球孢白僵菌催化苯甲酸合成對(duì)羥基苯甲酸液體發(fā)酵優(yōu)化

劉宗求,劉雨,彭繼蘭,王金華,王永澤,高娃*

(1.工業(yè)發(fā)酵省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,武漢 430068;2.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院, 武漢 430068;3.發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430068)

對(duì)羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid,p-HBA)作為單羥基酚酸的一種,是植物體內(nèi)的天然次生代謝物,可以有效抑制真菌和細(xì)菌生長[1-2]。以對(duì)羥基苯甲酸合成的對(duì)羥基苯甲酸酯類是常見的食品防腐劑[3],被廣泛應(yīng)用于果凍、糕點(diǎn)、魚制品以及調(diào)味品等食品領(lǐng)域[4],一些常見的調(diào)味品,如沙拉醬、番茄醬、果醬以及豆瓣醬等均會(huì)添加適量的對(duì)羥基苯甲酸酯類(添加量<0.05%)作為防腐劑,可以有效防止或延緩食品調(diào)味品因微生物而導(dǎo)致的變質(zhì)[5],此外,對(duì)羥基苯甲酸及其衍生物還具有保濕、抗氧化、抗炎等功效,被應(yīng)用在化妝品領(lǐng)域[6]。在醫(yī)藥領(lǐng)域中,由于其抗炎、抗氧化、抗菌等功效也被廣泛應(yīng)用[7]。總的來說,對(duì)羥基苯甲酸作為一種化學(xué)物質(zhì),其應(yīng)用領(lǐng)域涉及食品、化妝品、醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域。

目前對(duì)羥基苯甲酸常用的合成方法是由苯酚(石油衍生物)在高溫、高壓條件下通過Kolbe-Schmitt反應(yīng)合成[8],在合成過程中,會(huì)產(chǎn)生許多具有毒性的副產(chǎn)物[9],對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染。所以,研發(fā)出對(duì)羥基苯甲酸的綠色合成方法非常重要。

球孢白僵菌(Beauveriabassiana)是一種進(jìn)行羥基化[10](生物催化反應(yīng))常見的催化劑,張倩等[11]首次報(bào)道了通過球孢白僵菌催化合成對(duì)羥基苯甲酸的途徑。本研究以球孢白僵菌B2660為研究對(duì)象,使用苯甲酸作為底物,旨在優(yōu)化液體發(fā)酵過程中的影響因素。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

球孢白僵菌(Beauveriabassiana)B2660:由湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存于-80 ℃冰箱中。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,酵母粉10 g/L,MgSO4·7H2O 2 g/L,CaCl2·2H2O 1 g/L,K2HPO4·3H2O 2.36 g/L,KH2PO40.75 g/L,微量元素溶液50 mL/L,pH 7。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基:向基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中添加5 g/L苯甲酸,并用6 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7。

微量元素母液:EDTA-2Na 2 000 mg/L,FeSO4·7H2O 600 mg/L,ZnSO4·7H2O 200 mg/L,MnSO4·H2O 150 mg/L,H3BO330 mg/L,CoCl2·6H2O 20 mg/L,CuCl2·2H2O 40 mg/L,NiCl2·2H2O 40 mg/L,Na2MoO4·2H2O 5 mg/L。

上述培養(yǎng)基均于121 ℃下滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 種子液的制備

挑選球孢白僵菌單菌落接種于基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中,于28 ℃、200 r/min培養(yǎng)48～72 h(孢子濃度約為108個(gè)/mL)后備用。

1.2.2 球孢白僵菌在不同濃度苯甲酸下耐受性的確定

將培養(yǎng)好的種子液分別接種于含不同濃度苯甲酸的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種量為5%(體積比),苯甲酸添加量設(shè)定為0,1,2,3,4,5,6 g/L,每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行,培養(yǎng)溫度為28 ℃,發(fā)酵時(shí)間為5 d,發(fā)酵結(jié)束后取樣,檢測球孢白僵菌菌體干重和對(duì)羥基苯甲酸的產(chǎn)量。

1.2.3 液體培養(yǎng)基碳、氮源的評(píng)估

在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上探究不同碳、氮源對(duì)對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量的影響,碳源設(shè)定為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、玉米淀粉和甘油,氮源設(shè)定為酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、硝酸鈉、硫酸銨和硫脲,每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行,培養(yǎng)溫度為28 ℃,轉(zhuǎn)速為200 r/min,碳源濃度為20 g/L,氮源濃度為20 g/L,于發(fā)酵5 d后取樣,檢測培養(yǎng)基中對(duì)羥基苯甲酸的產(chǎn)量。

