基于ISSR標(biāo)記的蜂糖李親緣關(guān)系分析

麥鵬坤, 鄭乾明, 趙雅楠, 張 敏, 馬玉華

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院,山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心, 貴陽(yáng) 550025;2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)科學(xué)研究所, 貴陽(yáng) 550006)

蜂糖李(Prunussalicina'Fengtangli')為薔薇科(Rosaceae)李亞科(Prunoideae)李屬(Prunus)植物,蜂糖李肉質(zhì)細(xì),清脆爽口,汁液中多,味濃甜,離核,品質(zhì)優(yōu)異,是貴州名特優(yōu)水果[1],由貴州省安順市本地李子優(yōu)株選育而成,起源于貴州省安順市鎮(zhèn)寧縣六馬鎮(zhèn)。2017年,蜂糖李被評(píng)為中國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品[2],同年,“鎮(zhèn)寧蜂糖李”在第四屆全國(guó)優(yōu)質(zhì)李鑒評(píng)大會(huì)上獲得評(píng)審專(zhuān)家的一致好評(píng),被評(píng)為“全國(guó)優(yōu)質(zhì)李金獎(jiǎng)”。蜂糖李作為貴州獨(dú)特的地方李品種,因其果實(shí)風(fēng)味濃郁,且?guī)в歇?dú)特的香氣而具有較高的商品價(jià)值?，F(xiàn)貴州省種植面積約3.67萬(wàn)hm2,安順?lè)N植面積1.4萬(wàn)hm2,投產(chǎn)面積5 580 hm2[1],并推廣到廣西、四川等省(區(qū))。隨著蜂糖李種植面積的迅速擴(kuò)大,種苗生產(chǎn)混亂、接穗來(lái)源異質(zhì)化,果苗質(zhì)量得不到保障,果實(shí)品質(zhì)參差不齊,對(duì)蜂糖李產(chǎn)業(yè)造成不利影響。因此,對(duì)貴州蜂糖李進(jìn)行DNA分子標(biāo)記技術(shù)研究,開(kāi)展貴州蜂糖李種質(zhì)資源保護(hù)和培育優(yōu)異品系研究十分重要。

DNA分子標(biāo)記具有變異位點(diǎn)豐富、遺傳穩(wěn)定、多態(tài)性高和受環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn),因而被廣泛應(yīng)用于物種種質(zhì)鑒定、物種遺傳多樣性分析、品種親緣關(guān)系鑒定、指紋圖譜的構(gòu)建等領(lǐng)域[3]。分子標(biāo)記中ISSR是簡(jiǎn)便、快速、易行的分子標(biāo)記技術(shù)[4],引物的設(shè)計(jì)流程簡(jiǎn)單,既無(wú)需知道擴(kuò)增位點(diǎn)的信息,又具有比RPAD標(biāo)記更強(qiáng)的可重復(fù)性[5-6]。近年來(lái),ISSR標(biāo)記已在李屬植物遺傳多樣性研究中得到了廣泛應(yīng)用。經(jīng)建永等[7]以22份野生歐洲李為材料,利用ISSR對(duì)其種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性研究,為歐洲李野生種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)和保護(hù)提供了科學(xué)的理論依據(jù)。方智振等[8]利用ISSR分子標(biāo)記區(qū)分了寧岡和福建芙蓉李,并建立了寧岡芙蓉李與福建芙蓉李的ISSR指紋圖譜,為芙蓉李的種質(zhì)利用提供了依據(jù)。目前,基于ISSR分子標(biāo)記的貴州蜂糖李遺傳多樣性分析未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道,可見(jiàn)對(duì)其分子水平的研究相對(duì)滯后。本研究基于ISSR分子標(biāo)記技術(shù),對(duì)采自鎮(zhèn)寧縣等5個(gè)地區(qū)的52份蜂糖李種質(zhì)進(jìn)行親緣關(guān)系分析,遺傳多樣性評(píng)價(jià),為今后蜂糖李新種質(zhì)的培育與資源的保存提供參考和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用的52份蜂糖李材料采自貴州省5個(gè)不同區(qū)(縣)(見(jiàn)表1),于2022年7月中旬由同一實(shí)驗(yàn)者取樣,采集完整無(wú)損傷幼嫩葉片分別置于對(duì)應(yīng)的采集袋內(nèi),低溫下帶回實(shí)驗(yàn)室,-80 ℃超低溫冰箱保存,用于后續(xù)基因組DNA提取。

