體中調(diào)控著基因的表達(dá)水平,并且參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展,miR-155-5p是miRNA家族中具有多功能的基因,在活化的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞中均表現(xiàn)出顯著高表達(dá),目前已經(jīng)證實(shí)miR-155-5p在炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)及癌癥等多種病理生理過程中起關(guān)鍵作用[12]。有研究表明[13-14],miR-155-5p在口腔鱗狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌中明顯上調(diào),可促進(jìn)腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。La等[15]研究報(bào)道,抑制miR-155-5p的表達(dá)有利于增強(qiáng)CRC細(xì)胞對(duì)化療藥物5-氟尿嘧啶的敏感性。Shi等[16]研究顯示,胃癌組織中miR-155-5p的表達(dá)水平顯著升高,其異常表達(dá)與胃癌細(xì)胞的增殖和遷移過程有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,CRC組織中miR-155-5p表達(dá)水平較癌旁組織高,與Shi等[16]研究類似,提示miR-155-5p可能參與CRC的發(fā)生。進(jìn)一步研究顯示,CRC組織中miR-155-5p表達(dá)率在不同TNM分期、腫瘤分化、淋巴轉(zhuǎn)移患者中均有差異,提示miR-155-5p可能參與CRC的發(fā)展對(duì)CRC患者進(jìn)行出院后隨訪,miR-155-5p高表達(dá)組5年內(nèi)生存率低于低表達(dá)組,且miR-155-5p是CRC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。進(jìn)一步說明miR-155-5p不僅參與CRC疾病的發(fā)生發(fā)展,同時(shí)與患者預(yù)后也密切相關(guān),可作為評(píng)估患者預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。

TRIP13位于人類染色體的5p15.33上,是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。同時(shí)作為AAA+三磷酸腺苷酶(ATPase)超家族的一員,具有促進(jìn)DNA-蛋白、蛋白-蛋白復(fù)合物形成的功能,參與有絲分裂和減數(shù)分裂過程。2014年首次報(bào)道TRIP13為頭頸癌的致癌基因[17],隨后的幾項(xiàng)研究表明TRIP13在其他腫瘤中發(fā)揮致癌作用[18-19]。Agarwal等[20]研究指出,TRIP13能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,并表明它是CRC的治療靶點(diǎn)。Kurita等[21]研究表明,TRIP13在CRC中表達(dá)上調(diào),并且通過下調(diào)TRIP13可以降低癌細(xì)胞的增殖和侵襲。通過上述研究可知,TRIP13參與CRC的病情進(jìn)展,但TRIP13與患者預(yù)后的關(guān)系仍需進(jìn)行驗(yàn)證。因此,本研究通過qRT-PCR法及免疫組化法分別檢測(cè)了TRIP13 mRNA及蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示,CRC組織中TRIP13 mRNA表達(dá)水平及蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織,與Kurita等[21]研究結(jié)果一致,提示TRIP13可能在CRC中可能作為促癌基因,參與CRC的發(fā)生。通過分析TRIP13與患者臨床病理特征的關(guān)系,結(jié)果顯示,CRC組織中TRIP13蛋白的表達(dá)與患者TNM分期、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性,提示TRIP13可能與CRC的發(fā)生及腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移關(guān)系密切。生存分析結(jié)果顯示,TRIP13蛋白陽(yáng)性組5年內(nèi)生存率低于陰性組,且TRIP13是CRC預(yù)后的影響因素,提示TRIP13水平與CRC預(yù)后密切相關(guān),TRIP13水平越高患者預(yù)后越差。此外,本研究Pearson檢驗(yàn)結(jié)果顯示,CRC組織中miR-155-5p與TRIP13 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān),提示二者可能通過某種調(diào)控機(jī)制共同參與CRC的發(fā)生及發(fā)展,從而共同影響患者預(yù)后。本研究不足之處在于,關(guān)于MiR-155-5p、TRIR13與CRC患者病情及預(yù)后的機(jī)制未深入分析,且二者在CRC中的相互調(diào)節(jié)的具體分子機(jī)制未進(jìn)行探討,今后需增加基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)(如動(dòng)物或細(xì)胞實(shí)驗(yàn))深入分析;同時(shí)由于研究時(shí)間及經(jīng)費(fèi)有限,本研究?jī)H為單中心小樣本回顧性分析,研究結(jié)論還需要從多個(gè)角度進(jìn)一步證實(shí)。

4 結(jié)論

CRC組織中miR-155-5p、TRIP13表達(dá)上調(diào),二者均參與CRC的發(fā)生發(fā)展過程,miR-155-5p、TRIP13表達(dá)情況與預(yù)后密切相關(guān)。