1.2.4 最佳碳、氮源濃度的確定

在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,先保持氮源濃度為20 g/L不變,依次調(diào)整碳源濃度為10,20,30,40 g/L;再保持碳源濃度為20 g/L,依次調(diào)整氮源濃度為5,10,15,20 g/L,分別替換發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳、氮源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)5 d,溫度為28 ℃,轉(zhuǎn)速為200 r/min,于發(fā)酵結(jié)束后取樣,檢測培養(yǎng)基中對(duì)羥基苯甲酸的含量。

1.2.5 發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵的影響

在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,分別探究初始pH、接種量和轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵的影響,初始pH設(shè)定為6,6.5,7,7.5,8;接種量設(shè)定為5%、10%、15%、20%、25%;轉(zhuǎn)速設(shè)定為160,180,200,220,240 r/min,每組實(shí)驗(yàn)3次平行,于發(fā)酵5 d后取樣,檢測培養(yǎng)基中對(duì)羥基苯甲酸的含量。

1.2.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,固定苯甲酸添加量為5 g/L,碳源為20 g/L玉米淀粉,氮源為10 g/L蛋白胨,以接種量、初始pH和發(fā)酵轉(zhuǎn)速作為自變量,對(duì)羥基苯甲酸的產(chǎn)量作為響應(yīng)值Y,利用SAS軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),并使用Origin軟件繪制響應(yīng)面圖,確定最優(yōu)液體發(fā)酵條件并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.7 相關(guān)指標(biāo)檢測以及計(jì)算方法

參考謝瑩瑩等[12]的HPLC檢測方法:柱溫45 ℃,檢測波長254 nm;采用AB雙泵系統(tǒng),流速0.5 mL/min,進(jìn)樣量10 μL,體積比為60∶40,流動(dòng)相A為甲醇,流動(dòng)相B為1%冰醋酸水溶液。

菌體干重計(jì)算公式為:

式中:W1表示9 cm直徑的濾紙?jiān)?0 ℃烘箱中烘干至恒重的質(zhì)量(g);W2表示5 mL發(fā)酵液離心后,將沉淀轉(zhuǎn)移至烘干至恒重的濾紙上,80 ℃再次烘干至恒重的質(zhì)量(g)。

產(chǎn)率計(jì)算公式為:

式中:H0表示苯甲酸最初添加量(g/L);Q表示對(duì)羥基苯甲酸最終產(chǎn)量(g/L)。

2 結(jié)果與分析

2.1 球孢白僵菌在不同濃度苯甲酸下耐受性的確定

在球孢白僵菌催化苯甲酸合成對(duì)羥基苯甲酸的過程中,苯甲酸的添加量是影響菌體生長和產(chǎn)物積累的重要因素[13]。 在固定碳源為葡萄糖(20 g/L)、氮源為酵母粉(10 g/L)、初始pH為7.5的條件下,發(fā)酵5 d,結(jié)果見圖1。

圖1 球孢白僵菌在不同濃度苯甲酸下的耐受性Fig.1 Tolerance of Beauveria bassiana under different concentrations of benzoic acid

由圖1可知,當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀? g/L時(shí),隨著苯甲酸濃度的增加,球孢白僵菌的菌體干重逐漸降低,對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量則先升高后降低。當(dāng)苯甲酸濃度為5 g/L時(shí),對(duì)羥基苯甲酸的產(chǎn)量達(dá)到最大值0.32 g/L,此時(shí)菌體干重為9.13 g/L。當(dāng)苯甲酸添加量達(dá)到6 g/L時(shí),對(duì)羥基苯甲酸的產(chǎn)量僅為0.14 g/L,同時(shí)菌體干重下降至4.48 g/L。結(jié)果表明苯甲酸的濃度設(shè)定為5 g/L時(shí),球孢白僵菌具有較好的耐受性和催化效果。

2.2 液體培養(yǎng)基碳、氮源的評(píng)估

根據(jù)陳偉等[14]、張亞平等[15]的報(bào)道,碳、氮源是微生物生長所需的最基本的營養(yǎng)物質(zhì)。碳源不僅是細(xì)胞組成的碳骨架,而且是維持菌體活動(dòng)的能量來源;氮源是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)和核酸的必需原料。由于不同菌株對(duì)碳、氮源的需求和利用情況不同,因此研究發(fā)酵培養(yǎng)基中碳、氮源的使用非常必要。本研究選取了常見的6種碳源和6種氮源進(jìn)行考察。在固定碳、氮源濃度為20 g/L,其他外部因素不變的情況下,分別改變碳源和氮源種類,進(jìn)行了5 d的發(fā)酵,結(jié)果見圖2。

