馬鈴薯抗寒性鑒定及篩選

舒啟瓊, 羅小波, 李 飛, 羅 充, 馮文豪, 陳明俊, 曹貞菊

(1.貴州省農(nóng)科院生物技術(shù)研究所/國(guó)家馬鈴薯改良中心貴州分中心/貴州省馬鈴薯工程技術(shù)研究中心, 貴陽 550006;2. 貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 貴陽 550001; 3.貴州省農(nóng)作物技術(shù)推廣總站, 貴陽 550001)

低溫對(duì)植物造成的傷害分為冷害(Chilling injury)和凍害(Freezing injury)。冷害是指0～10 ℃溫度對(duì)植物造成的傷害,植物出現(xiàn)暫時(shí)的新陳代謝功能紊亂和活性氧等有毒物質(zhì)的積累,但能夠在環(huán)境適宜的情況下恢復(fù)。凍害則是指0 ℃以下低溫對(duì)植物造成的傷害,凍害使植物體內(nèi)的水形成冰晶,破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),同時(shí)造成細(xì)胞內(nèi)容物濃度增高而引起有毒物質(zhì)的積累,造成不可恢復(fù)的傷害[1]。在長(zhǎng)期的自然選擇中,植物為應(yīng)對(duì)低溫脅迫而進(jìn)化出了非馴化抗寒能力(Non-acclinmated freezing tolerance,NFT)和馴化抗寒能力(Acclimation capacity,ACC)[2]。植物不經(jīng)過低溫馴化就具有抗低溫霜凍能力稱為NFT,經(jīng)過一定周期冷馴化而具有的抗低溫霜凍的能力稱為ACC。在植物抵御低溫脅迫的過程中,伴隨著植物膜中的分子和生理修飾,胞漿Ca2+的積累,活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平的增加和ROS清除系統(tǒng)的激活,抗冷相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的變化,蛋白質(zhì)和糖合成的改變,脯氨酸的積累,以及影響光合作用的生化變化等[1,3]。

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)屬茄科(Solanaceae)茄屬(Solanum)一年生草本植物,明代傳入中國(guó),而后被廣泛種植,是食用國(guó)家最多的作物,也是全球四大經(jīng)濟(jì)作物之一,營(yíng)養(yǎng)豐富、適應(yīng)性強(qiáng)和生育期短等優(yōu)點(diǎn)使得馬鈴薯的需求量逐年增高,中國(guó)是世界當(dāng)前馬鈴薯種植第一大國(guó)[5-6]。馬鈴薯富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維等,具有糧菜兼用和綜合加工等廣泛用途[4]。馬鈴薯是喜冷涼但不耐低溫作物,中國(guó)馬鈴薯主產(chǎn)地北方一作區(qū)、中原二作區(qū)、西南混作區(qū)和南方冬作區(qū)幾乎都會(huì)遭受低溫霜凍災(zāi)害。2008年的冰雪災(zāi)害使得中國(guó)南方各地的馬鈴薯受災(zāi)面積達(dá)40.93萬hm2,造成經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)10億元[7]。2016年江西鄱陽湖地區(qū)的寒潮天氣導(dǎo)致當(dāng)?shù)伛R鈴薯幼苗凍死率高達(dá)75%～95%,造成當(dāng)?shù)伛R鈴薯嚴(yán)重減產(chǎn)[8]。2018年廣西玉林市馬鈴薯因遭受低溫凍害無法達(dá)到商品薯標(biāo)準(zhǔn)(100 g以上),造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[9]。低溫霜凍制約馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,鑒定篩選較為抗寒的馬鈴薯材料,改良馬鈴薯耐凍性尤為重要。