表1 用于ISSR分子標(biāo)記的52份蜂糖李種質(zhì)材料

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蜂糖李基因組DNA的提取

通過(guò)植物基因組DNA提取試劑盒DP320(北京,天根,提取方法見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū))提取52份供試材料幼嫩葉片DNA后,根據(jù)1%瓊脂糖凝膠電泳圖,篩選出條帶清晰、質(zhì)量達(dá)標(biāo)的DNA,用于后續(xù)群體遺傳分析。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)量及濃度后,將DNA稀釋至約40 ng/μL,置于-20 ℃保存防止DNA降解,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2引物合成與篩選

選擇實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有已合成的(University of British Columbia公布的)100條 ISSR 引物(上海生工生物工程公司合成),使用蜂糖李編號(hào)為1,3,4,7,9,10,17,34的樣品基因組為模板,獲得10條重復(fù)性好且多態(tài)性高的引物用于本研究材料的分析。且進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)的多重因素比較。最終優(yōu)化的ISSR PCR體系的總體積為10 μL,其中含5 μL 天根2×TaqPCR Master Mix Ⅱ、0.8 μL 引物(0.8 μM)、1.2 μL(40 ng/μL)模板DNA,用ddH2O補(bǔ)足至總體積10 μL。ISSR擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)[9]的方法并稍作修改:94 ℃預(yù)變性5 min;后經(jīng)94 ℃變性45 s,50.7～57.9 ℃引物退火45 s,72 ℃延伸1 min,共計(jì)循環(huán)40次;最后72 ℃延伸10 min;擴(kuò)增后的產(chǎn)物4 ℃保存。產(chǎn)物由2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),電泳液為1×TAE,用DL2000 Marker為DNA分子量參照標(biāo)準(zhǔn),電泳電壓設(shè)為180 V,電泳時(shí)間30 min,利用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)記錄電泳的結(jié)果。

1.2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每條ISSR引物實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,僅統(tǒng)計(jì)每條引物擴(kuò)增出來(lái)的清晰且能重復(fù)出現(xiàn)的條帶。在位點(diǎn)處存在擴(kuò)增條帶的記為“1”,沒(méi)有則記為“0”。最后獲得供試樣本對(duì)應(yīng)每個(gè)引物的0/1數(shù)據(jù)矩陣。通過(guò)Popgene32[10]軟件計(jì)算遺傳多樣性指數(shù),其中包括等位基因數(shù)量(Na),有效等位基因數(shù)量(Ne),Nei's基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon's信息指數(shù)(I)。PIC_CALC軟件計(jì)算多態(tài)性信息含量(Polymorphism Information Content PIC)。使用NTSYS2.10根據(jù)非加權(quán)平均法UPGMA對(duì)供試種質(zhì)進(jìn)行聚類(lèi)分析。并利用iTOL(https://itol.embl.de/)進(jìn)行聚類(lèi)圖美化。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂糖李DNA檢測(cè)

利用試劑盒提取的52份供試樣本的基因組DNA,部分基因組DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。DNA電泳條帶距上樣孔較近,且條帶明亮清晰,不存在拖尾、降解等現(xiàn)象。使用全波長(zhǎng)掃描型酶標(biāo)儀測(cè)定所提DNA樣品的OD260/OD280值及濃度。結(jié)果顯示,所提DNA的OD260/OD280值在1.75～1.93之間,濃度在85～457 ng/μL之間,表明提取的DNA質(zhì)量較高,可作為分子標(biāo)記的DNA模板,將DNA模板統(tǒng)一稀釋至40 ng/μL用于研究。