由圖2中a可知,當(dāng)固定氮源為酵母粉(20 g/L)時(shí),球孢白僵菌催化苯甲酸合成對(duì)羥基苯甲酸的能力與不同的液體發(fā)酵培養(yǎng)基碳源有關(guān)。結(jié)果顯示,碳源不同,對(duì)羥基苯甲酸的產(chǎn)量有差異,對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量由大到小為玉米淀粉>甘油>乳糖>麥芽糖>葡萄糖>蔗糖。球孢白僵菌B2660利用玉米淀粉作為碳源時(shí),對(duì)羥基苯甲酸的產(chǎn)量最高,為2.41 g/L,說明用玉米淀粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源更有利于對(duì)羥基苯甲酸的積累。

由圖2中b可知,當(dāng)固定碳源為葡萄糖(20 g/L)時(shí),球孢白僵菌催化苯甲酸合成對(duì)羥基苯甲酸的能力與不同的液體發(fā)酵培養(yǎng)基氮源有關(guān)。結(jié)果顯示,氮源不同,對(duì)羥基苯甲酸的產(chǎn)量有差異,對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量由大到小為蛋白胨>酵母粉>牛肉膏>硫酸銨>硝酸鈉>硫脲?？梢悦黠@看出,有機(jī)氮源更有利于球孢白僵菌催化苯甲酸合成對(duì)羥基苯甲酸,最優(yōu)的氮源為蛋白胨,對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量為0.48 g/L。因此,后續(xù)研究選取玉米淀粉和蛋白胨作為液體發(fā)酵培養(yǎng)基的碳、氮源,進(jìn)一步優(yōu)化碳、氮源濃度,旨在提高對(duì)羥基苯甲酸的產(chǎn)量。

2.3 最佳碳、氮源濃度的確定

對(duì)于不同微生物菌株,其對(duì)碳、氮源的需求和利用情況也存在差異,適宜的營養(yǎng)條件可以提高微生物對(duì)碳、氮源的利用效率,促進(jìn)微生物代謝通路的運(yùn)轉(zhuǎn),同時(shí)也可以避免營養(yǎng)濃度過高或過低對(duì)微生物生長產(chǎn)生的負(fù)面影響[16],因此需要通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)來確定最適宜的碳、氮源濃度。

在上述實(shí)驗(yàn)得到最佳碳、氮源的基礎(chǔ)上進(jìn)行了碳、氮源濃度的優(yōu)化,先保持氮源濃度為20 g/L不變,依次設(shè)定碳源濃度為10,20,30,40 g/L,分別替換液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)5 d,結(jié)果見圖3中a。當(dāng)固定氮源濃度為20 g/L時(shí),對(duì)羥基苯甲酸的產(chǎn)量隨著玉米淀粉濃度的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì),并在玉米淀粉濃度為20 g/L時(shí),產(chǎn)量達(dá)到最大值(2.43±0.02) g/L。

圖3 不同碳、氮源濃度對(duì)對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of different carbon and nitrogen source concentrations on the yield of p-hydroxybenzoic acid

固定碳源玉米淀粉濃度為20 g/L,依次設(shè)定氮源濃度為5,10,15,20 g/L,分別替換液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)5 d,結(jié)果見圖3中b。當(dāng)?shù)礉舛葹?0 g/L時(shí),對(duì)羥基苯甲酸的產(chǎn)量達(dá)到最大值(2.66±0.02) g/L。

綜上所述,球孢白僵菌B2660催化苯甲酸合成對(duì)羥基苯甲酸液體發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)碳、氮源濃度為玉米淀粉20 g/L和蛋白胨10 g/L。

2.4 初始pH、接種量和轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵的影響

在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,對(duì)液體發(fā)酵過程中的初始pH、接種量和轉(zhuǎn)速進(jìn)行優(yōu)化,旨在提高球孢白僵菌催化苯甲酸合成對(duì)羥基苯甲酸的能力。

2.4.1 初始pH對(duì)發(fā)酵的影響

苯甲酸是一種常見的防腐劑,其抑菌和殺菌作用很大程度上受pH值的影響[13]。因此,在液體發(fā)酵過程中,選擇適宜的初始pH值可以有效幫助菌株生長發(fā)育并維持菌株的催化能力。