植物抗寒性表型鑒定的方法有露地栽培鑒評(píng)法、寒凍災(zāi)害調(diào)查法、人工模擬低溫法和數(shù)學(xué)建模預(yù)測(cè)法、電解質(zhì)滲出率法等[10]。馬鈴薯抗寒性鑒定的方法主要有田間自然霜凍法、生理生化指標(biāo)測(cè)定法、電解質(zhì)滲漏法。電解質(zhì)滲漏法結(jié)合Logistic方程以及隸屬函數(shù)和聚類分析法被廣泛應(yīng)用于植物抗寒性鑒定,在馬鈴薯抗寒性鑒定中被認(rèn)為是較為可靠的方法[10-12]。本研究采用電導(dǎo)率滲漏法對(duì)82份馬鈴薯材料進(jìn)行抗寒性鑒定,評(píng)價(jià)并篩選較為抗寒的馬鈴薯材料,以期為貴州馬鈴薯生產(chǎn)、品種推廣以及抗寒育種親本的選擇提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所選用的材料均來源于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所,包括2份野生種、66份普通栽培種和14份后代品系。于2020年4月種植于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所大棚,大棚室溫20～25 ℃。挑選薯型大小均勻(50 g左右)、健康無病薯塊播種于10 cm×10 cm的塑料缽內(nèi)(V泥炭土∶V蛭石=1∶1),每份材料播種7盆。出苗后生長(zhǎng)40 d,取大小一致的功能葉片進(jìn)行電導(dǎo)率測(cè)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1低溫處理及電導(dǎo)率測(cè)定

馬鈴薯抗寒性鑒定參照李飛[13]、鄧高峰[14]的方法,略有改動(dòng)。

實(shí)驗(yàn)儀器:取樣袋、剪刀、冰盒、低溫水浴鍋、試管(25 cm×15 cm)、試管架、高壓蒸汽滅菌鍋、電導(dǎo)率儀、刀片、鑷子、加樣器等。

取樣:實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)溫度點(diǎn)(0 ℃、-2 ℃、-4 ℃、-6 ℃、-7 ℃),每個(gè)溫度點(diǎn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。按照低溫水浴鍋的容量每次最宜處理15個(gè)材料,每個(gè)材料應(yīng)選擇大小、葉齡相似的功能葉片,每個(gè)材料可多取幾片備用,不要剪傷葉片,取完后放入冰盒,快速進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)處理。

樣品清洗:用蒸餾水將葉片清洗干凈,后置于吸水紙上將水分吸干。

樣品放置:用鑷子輕輕將葉片置于試管底部,葉柄面朝下,使葉背面貼住試管壁,然后將試管依次放置于標(biāo)記好處理溫度的試管架。

低溫處理:低溫水浴鍋液體媒介為蒸餾水和酒精,0 ℃的試管架直接置于冰上并放在4 ℃冰箱過夜,其余的都放置于低溫水浴鍋,待水浴鍋顯示溫度降到0 ℃時(shí)開始計(jì)時(shí),30 min后調(diào)節(jié)溫度為-0.5 ℃再保持30 min,溫度從-0.5 ℃降到-1 ℃并保持30 min后在每只試管中加入小塊冰,再保持30 min后將溫度降為-1.5 ℃,保持1 h,后降溫至-2 ℃保持30 min,取樣。依次按0.5 ℃/30 min速度降溫,溫度達(dá)到目標(biāo)溫度時(shí),取樣,盡快置于冰上,放入4 ℃冰箱中解凍過夜。

電導(dǎo)率測(cè)定:將完全解凍的樣品用鋒利的刀片切成5 mm的小條裝入試管,同時(shí)加入25 mL蒸餾水。用真空泵以0.1 MPa的真空度抽氣6 min,置于搖床中以220 r/min的速度振動(dòng)1 h,靜置后用電導(dǎo)率儀測(cè)定煮沸前電導(dǎo)率R1,然后將每個(gè)試管蓋上蓋子,放置于高壓蒸汽滅菌鍋中煮沸10 min,冷卻至室溫測(cè)煮沸后電導(dǎo)率R2。計(jì)算電解質(zhì)滲出率。

電解質(zhì)滲出率/%=(R1/R2)×100%。

1.2.2LT50值的計(jì)算

將每個(gè)溫度點(diǎn)對(duì)應(yīng)的電解質(zhì)滲出率3次重復(fù)結(jié)果的平均值結(jié)合Logistic方程計(jì)算樣品半致死溫度(LT50)。

