非靶向代謝組學(xué)分析不同品種青花椒的化學(xué)成分差異

祝曉云, 蔣永梅, 余家奇, 鄭 宇, 覃 成

(1.遵義職業(yè)技術(shù)學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)系/喀斯特地區(qū)特色生物資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 遵義 563006;2.遵義醫(yī)科大學(xué), 貴州 遵義 563099; 3.遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院, 貴州 遵義 563000)

青花椒為蕓香科(Rutaceae)花椒屬竹葉花椒(ZanthoxylumschinifoliumSieb. et Zucc)的果皮[1],又名野椒、天椒、崖椒等[2]。青花椒因其果實(shí)成熟后為青色而得名,主產(chǎn)于云南昭通、陜西韓城、四川漢源、重慶江津和貴州等地[3]。青花椒具有獨(dú)特的濃烈香氣,在我國(guó)主要用作食品調(diào)味香辛料。青花椒含有酰胺類、萜類、生物堿類、氨基酸類、香豆素類等化學(xué)成分[1,4],具有麻醉、抗菌[1]、抗炎[4]、鎮(zhèn)痛[5]、降血脂[6]、抗氧化和抗腫瘤[7]等生物活性。

非靶向代謝組學(xué)針對(duì)生物體內(nèi)的代謝物物質(zhì)(<1 kDa)開(kāi)展全面、系統(tǒng)的定性和定量分析[8-9]。結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法能更好地對(duì)樣品鑒定差異進(jìn)行更為詳細(xì)的分析,同時(shí)針對(duì)特定的差異代謝物進(jìn)行深度挖掘[10]。在不同外界環(huán)境情況下,植物體內(nèi)在代謝組學(xué)水平的表達(dá)變化通常會(huì)隨著外部環(huán)境的變化而變化。如花椒體內(nèi)代謝物質(zhì)的變化會(huì)隨著環(huán)境因子的變化而變化,其中包括土壤因子、氣候因子等外部環(huán)境影響而改變,從而影響花椒的品質(zhì)和市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn),非靶向代謝組學(xué)同近紅外光譜[8]、核磁共振[11]、高效液相色譜[12]等分析方法相結(jié)合,對(duì)研究植物體中代謝物的表達(dá)水平和外部環(huán)境之間的關(guān)系具有更為顯著的優(yōu)勢(shì)。相比較其他代謝組學(xué)平臺(tái)分析方法,其中超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜具有分辨率高、靈敏度和重現(xiàn)性好等特點(diǎn),并允許同時(shí)對(duì)多個(gè)化合物進(jìn)行快速的定性或相對(duì)定量分析[13],因此在生物學(xué)[14]、臨床醫(yī)學(xué)[15]、藥學(xué)[16]、食品[17]等生命科學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

本研究收集了國(guó)內(nèi)4種不同來(lái)源的青花椒(新舟青椒(Zb005)、遵義大木椒(Zb004)、江口青椒(Zb0010)和峨眉山藤椒(Zb003)),基于液相-質(zhì)譜(Liquid Chromatography-mass Spectrometry,LC-MS)聯(lián)用技術(shù)的非靶向代謝組學(xué),分析不同來(lái)源代謝物質(zhì),經(jīng)過(guò)包括主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)、偏最小二乘判別分析(Partial Least Squares Discriminant Analysis,PLS-DA)等多元統(tǒng)計(jì)分析方法,篩選不同來(lái)源青花椒的差異并分析其相關(guān)通路,以期為篩選青花椒優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源提供理論基礎(chǔ),同時(shí)為花椒加工提供現(xiàn)實(shí)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4個(gè)不同花椒品種均種植在遵義職業(yè)技術(shù)學(xué)院花椒種植基地(107°045′E,27°710′N),采集成熟青花椒果實(shí),液氮速凍備用。4個(gè)不同花椒品種分別是來(lái)自貴州省遵義市本地的新舟青椒和遵義大木椒、引種自貴州省銅仁市的江口青椒和四川省樂(lè)山市的峨眉山藤椒。