注:M為2 000 bp Marker,1～14與表1樣品編號(hào)相同。

2.2 ISSR引物篩選

利用100條ISSR引物對(duì)8個(gè)隨機(jī)挑選的蜂糖李DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增,獲得在8份模板中能擴(kuò)增出條帶的35條ISSR引物,并對(duì)35條ISSR引物進(jìn)行復(fù)篩。最終篩選出10條擴(kuò)增位點(diǎn)清晰、可重復(fù)性好的引物,用于52份蜂糖李種質(zhì)的PCR擴(kuò)增。余下的ISSR引物因無(wú)法擴(kuò)增出位點(diǎn)或者擴(kuò)增出的位點(diǎn)不具有多肽性而被舍棄。所篩選出來(lái)的10條ISSR引物的信息詳見(jiàn)表2,部分引物篩選的電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2中部分引物擴(kuò)增出的位點(diǎn)出現(xiàn)模糊不清晰,或無(wú)擴(kuò)增位點(diǎn)的現(xiàn)象,具體原因可能是設(shè)定的PCR擴(kuò)增的退火溫度沒(méi)有達(dá)到實(shí)驗(yàn)引物的最適退火溫度,或者是所選引物在擴(kuò)增模板中的特異性較低。在后面的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,通過(guò)對(duì)試驗(yàn)引物進(jìn)行多次的PCR擴(kuò)增體系調(diào)整、優(yōu)化以及對(duì)部分引物進(jìn)行舍棄,可以有效避免上述情況的出現(xiàn)。

表2 用于供試樣品鑒定的10條ISSR引物信息

2.3 ISSR標(biāo)記引物多態(tài)性分析

將篩選出的10條ISSR引物分別對(duì)52份蜂糖李材料的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn),經(jīng)脂糖電泳后,統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。10條引物共擴(kuò)增出76個(gè)位點(diǎn),平均每條引物擴(kuò)增7.6個(gè),其中多態(tài)性位點(diǎn)有73個(gè),平均多態(tài)性位點(diǎn)比率為96.05%,UBC842與UBC856擴(kuò)增最多,達(dá)10個(gè),UBC834擴(kuò)增最少,僅6個(gè)。每條引物的多態(tài)性信息量在0.721 6～0.860 3之間,均值0.802 2,等位基因數(shù)在1.625 0～2.000 0之間,均值1.888 9,有效等位基因數(shù)在1.324 4～1.696 5之間,均值1.509 3,Nei's基因多樣性指數(shù)在0.221 4～0.391 6之間,均值0.300 4,Shannon's信息指數(shù)在0.336 5～0.571 4之間,均值0.452 3。結(jié)果表明,篩選獲得的10條ISSR引物的綜合表現(xiàn)較好,適合進(jìn)行蜂糖李種質(zhì)親緣關(guān)系和遺傳多樣性評(píng)價(jià),能有效區(qū)分供試種質(zhì)。引物UBC880、UBC899的部分電泳結(jié)果如圖3所示。