Logistic方程y=1/[1+eB(c-x)],式中:y、x分別表示相對(duì)電導(dǎo)率和處理溫度;B、C分別表示方程拐點(diǎn)斜率和樣品LT50值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及作圖采用Excel2019軟件,抗寒性Logistic回歸模型建立采用DPS v7.5軟件,聚類分析采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS25.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫后馬鈴薯電導(dǎo)率變化情況

抗寒性差的馬鈴薯葉片在低溫處理后變癱軟,葉片顏色逐漸變黑。以Cip43和云薯902號(hào)的離體葉片為對(duì)照(表1),經(jīng)低溫梯度處理后對(duì)應(yīng)的電導(dǎo)率擬合Logistic方程為代表,使植物電導(dǎo)率達(dá)到50%時(shí)的低溫處理溫度即為該材料的半致死溫度(LT50)。-4 ℃低溫處理Cip43,電解質(zhì)滲出率為33.78%,電解質(zhì)滲出率還未達(dá)到50%,顯現(xiàn)出較強(qiáng)的抗寒能力。云薯902號(hào)經(jīng)低溫處理到-2 ℃時(shí),電解質(zhì)滲出率為53.98%,說明其半致死溫度大于-2 ℃,抗寒性較差。植物電解質(zhì)滲出率結(jié)合Logistic方程擬合計(jì)算得出的半致死溫度能較為準(zhǔn)確地反映植物抗寒性。

表1 Cip43和云薯902號(hào)電解質(zhì)滲出率

相對(duì)電導(dǎo)率隨處理溫度變化呈“S”型曲線變化,較直觀地反映了植物抗寒能力[13]。Cip43與云薯902號(hào)在經(jīng)低溫處理后,相對(duì)電導(dǎo)率與處理溫度呈“S”型曲線變化(圖1),電導(dǎo)率達(dá)50%時(shí),經(jīng)Logistic方程擬合計(jì)算得出Cip43和云薯902號(hào)半致死溫度分別為-4.6 ℃和-1.6 ℃。Cip43半致死溫度比云薯902號(hào)低3 ℃,抵御低溫脅迫的能力顯著較強(qiáng)。

圖1 低溫處理Cip43和云薯902號(hào)離體葉片后電導(dǎo)率擬合Logistic回歸方程曲線

2.2 馬鈴薯電導(dǎo)率Logistic回歸方程及抗寒性鑒定

分別以Cip43和云薯902號(hào)作抗寒性對(duì)照,參照李華偉等[15]、魏亮等[16]的分析方法進(jìn)行抗寒性鑒定。對(duì)82份馬鈴薯材料進(jìn)行低溫處理,測(cè)定電導(dǎo)率并進(jìn)行Logistic線性回歸分析,建立Logistic回歸模型求出方程和LT50,而后進(jìn)行抗寒性鑒定,結(jié)果見表2。LT50值與抗寒性呈負(fù)相關(guān),LT50值越小則抗寒性越強(qiáng)。Cip43擬合方程為:y=106.653/[1+e(3.463-0.749x)],LT50值為-4.6 ℃,R2=0.974,擬合度達(dá)極顯著水平。云薯902號(hào)擬合方程為y=78.296/[1+e(1.174-0.879x)],LT50值為-1.6 ℃,R2=0.986,達(dá)極顯著水平。

表2 82份馬鈴薯材料電導(dǎo)率擬合Logistic回歸方程及半致死溫度

根據(jù)電導(dǎo)率與Logistic回歸方程擬合求出的半致死溫度(LT50)對(duì)82份馬鈴薯材料進(jìn)行抗寒性鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),82份材料的半致死溫度為-4.8 ℃～-1.6 ℃,其中云薯902號(hào)、宣薯6號(hào)和Q5等11份馬鈴薯材料LT50>-2.5 ℃,占比13.41%,抗寒性最差;LT50在-4.0 ℃～-2.5 ℃之間的材料有64份,占比78.05%,抗寒性介于抗寒和霜凍敏感之間;Cip43、大同20和BF004等7份馬鈴薯材料LT50≤-4.0 ℃,占比8.53%,抗寒能力強(qiáng),其中大同20抗寒性最強(qiáng),半致死溫度達(dá)-4.8 ℃(圖2)。