試劑:甲醇(北京百靈威科技有限公司,純度:分析純)、乙腈(Merck,純度:色譜純)、乙酸銨(Sigma,純度:色譜純)、氨水(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,純度:分析純)、L-2-氯苯丙氨酸(上海恒柏生物科技有限公司,純度≥98%)。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司);AB Triple TOF6600質(zhì)譜儀(AB SCIEX);JXFSTPRP-24研磨儀(上海凈信科技有限公司);VORTEX-5渦旋儀(其林貝爾儀器制造有限公司);低溫高速離心機(jī)(Eppendorf 5430R);色譜柱:Waters,ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm,2.1 mm×100 mm column。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品前處理

上述4種青花椒中,每組青花椒樣品分別設(shè)6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。樣品放置于凍干機(jī)(Scientz-100F)中真空冷凍干燥,用研磨儀研磨(30 Hz,1.5 min)至粉末狀備用。

1.3.2代謝物的提取

稱取20 mg青花椒粉末加入2 mL離心管中,加入1 000 μL提取液(V甲醇∶V乙腈∶V水溶液=2∶2∶1)渦旋30 s將其混勻;然后放置在研磨儀中45 Hz處理4 min,接著冰水浴超聲處理5 min,重復(fù)以上步驟3次;將處理后得到的液體在-20 ℃環(huán)境中靜置10 min。靜置后,4 ℃下14 000 r/min離心20 min,提取上層清液置于真空干燥機(jī)中干燥,質(zhì)譜分析時(shí)加入100 μL乙腈水溶液(V乙腈∶V水=1∶1)復(fù)溶,渦旋,14 000 r/min 4 ℃離心15 min,取上清液進(jìn)樣分析。為確?；ń窐悠烽g的可重復(fù)性,對(duì)樣品進(jìn)行同等體量進(jìn)行混合開(kāi)展質(zhì)控。

1.3.3色譜條件

樣品采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜進(jìn)行分離,色譜柱為Waters,ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm,2.1 mm×100 mm column;柱溫25 ℃;流速0.5 mL/min;進(jìn)樣量2 μL;流動(dòng)相組成A:水+25 mmol/L乙酸銨+25 mmol/L氨水,B:乙腈。梯度洗脫程序:0～0.5 min,95% B;0.5～7 min,95%～65% B;7～8 min,65%～40% B;8～9 min,40% B;9～9.1 min,40%～95% B;9.1～12 min,95% B;為保障樣品分析過(guò)程的順利進(jìn)行,將需要分析的樣品放置于4 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器中。為避免儀器檢測(cè)信號(hào)波動(dòng)而造成的影響,對(duì)需要進(jìn)行分析的樣本采用隨機(jī)進(jìn)樣。為獲得更為穩(wěn)定和可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),在分析的樣品中插入質(zhì)控樣品。

1.3.4Q-TOF質(zhì)譜條件

采用AB Triple TOF6600質(zhì)譜儀進(jìn)行樣本一級(jí)、二級(jí)譜圖的采集。HILIC色譜分離后的ESI源條件如下:Ion Source Gas1(Gas1):60,Ion Source Gas2(Gas2):60,Curtain gas(CUR):30,source temperature:600 ℃,IonSapary Voltage Floating (ISVF)±5 500 V(正負(fù)兩種模式);TOF MS scan m/z range:60～1 000 Da,product ion scan m/z range:25～1 000 Da,TOF MS scan accumulation time 0.20 s/spectra,product ion scan accumulation time 0.05 s/spectra;二級(jí)質(zhì)譜采用information dependent acquisition (IDA)獲得,并且采用high sensitivity模式,Declustering potential(DP):±60 V(正負(fù)兩種模式),Collision Energy:(35±15)eV,IDA設(shè)置如下Exclude isotopes within 4 Da,Candidate ions to monitor per cycle:10。