注:M為2 000 bp Marker,1～24與表1編號(hào)相同。

表3 10條ISSR引物在52份蜂糖李種質(zhì)的擴(kuò)增結(jié)果

2.4 聚類(lèi)分析

利用最終篩選出的10條核心引物,統(tǒng)計(jì)52份蜂糖李種質(zhì)在篩選的10條ISSR引物擴(kuò)增位點(diǎn)的數(shù)據(jù),利用NTSYS2.10e軟件計(jì)算52份蜂糖李供試種質(zhì)的DICE遺傳相似性系數(shù),并對(duì)52個(gè)個(gè)體進(jìn)行聚類(lèi)分析(圖4),以遺傳相似系數(shù)0.683為閾值,52個(gè)樣品可以歸為3個(gè)類(lèi)群,從聚類(lèi)樹(shù)中可知,蜂糖李第一組共15份種質(zhì),其中10份種質(zhì)采自黔南州惠水縣,4份采自安順市紫云縣,1份采自六馬鎮(zhèn)。第二組共17份種質(zhì),14份種質(zhì)采自六馬鎮(zhèn),2份采自息烽縣,1份采自安順市紫云縣。第三組共20份種質(zhì),僅1份種質(zhì)采自六馬鎮(zhèn),其余19份種質(zhì)均采自紫云縣。52個(gè)蜂糖李種質(zhì)間的遺傳相似性系數(shù)在0.487～0.932之間,其中采自紫云縣的F6種質(zhì)和F7種質(zhì)親緣關(guān)系最近,相似性系數(shù)為0.932,采自惠水縣的FB種質(zhì)與F19種質(zhì)親緣關(guān)系最遠(yuǎn),遺傳相似系數(shù)僅為0.487?；谶z傳相似性系數(shù)和聚類(lèi)樹(shù)狀圖表明,聚類(lèi)結(jié)果呈現(xiàn)一定的地理規(guī)律性,即相同地區(qū)的大多數(shù)蜂糖李種質(zhì)聚為一類(lèi),但未完全按照地理來(lái)源分類(lèi)。表明52份蜂糖李種質(zhì)雖然具有不同程度的親緣關(guān)系及基因交流,但親緣關(guān)系最近的仍是相同地區(qū)的蜂糖李。

3 討 論

果樹(shù)類(lèi)植物多為多年生植物,育種周期相對(duì)其他植物較長(zhǎng)。因此,開(kāi)展對(duì)果樹(shù)類(lèi)植物的種質(zhì)資源遺傳多樣性分析顯得十分重要[11]。遺傳多樣性,一般指的是種群之間或種群內(nèi)部個(gè)體之間遺傳信息的總和,能夠反映出物種的遺傳背景、遺傳分化程度及育種潛力等,是研究物種起源與進(jìn)化的重要依據(jù),也是種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)利用及保護(hù)的基礎(chǔ)[12]。對(duì)種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行研究一直是育種工作者在研究中最為側(cè)重的方面,也是在培育新品種過(guò)程中研究者最為關(guān)注的參考指標(biāo)。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各類(lèi)植物種群的遺傳多樣性分析[13],例如ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已應(yīng)用于龍眼[14]、金花茶[15]、火龍果[16]、貴州大櫻桃[17]、柑橘[18]、櫻花[19]等植物的遺傳多樣性研究中,說(shuō)明ISSR的應(yīng)用已十分廣泛。蜂糖李雖然是貴州的一優(yōu)質(zhì)李品種資源,但是關(guān)于蜂糖李資源開(kāi)發(fā)利用的研究卻十分罕見(jiàn)。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)蜂糖李進(jìn)行遺傳多樣性方面的研究。