在固定碳源為玉米淀粉(20 g/L)、氮源為蛋白胨(10 g/L)、發(fā)酵溫度為28 ℃的情況下,使用6 mol/L NaOH和3.3 mol/L HCl調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值,探究不同初始pH值對(duì)對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量的影響,結(jié)果見圖4。

圖4 不同初始pH值對(duì)對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量的影響

由圖4可知,初始pH值的不同會(huì)導(dǎo)致對(duì)羥基苯甲酸的產(chǎn)量不同。當(dāng)初始pH值為7.0時(shí),對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量為3.3 g/L,當(dāng)初始pH值下降至6.5時(shí),對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量下降至1.48 g/L,當(dāng)初始pH值進(jìn)一步下降至6.0時(shí),對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量僅為0.59 g/L,表明在pH值6.0～7.5范圍內(nèi),初始pH值越低,球孢白僵菌催化苯甲酸合成對(duì)羥基苯甲酸的能力越弱,當(dāng)初始pH為7.5時(shí),對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量達(dá)到最大值,為3.66 g/L。但是隨著初始pH的進(jìn)一步增加,對(duì)羥基苯甲酸的產(chǎn)量逐漸降低。

2.4.2 接種量對(duì)發(fā)酵的影響

接種量影響著微生物的生長發(fā)育和生物代謝,接種量過低會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液中菌體含量偏低,微生物生長緩慢,接種量過高會(huì)導(dǎo)致微生物黏度增加,溶解氧不足[17]。在固定碳源為玉米淀粉(20 g/L)、氮源為蛋白胨(10 g/L)、發(fā)酵溫度為28 ℃、初始pH為7.5的情況下,考察接種量對(duì)對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量的影響,結(jié)果見圖5。

由圖5可知,當(dāng)接種量在5%～25%時(shí),隨著接種量的增加,對(duì)羥基苯甲酸的產(chǎn)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),當(dāng)接種量為15%時(shí),對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量達(dá)到最大值,為3.73 g/L,因此,以15%接種量為依據(jù)進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

2.4.3 轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵的影響

在液體發(fā)酵過程中,轉(zhuǎn)速對(duì)培養(yǎng)基中的溶氧效率起著決定性作用。通常情況下,轉(zhuǎn)速越高,培養(yǎng)基中的溶解氧含量越充足,有利于微生物的生長和代謝。但是當(dāng)轉(zhuǎn)速超過一定閾值時(shí),會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的剪切力,對(duì)菌體造成損害[18],因此需要選擇適宜的轉(zhuǎn)速,以更好地維持球孢白僵菌的正常生長和催化能力。

由圖6可知,在本實(shí)驗(yàn)中,在固定碳源為玉米淀粉(20 g/L)、氮源為蛋白胨(10 g/L)、發(fā)酵溫度為28 ℃、初始pH為7.5、接種量為15%的情況下,探究了轉(zhuǎn)速對(duì)對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明,隨著轉(zhuǎn)速的升高,對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量逐漸升高,并在200 r/min時(shí)達(dá)到最大值(3.74 g/L),隨著轉(zhuǎn)速進(jìn)一步升高,對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量開始逐漸降低。以上結(jié)果表明,在液體發(fā)酵過程中,選擇適宜的搖床轉(zhuǎn)速非常重要,可以優(yōu)化溶氧效率,提高對(duì)羥基苯甲酸的產(chǎn)量。

圖6 不同轉(zhuǎn)速對(duì)對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of different rotation speeds on the yield of p-hydroxybenzoic acid

2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果,固定碳源為20 g/L玉米淀粉,氮源為10 g/L蛋白胨,溫度為28 ℃,選擇接種量、初始pH和轉(zhuǎn)速作為自變量,以發(fā)酵第5天時(shí)對(duì)羥基苯甲酸的產(chǎn)量作為響應(yīng)值(Y),響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)通過SAS軟件設(shè)計(jì),確定最佳的液體發(fā)酵條件并進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平表,見表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素和水平Table 1 Box-Behnken experimental factors and levels

2.5.1 模型設(shè)計(jì)與分析

依據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,通過SAS軟件設(shè)計(jì)了n=15的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

以發(fā)酵5 d時(shí)對(duì)羥基苯甲酸的產(chǎn)量(Y)作為響應(yīng)值,根據(jù)表2中的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果,利用SAS軟件對(duì)該數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸分析,得到回歸方程[19]:Y=-74.098 6+1.307 536X1+16.755 71X2+0.037 83X3-0.015 41X12-0.089X1X2-0.000 65X1X3-1.009 048X22-0.000 202X2X3-0.000 062X32。