1.3.5數(shù)據(jù)處理

首先,使用ProteoWizard軟件將經(jīng)質(zhì)譜分析后的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換mzML格式;然后使用ChromaTOF軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對(duì)齊等分析。采用Compound Discover(2.0 版,Thermo)和OSI-SMMS(1.0 版,大連化學(xué)數(shù)據(jù)解決方案信息技術(shù)公司),與MassBank、HMDB、MoTo DB、METLIN及Mzcloud數(shù)據(jù)庫(kù)等進(jìn)行物質(zhì)鑒定,再將質(zhì)控樣本中檢出率50%以下或RSD大于30%的峰去除。使用SIMCA14.1軟件進(jìn)行PCA、OPLS-DA等多元統(tǒng)計(jì)分析,篩選差異代謝物。對(duì)篩選出的差異代謝集,通過(guò)關(guān)聯(lián)分析、KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫(kù)通路分析、聚類分析等分析手段進(jìn)行生物學(xué)信息挖掘。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

為獲得真實(shí)可靠的數(shù)據(jù),本實(shí)驗(yàn)從以下兩方面進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量控制:一是在正、負(fù)離子采集分析時(shí),通過(guò)組間穿插進(jìn)樣、樣品組內(nèi)隨機(jī)進(jìn)樣的方式進(jìn)行檢測(cè); 二是通過(guò)繪制QC樣品的PCA得分圖考察檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。如圖1所示,正、負(fù)離子模式下青花椒QC樣品多次進(jìn)樣的峰面積偏差在-2～2 SD之間。結(jié)果表明,本次測(cè)試系統(tǒng)穩(wěn)定,誤差小,重復(fù)性好,數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。

注:A為正離子模式PCA得分圖;B為負(fù)離子模式PCA得分圖。

2.2 代謝物鑒定數(shù)量統(tǒng)計(jì)

4個(gè)品種青花椒中,正、負(fù)離子模式合并后鑒定出差異顯著的代謝物131種,在正離子模式下共鑒定到54種代謝物,而在負(fù)離子模式下共鑒定到77種代謝物,統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。

表1 差異代謝物的統(tǒng)計(jì)

Table 1 Statistics of the differential metabolites

2.3 代謝物化學(xué)分類歸屬統(tǒng)計(jì)

從4個(gè)品種青花椒中鑒定到的所有代謝物(合并正負(fù)離子模式鑒定到的代謝物),根據(jù)代謝物的化學(xué)分類進(jìn)行統(tǒng)計(jì),每組代謝物數(shù)量占總代謝物量比率如圖2所示。有機(jī)酸及其衍生物(Organic acids and derivatives)代謝物量占總比16.111%,有機(jī)氧化合物(Organic oxygen compounds)占總比14.444%,核苷、核苷酸以及其類似物(Nucleosides, nucleotides, and analogues)占總比6.111%,有機(jī)雜環(huán)化合物(Organheterocyclic compounds)占總比5.556%,脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子(Lipids and lipid-like molecules)占總比5%,苯類化合物(Benzenoids)占總比3.889%,有機(jī)氮化合物(Organic nitrogen compounds)占總比2.5%,苯丙素和聚酮化合物(Phenylpropanoids and polyketides)占總比2.222%,有機(jī)氧化物(Organooxygen compounds)占總比0.556%,木脂素、新木脂素以及相關(guān)化合物(Lignans, neolignans and related compounds)占總比0.278%,苯丙烷和聚酮化合物/生物堿和衍生物(Phenylpropanoids and polyketides/Alkaloids and derivatives)占總比0.278%。

圖2 鑒定的代謝物在各化學(xué)分類的數(shù)量占比

2.4 單變量統(tǒng)計(jì)分析

單變量分析中,差異代謝物的篩選通過(guò)差異倍數(shù)(FC≥1.2或≤0.833 3)和p-value(p<0.05)的指標(biāo)在火山圖3中體現(xiàn)。其中顯著上調(diào)的代謝物和顯著下調(diào)的代謝物分別用紅色點(diǎn)和藍(lán)色點(diǎn)表示,灰色表示未顯著變化的代謝物。圓點(diǎn)的大小表示變量權(quán)重值。圖3為正離子模式下4個(gè)不同品種青花椒比較的火山圖,新舟青椒與峨眉山青椒比較(圖3A),存在24種顯著差異的代謝物;新舟青椒與遵義大木椒比較(圖3B),存在17種差異代謝物;新舟青椒與江口青椒比較(圖3C),存在13種差異代謝物。