圖2 82份馬鈴薯材料抗寒性分布

2.3 82份馬鈴薯材料抗寒性聚類分析

根據(jù)表2對(duì)82份馬鈴薯材料抗寒性進(jìn)行聚類分析(圖3),在平均歐氏距離為18時(shí),可將82份材料分為三類:第一類為抗寒能力較強(qiáng)的大同20、Cip43等7份材料,LT50值在-4.0 ℃～-4.8 ℃之間,平均值為-4.3 ℃,在82份抗寒性材料中屬于強(qiáng)抗寒性品種;第二類材料抗寒性處于中間位置,LT50值在-4.4 ℃～-2.5 ℃之間,包括宣薯2號(hào)、中薯5號(hào)、東農(nóng)310和費(fèi)烏瑞它等64份材料;第三類材料屬于低溫敏感材料,半致死溫度均高于-2.5 ℃,其中抗寒性最差的為云薯902、Q5和Cph12。

圖3 82份馬鈴薯材料抗寒性聚類分析

3 結(jié)論與討論

馬鈴薯作為世界第四大糧食作物,對(duì)促進(jìn)地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、消除地區(qū)貧困以及保障糧食安全起著重要作用[17]。我國(guó)作為馬鈴薯生產(chǎn)第一大國(guó),幾乎每個(gè)種植區(qū)域都存在低溫霜凍脅迫的風(fēng)險(xiǎn)。低溫霜凍輕則影響馬鈴薯光合作用以及生理生化功能和塊莖的形成,重則使得馬鈴薯萎蔫甚至死亡,導(dǎo)致減產(chǎn)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。自然界中存在豐富的野生馬鈴薯抗寒資源,已經(jīng)證實(shí),S.commersonii、S.boliviense、S.demissum、S.chomatophilum等35個(gè)野生種中均存在抗寒株系[16-17]。目前廣泛種植的馬鈴薯栽培種大部分不具抗寒性,將野生抗寒性資源應(yīng)用于栽培種的選育,對(duì)推進(jìn)馬鈴薯抗寒性育種進(jìn)程具有重要意義。對(duì)現(xiàn)有栽培品種(系)及野生種進(jìn)行抗寒性鑒定,篩選出優(yōu)質(zhì)抗寒材料,能夠?yàn)楹罄m(xù)利用常規(guī)雜交育種及分子技術(shù)育種提供種質(zhì)資源及參考。

馬鈴薯抗寒性研究最常用的方法為田間自然霜凍法和電導(dǎo)率測(cè)定法,自然霜凍法最先由Vega和Bamberg[20],趙喜娟等[21]通過對(duì)田間自然霜凍后的馬鈴薯植株損傷程度進(jìn)行評(píng)級(jí)來直觀評(píng)價(jià)馬鈴薯抗寒性,依賴于田間自然霜凍天氣,存在一定的限制因素;電導(dǎo)率測(cè)定法主要利用離體葉片在室內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),能夠打破自然環(huán)境的限制,其原理是通過測(cè)定離體葉片在不同低溫脅迫下的電解質(zhì)滲出率差異來反映葉片受傷程度和抗寒性強(qiáng)弱,當(dāng)葉片電解質(zhì)滲出率達(dá)到50%時(shí)的溫度即為測(cè)定材料的半致死溫度,電導(dǎo)率結(jié)合Logistic方程計(jì)算半致死溫度反映植物耐寒性是當(dāng)前最為可靠的抗寒性鑒定方法。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)82份馬鈴薯材料進(jìn)行電解質(zhì)滲出率測(cè)定,并結(jié)合Logistic方程計(jì)算半致死溫度,研究表明,馬鈴薯栽培種絕大多數(shù)抗寒性較差,與前人[15-16,22-23]研究結(jié)果一致。聚類分析可將82份馬鈴薯材料分為11份霜凍敏感型材料(抗寒能力最弱)、64份中間型材料和7份較強(qiáng)抗寒型材料。鑒定篩選出抗寒性最強(qiáng)的馬鈴薯材料為大同20和Cip43,可為后續(xù)馬鈴薯抗寒性研究及育種提供參考。