由表3可知,該響應(yīng)面模型顯著(P<0.05),失擬項(xiàng)不顯著(P=0.072 7>0.05),表明該模型在研究區(qū)域擬合較好,決定系數(shù)R2=0.937 4,表明預(yù)測有6.26%的變異情況不能由該模型解釋,調(diào)整決定系數(shù)RAdj2=0.824 6,剔除自變量個(gè)體對(duì)R2的影響系數(shù)為0.824 6,表明該回歸方程具有較好的擬合水平。綜上可知,該回歸方程適合對(duì)球孢白僵菌B2660液體發(fā)酵對(duì)羥基苯甲酸條件進(jìn)行分析和預(yù)測。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface experimental regression model

2.5.2 各因素響應(yīng)面交互作用分析

以2.5.1中的回歸方程為依據(jù),利用Origin軟件繪制響應(yīng)面分析圖,確定接種量、初始pH和轉(zhuǎn)速對(duì)球孢白僵菌催化苯甲酸合成對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量的影響[20],響應(yīng)面和等高線圖見圖7。

圖7 各因素交互作用對(duì)對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface diagrams and contour lines of the effect of interaction of various factors on the yield of p-hydroxybenzoic acid

由圖7可知,各因素最優(yōu)水平均在所選范圍內(nèi),對(duì)球孢白僵菌催化苯甲酸合成對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量的影響越大,其響應(yīng)面圖傾斜度越高。結(jié)合表3和圖7可以看出,實(shí)驗(yàn)所選的3個(gè)因素均具有很好的交互作用,且交互作用強(qiáng)弱為X1X2>X1X3>X2X3。

2.5.3 響應(yīng)面模型結(jié)果預(yù)測與檢驗(yàn)

從以上實(shí)驗(yàn)可以得出球孢白僵菌催化苯甲酸合成對(duì)羥基苯甲酸的液體發(fā)酵過程中最適苯甲酸添加量為5 g/L,最優(yōu)碳、氮源組合為玉米淀粉20 g/L和蛋白胨10 g/L,發(fā)酵溫度為28 ℃,初始pH值為7.5,轉(zhuǎn)速為200 r/min,接種量為17.5%。按照此條件進(jìn)行驗(yàn)證,對(duì)羥基苯甲酸的產(chǎn)量可達(dá)3.85 g/L,產(chǎn)率為76.69%,與理論數(shù)據(jù)(產(chǎn)量為3.80 g/L,產(chǎn)率為75.72%)較吻合,說明此次優(yōu)化方案可行。

3 結(jié)論

本文對(duì)球孢白僵菌催化苯甲酸合成對(duì)羥基苯甲酸在液體發(fā)酵過程中的碳、氮源和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。最終確定了液體發(fā)酵過程中最適苯甲酸添加量為5 g/L,最優(yōu)碳、氮源組合為玉米淀粉20 g/L和蛋白胨10 g/L,發(fā)酵溫度為28 ℃,初始pH為7.5,轉(zhuǎn)速為200 r/min,接種量為17.5%。按照此條件進(jìn)行驗(yàn)證,對(duì)羥基苯甲酸的產(chǎn)量可達(dá)3.85 g/L,產(chǎn)率為76.69%。相較于優(yōu)化前,對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量(0.31 g/L)提升了約12倍。相較于張倩等[11]利用球孢白僵菌B2660進(jìn)行全細(xì)胞催化苯甲酸(2 g/L)合成對(duì)羥基苯甲酸(1.2 g/L),催化底物濃度提高2.5倍,產(chǎn)量提升3.18倍。

Meijnen等[21]將外源基因?qū)霅撼艏賳伟?以木糖和甘油作為混合底物合成對(duì)羥基苯甲酸,產(chǎn)率最高為16.3 Cmol%。Peng等[22]和Quévrain等[23]發(fā)現(xiàn)微泡菌Microbulbifersp. A4B-17可以生產(chǎn)對(duì)羥基苯甲酸,產(chǎn)量可達(dá)10 mg/L。與上述研究相比,本研究在產(chǎn)率和產(chǎn)量方面均有明顯提高。

綜上所述,本研究中對(duì)羥基苯甲酸產(chǎn)量得到了一定的提升,同時(shí)也為利用微生物液體發(fā)酵苯甲酸合成對(duì)羥基苯甲酸提供了新的研究思路。