注:A為新舟青椒與峨眉山藤椒的比較;B為新舟青椒與遵義大木椒的比較;C為新舟青椒與江口青椒的比較。紅色表示上調(diào),藍(lán)色表示下調(diào),黑色表示差異不顯著。

2.5 不同品種青花椒代謝物的多元統(tǒng)計(jì)分析

2.5.1主成分分析

主成分分析作為一種多元統(tǒng)計(jì)非監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析方法。為分別篩選新舟青椒與峨眉山藤椒、遵義大木椒、江口青椒的差異代謝物,首先建立非監(jiān)督的主成分分析模型(PCA-X)對(duì)上述4個(gè)品種青花椒進(jìn)行分析。通過(guò)自動(dòng)擬合,新舟青椒與峨眉山藤椒模型的解釋率為0.823,新舟青椒與遵義大木椒模型的解釋率為0.796,新舟青椒與江口青椒模型的解釋率為0.774。主成分得分散點(diǎn)圖詳見(jiàn)圖4,新舟青椒分別與峨眉山藤椒(圖4A)、遵義大木椒(圖4B)、江口青椒(圖4C)的分布比較分散,而組內(nèi)3次生物學(xué)重復(fù)分布較緊湊。這表明該主成分分析模型可靠,不同品種的青花椒代謝物存在差異。

注:A為新舟青椒與峨眉山藤椒的主成分得分散點(diǎn)圖;B為新舟青椒與遵義大木椒的主成分得分散點(diǎn)圖;C為新舟青椒與江口青椒的主成分得分散點(diǎn)圖。t[1]代表主成分1,t[2]代表主成分2,橢圓代表95%置信區(qū)間。同一顏色的點(diǎn)表示組內(nèi)的各個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2.5.2正交偏最小二乘判別分析

由于采用PCA-X建模不能完全將新舟青椒與峨眉山藤椒、遵義大木椒和江口青椒區(qū)分開(kāi),而正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis,OPLS-DA)是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計(jì)方法,增加正交矯正之后會(huì)使得數(shù)據(jù)檢出的假陽(yáng)性降低,在OPLS-DA得分圖上有兩種主成分,即預(yù)測(cè)主成分和正交主成分。OPLS-DA將組間差異最大化地反映在t[1]上,所以從t[1]上能直接區(qū)分組間變異,而在正交主成分to[1]上則反映了組內(nèi)的變異,比主成分分析更準(zhǔn)確。

從圖5可以看出,新舟青椒與峨眉山藤椒(圖5A-1)、新舟青椒與遵義大木椒(圖5B-1)、新舟青椒與江口青椒(圖5C-1)樣品均能明顯的分開(kāi),說(shuō)明不同品種青花椒存在較大差異,而組內(nèi)3次生物學(xué)重復(fù)散點(diǎn)較集中,表明組內(nèi)差異較小。

注:第1列為新舟青椒與峨眉山藤椒OPLS-DA得分圖(A-1)和模型驗(yàn)證圖(A-2);第2列為新舟青椒與遵義大木椒OPLS-DA得分圖(B-1)和模型驗(yàn)證圖(B-2);第3列為新舟青椒與江口青椒OPLS-DA得分圖(C-1)和模型驗(yàn)證圖(C-2)。

2.5.3OPLS-DA置換檢驗(yàn)

為分析不同品種青花椒代謝物的差異,采用OPLS-DA模型對(duì)4個(gè)不同品種青花椒果皮中的差異代謝物進(jìn)行了分析,模型擬合參數(shù)見(jiàn)表2。采用R2Y

表2 正離子模式下OPLS-DA模型的評(píng)價(jià)參數(shù)