李作為銷(xiāo)量比較大的水果之一,對(duì)于李資源的遺傳多樣性方面的研究十分常見(jiàn)。魏瀟等[20]基于熒光毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)17份南方品種的李種質(zhì)資源進(jìn)行了多樣性分析,結(jié)果顯示,17份李種質(zhì)的平均Shannon's多樣性指數(shù)為1.709,認(rèn)為供試材料具有豐富的遺傳多樣性。結(jié)果與王紅林等[21]利用熒光毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)貴州省內(nèi)的16份李種質(zhì)資源進(jìn)行分析的結(jié)果相似(I=1.59),實(shí)驗(yàn)結(jié)果均明顯高于本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(I=0.452 3),這可能跟二者使用的檢測(cè)方法更為精密有關(guān)。陳紅和楊迤然[22]通過(guò)ISSR技術(shù)研究了45份貴州當(dāng)?shù)乩罘N質(zhì)資源和3份外來(lái)引進(jìn)品種的遺傳多樣性水平,結(jié)果顯示,48份李種質(zhì)資源的平均H值為0.345,平均I值為0.508,明顯高于本實(shí)驗(yàn)(H=0.300 4,I=0.452 3)的,原因可能是其研究的對(duì)象是不同品種李的遺傳多樣性,本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象是單一品種。孫琪等[23]利用ISSR標(biāo)記分析了30份歐李種質(zhì)資源,供試單株的Nei's遺傳多樣性指數(shù)為0.266 6,平均Shannon's信息多樣性指數(shù)為0.399 1,低于本研究的Nei's遺傳多樣性指數(shù)值和Shannon's信息多樣性指數(shù)值,均認(rèn)為這些李種具有較高的遺傳多樣性。目前在單一李品種內(nèi)的遺傳多樣性研究相對(duì)較少。Basilio等[24]通過(guò)ISSR標(biāo)記技術(shù)評(píng)價(jià)了29份同一品種的核心日本李種質(zhì)資源的遺傳多樣性,結(jié)果顯示,29份日本李種質(zhì)資源的平均Nei's遺傳多樣性指數(shù)為0.15,平均Shannon's多樣性指數(shù)為0.27;李興婷[25]通過(guò)ISSR標(biāo)記分析179份脆李,遺傳特征指標(biāo)如平均Nei's基因多樣性指數(shù)為0.086 6,平均Shannon's信息指數(shù)為0.156 7;經(jīng)永健[26]用ISSR分析了歐洲李種質(zhì),其中平均Nei's基因多樣性指數(shù)為0.147 0,平均Shannon's信息指數(shù)為0.220 2。以上結(jié)果均低于本研究通過(guò)10條ISSR引物分析52份蜂糖李的結(jié)果(H=0.300 4,I=0.452 3),且均認(rèn)為這些李品種遺傳多樣性水平較高。從側(cè)面證明了本研究供試52份蜂糖李具有較高的遺傳多樣性。

多態(tài)性信息量(PIC)也是評(píng)估基因變異程度的主要指標(biāo)之一[27]。本研究利用10條ISSR多態(tài)性引物對(duì)52份蜂糖李種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析,PIC平均值為0.802 2,大于0.5,表明位點(diǎn)具有高度多態(tài)性。綜合分析表明,篩選出的ISSR引物在單一品種中也具有較高水平的變異檢測(cè)能力?？捎糜诤罄m(xù)的蜂糖李間遺傳多樣性研究,為開(kāi)展蜂糖李種質(zhì)資源利用和保護(hù)提供分子生物學(xué)依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)52份不同產(chǎn)地的蜂糖李種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析,10條引物共擴(kuò)增出76個(gè)位點(diǎn),其中多態(tài)性位點(diǎn)73個(gè),占總位點(diǎn)的96.05%,引物的多態(tài)性信息量(PIC)在0.721 6～0.860 3之間,均值0.802 2,等位基因數(shù)(Na)在1.625 0～2.000 0之間,均值1.888 9,有效等位基因數(shù)(Ne)在1.324 4～1.696 5之間,均值1.509 3,Nei's基因多樣性指數(shù)(H)在0.221 4～0.391 6之間,均值0.300 4,Shannon's信息指數(shù)(I)在0.336 5～0.571 4之間,均值0.452 3,遺傳相似性系數(shù)在0.487～0.932之間,表明蜂糖李遺傳信息豐富,以遺傳相似系數(shù)0.683為閾值,52個(gè)樣品可以歸為3個(gè)類(lèi)群,3個(gè)類(lèi)群均未完全按照地理來(lái)源分類(lèi),但是3個(gè)類(lèi)群中絕大部分種質(zhì)來(lái)源于同一地區(qū),在一定程度上體現(xiàn)了供試種質(zhì)地理來(lái)源的相似性。綜合研究結(jié)果表明,篩選出的ISSR 引物在研究蜂糖李的遺傳多樣性上可行的,可在分子水平上為蜂糖李種質(zhì)資源的保存和利用提供參考,同時(shí)為蜂糖李優(yōu)良品種選育提供科學(xué)依據(jù)。