和Q2對(duì)OPLS-DA模型進(jìn)行了評(píng)估,其中,R2Y代表模型的擬合能力,Q2代表預(yù)測(cè)能力。三組結(jié)果的R2Y均為1,Q2>0.5,說(shuō)明模型穩(wěn)定可靠,預(yù)測(cè)能力好。繼續(xù)對(duì)模型進(jìn)行了N=200的置換檢驗(yàn)(圖5A-2、B-2、C-2),正負(fù)離子模式下的3個(gè)原模型R2Y均接近1,說(shuō)明模型擬合效果較好。在正負(fù)離子模式下置換檢驗(yàn)隨機(jī)模型的Q2值均小于原模型的Q2值,正離子模式下Q2的回歸線與縱軸的截距小于零,說(shuō)明原模型穩(wěn)健性較好,不存在過(guò)擬合現(xiàn)象。

2.5.4不同品種青花椒差異代謝物的篩選

為篩選不同品種青花椒中顯著性的差異代謝物,以O(shè)PLS-DAVIP>1和p<0.05作為評(píng)價(jià)指標(biāo),篩選顯著性差異代謝物。經(jīng)過(guò)篩選和統(tǒng)計(jì)分析,本實(shí)驗(yàn)共篩選出90種差異代謝物(表3、表4),其中正離子模式的顯著性差異代謝物有39種,負(fù)離子模式的顯著性差異代謝物51種,共有的差異代謝物有7種,分別是:

表3 正離子模式下差異代謝產(chǎn)物及變化趨勢(shì)

表4 負(fù)離子模式下差異代謝產(chǎn)物及變化趨勢(shì)

N-甲基酪胺(N-Methyltyramine)、1-吲哚酮(1-Indanone)、茉莉內(nèi)酯(Jasmine lactone)、樟腦(Camphor)、香葉木素(Diosmetin)、L-哌啶酸(L-Pipecolic acid)、半乳糖酸(Galactonic acid)。為簡(jiǎn)單、直觀地表現(xiàn)差異代謝物的變化情況,進(jìn)一步繪制了組間具有顯著差異的代謝物變化的FC圖(圖6)。圖中橫坐標(biāo)表示差異表達(dá)倍數(shù),紅色表示上調(diào),綠色表示下調(diào),縱坐標(biāo)表示顯著性差異代謝物,從圖6可知,組間差異代謝物種類及表達(dá)情況存在差異,提示與青花椒的品種密切相關(guān)。

2.6 層次聚類分析

為更好地了解不同品種青花椒之間代謝物的差異,通過(guò)聚類熱圖分析對(duì)不同品種青花椒中的差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)圖7。從圖中條帶可以看出,不同品種青花椒中都有明確的高表達(dá)或者低表達(dá)的區(qū)域,可以根據(jù)表達(dá)情況區(qū)分不同品種青花椒。新舟青椒與峨眉山藤椒相比,有32種化合物的含量高表達(dá)(圖7A-1、A-2),新舟青椒與遵義大木椒相比,有18種化合物的含量高表達(dá)(圖7B-1、B-2),新舟青椒與江口青椒相比,有13種化合物的含量高表達(dá)(圖7C-1、C-2)。在3個(gè)比較組中,新舟青椒(Zb005)代謝物的含量均表現(xiàn)出高表達(dá)的化合物有4種,分別為:1-吲哚酮(1-Indanone)、樟腦(Camphor)、茉莉內(nèi)酯(Jasmine lactone)和香葉木素(Diosmetin),這提示新舟青椒(Zb005)口感較其他幾種青椒品種較好的原因。

注:第1列為新舟青椒與峨眉山藤椒代謝物的比較;第2列為新舟青椒與遵義大木椒代謝物的比較;第3列為新舟青椒與江口青椒代謝物的比較。其中A-1、B-1、C-1為正離子模式,A-2、B-2、C-2為負(fù)離子模式。橫坐標(biāo)為各組青花椒樣本編號(hào),縱坐標(biāo)為已具有顯著性差異的代謝物,顏色表示含量的變化趨勢(shì),紅色表示含量高表達(dá),藍(lán)色色表示含量低表達(dá)。

2.7 差異代謝物的相關(guān)分析

相關(guān)性分析有助于測(cè)量不同具有顯著性差異代謝物之間的代謝接近度(VIP>1,p<0.05),并有助于了解生物狀態(tài)變化過(guò)程中代謝物之間的相互調(diào)節(jié)。圖8為不同品種青花椒中90種顯著差異代謝物的相關(guān)分析結(jié)果。紅色表示正相關(guān),藍(lán)色表示負(fù)相關(guān),顏色深淺與相關(guān)性系數(shù)的絕對(duì)值大小有關(guān),即正相關(guān)或負(fù)相關(guān)的程度越高,顏色越深,點(diǎn)的大小與相關(guān)性的顯著性有關(guān),越顯著,p值越小,點(diǎn)越大。由圖8可知,各品種青花椒中的顯著性差異代謝物之間存在較好的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)性。

注:第1行為新舟青椒與峨眉山藤椒差異代謝物的相關(guān)性熱圖;第2行為新舟青椒與遵義大木椒差異代謝物的相關(guān)性熱圖;第3行為新舟青椒與江口青椒差異代謝物的相關(guān)性熱圖。其中A-1、B-1、C-1為正離子模式,A-2、B-2、C-2為負(fù)離子模式。

2.8 差異代謝物的KEGG通路注釋與分析

在生物體內(nèi),不同代謝物之間的相互協(xié)調(diào)作用使得生物體具有相應(yīng)的功能,通過(guò)對(duì)生物體重KEGG通路的詳細(xì)分析更有助于了解不同生物在代謝組水平上的生物學(xué)功能。如圖9所示,新舟青椒與峨眉山藤椒相比(圖9A),差異代謝物主要富集在代謝途徑(Metabolic pathways)、2-氧代環(huán)戊烷羧酸甲脂代謝(2-Oxocarboxylic acid metabolism)、各種次生代謝產(chǎn)物的生物合成(Biosynthesis of various secondary metabolites)、氨基酸生物合成(Biosynthesis of amino acids)、氰基氨基酸代謝(Cyanoamino acid metabolism)、二元組分系統(tǒng)(Two-component system)。新舟青椒與遵義大木椒相互比較中的代謝通路結(jié)果中發(fā)現(xiàn)(圖9B),差異代謝物主要富集的代謝通路為代謝途徑、碳代謝(Carbon metabolism)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)(ABC transporters)、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)換(Pentose and glucuronate interconversions)、二元組分系統(tǒng)、酪氨酸代謝(Tyrosine metabolism)。新舟青椒)與江口青椒(Zb0010)相比(圖9C),差異代謝物主要富集在代謝途徑、2-氧代環(huán)戊烷羧酸甲脂代謝、氨基酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝(Arginine and proline metabolism)、酪氨酸代謝(Tyrosine metabolism)、碳代謝。

3 結(jié)論與討論

花椒是一種常用的香料,其種類繁多,廣泛分布于我國(guó)各地,且資源豐富。其獨(dú)特的香味和麻味來(lái)自于內(nèi)部的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),且含有大量的活性化學(xué)成分,包括揮發(fā)油[18]、酰胺類物質(zhì)[19]、生物堿[20]、香豆素[21]、木脂素[22]和脂肪酸[23-24]等。

本研究通過(guò)超高效液相色譜結(jié)合四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)供試4種青花椒進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析,結(jié)合單變量統(tǒng)計(jì)分析和多元統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行組間差異分析,篩選出差異代謝物,再通過(guò)層次聚類、相關(guān)性分析和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋差異代謝物參與的代謝途徑,從中篩選出關(guān)鍵代謝物,以期為篩選青花椒優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源提供理論基礎(chǔ),為從多組學(xué)研究花椒遺傳多樣性提供理論依據(jù),同時(shí)為花椒加工提供現(xiàn)實(shí)依據(jù)。

4種青花椒中,鑒定出正、負(fù)離子模式下差異顯著的代謝物共131種,正離子模式54種,負(fù)離子模式77種。對(duì)這些差異代謝物進(jìn)行化學(xué)分類歸屬信息的統(tǒng)計(jì)后,發(fā)現(xiàn)占比最大的是有機(jī)酸及其衍生物(16.11%),其次是有機(jī)氧化合物(14.44%)。在正離子模式下,新舟青椒與峨眉山藤椒存在24種顯著的差異代謝物,新舟青椒與遵義大木椒存在17種差異代謝物,新舟青椒與江口青椒存在13種差異代謝物。對(duì)所有的差異代謝物進(jìn)行篩選后,發(fā)現(xiàn)有7種共有的差異代謝物,分別為N-甲基酪胺、1-吲哚酮、茉莉內(nèi)酯、樟腦、香葉木素、L-哌啶酸、半乳糖酸(圖6),這些代謝物的表達(dá)情況存在差異,提示與青花椒的品種密切相關(guān)。

為深入理解這4種青花椒之間代謝物的差異,通過(guò)層次聚類熱圖對(duì)其進(jìn)行分析(圖7),發(fā)現(xiàn)在3個(gè)比較組中(Zb005 vs Zb003、Zb005 vs Zb004、Zb005 vs Zb0010),新舟青椒(Zb005)的含量表現(xiàn)出比其他幾種青椒更高表達(dá)的化合物有4種(1-吲哚酮、樟腦、茉莉內(nèi)酯和香葉木素),這可能是遵義本地青椒(新舟青椒)

注:A為新舟青椒與峨眉山藤椒比較組中代謝通路富集分析;B為新舟青椒與遵義大木椒 比較組中代謝通路富集分析;C為新舟青椒與江口青椒。柱狀圖中縱軸代表各KEGG代謝通路,橫軸表示各KEGG代謝通路中包含的差異表達(dá)代謝物數(shù)目。顏色表示富集分析的p值,顏色越深p值越小,富集程度越顯著。 圖9 KEGG通路富集分析

口感較其他幾種青椒好的原因。

氨基酸在植物初級(jí)代謝中扮演著不可或缺的角色,對(duì)于植物的生理過(guò)程具有重要的作用[25]。而糖和有機(jī)酸則作為植物構(gòu)建碳骨架和提供能量的必要代謝資源[26-28],同時(shí)也是影響花椒風(fēng)味的重要因素。脂類是細(xì)胞膜的主要成分,在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜運(yùn)輸和細(xì)胞骨架重排等細(xì)胞功能中擔(dān)任多重任務(wù),同時(shí)也是香氣組分的重要前體物質(zhì)[29-30]。此外,花椒中獨(dú)特的揮發(fā)性香味物質(zhì)和芳香化合物也是花椒風(fēng)味的重要組成部分,這些代謝物質(zhì)的含量和組成對(duì)花椒的質(zhì)量和口感具有重要影響[31]。經(jīng)多元統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)現(xiàn)各個(gè)青花椒樣品之間的代謝物有明顯的差異,呈現(xiàn)出明顯的聚集區(qū),表明這些品種的代謝物存在一定差異。對(duì)發(fā)現(xiàn)的差異代謝物進(jìn)行KEGG通路的注釋和分析后,發(fā)現(xiàn)代謝途徑、碳代謝、糖類物質(zhì)代謝及氨基酸代謝等途徑是主要的焦點(diǎn)。其中,大部分的代謝物與糖類代謝有關(guān),由此可見(jiàn),糖類物質(zhì)的代謝對(duì)青花椒的品質(zhì)有較大影響。

綜上所述,該研究從植物代謝組學(xué)角度初步揭示了不同品種青花椒的代謝產(chǎn)物差異性以及特征化合物,為青花椒的精深加工以及優(yōu)良種質(zhì)資源的篩選提供了一定的理論基礎(chǔ)。