茶樹CsC7蛋白異源表達(dá)及抗真菌活性分析

曹 瑞, 姜看文, 趙懿琛,2, 陸瑩霞, 彭 磊, 董 旋,2

(1.貴州大學(xué)茶學(xué)院, 貴陽 550025;2.山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴陽 550025)

茶樹(Camelliasinensis)起源于中國(guó)西南部,是一種全球廣泛種植的經(jīng)濟(jì)作物。茶與咖啡、可可并稱為三大無酒精飲料,具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。因?yàn)椴铇渲饕L(zhǎng)于熱帶、亞熱帶和溫帶,且生性喜濕熱,所以在生長(zhǎng)過程中不可避免地遭受外來因素的影響。而茶樹病害是對(duì)茶樹生產(chǎn)造成不良影響的重要因素之一,特別是我國(guó)作為全球最大的茶葉生產(chǎn)國(guó)[2],因?yàn)楦呙芏确N植和農(nóng)藥的濫用,已導(dǎo)致茶樹病害頻繁發(fā)生,每年導(dǎo)致茶葉產(chǎn)量損失達(dá)10%～20%[3]。當(dāng)前茶樹的病害主要采用化學(xué)藥劑進(jìn)行防治,但這種方法容易影響茶葉的品質(zhì),并且一些殘留的化學(xué)藥劑很容易造成食品安全隱患,同時(shí)也不利于茶葉進(jìn)出口貿(mào)易的發(fā)展,為解決這些問題,開發(fā)植物免疫激活劑、殺菌劑和殺蟲劑等高效低毒及環(huán)境友好的綠色農(nóng)藥,以推動(dòng)茶產(chǎn)業(yè)向綠色健康發(fā)展。

幾丁質(zhì)酶是一種重要的植物病程相關(guān)蛋白。幾丁質(zhì)酶在植物中的抗真菌作用已在許多研究中得到證實(shí)[4-7],過表達(dá)幾丁質(zhì)酶編碼基因的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)真菌和細(xì)菌病原體的抗性增強(qiáng)[8-11]。一些植物幾丁質(zhì)酶分別通過對(duì)幾丁質(zhì)和肽聚糖的裂解作用(溶菌酶作用)參與植物防御真菌和細(xì)菌病原體的機(jī)制[12-13],并顯示出對(duì)幾種植物病原真菌的體外抗真菌特性,單獨(dú)或與其他病程相關(guān)蛋白協(xié)同抑制孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)[14-16]。幾丁質(zhì)酶在生物技術(shù)應(yīng)用中具有巨大的潛力,例如在制備具有藥學(xué)重要性的甲殼低聚糖和N-乙?；鵇-葡萄糖胺方面,是有前途的抗菌劑、溶菌酶誘導(dǎo)劑和免疫增強(qiáng)劑;開發(fā)害蟲和病原體以及抗病轉(zhuǎn)基因植物的生物控制劑[17-18]。

迄今為止,來自不同物種的幾丁質(zhì)酶已經(jīng)在大腸桿菌BL21[19]和畢赤酵母[20]中表達(dá)。研究人員正在努力使用畢赤酵母等異源表達(dá)系統(tǒng)來增加幾丁質(zhì)酶的表達(dá)水平[21]。畢赤酵母是第二大蛋白表達(dá)系統(tǒng),由于巴斯德畢赤酵母AOX1啟動(dòng)子強(qiáng)且受嚴(yán)格調(diào)控,因此適合高水平表達(dá)目的蛋白。此外,目的蛋白將被有效地分泌到細(xì)胞外,簡(jiǎn)化了后續(xù)的純化過程。最后,巴斯德畢赤酵母可用于大規(guī)模高密度發(fā)酵。數(shù)千種蛋白質(zhì)已在畢赤酵母中成功表達(dá),它是生產(chǎn)重組蛋白的常用表達(dá)系統(tǒng),在畢赤酵母中表達(dá)為重組酶的幾丁質(zhì)酶可以作為糖基化或糖基化變體生產(chǎn)[22-23]。

基于本實(shí)驗(yàn)室前期研究,不同抗性的茶樹品種在接種茶餅病病原菌(壞損外擔(dān)菌)后,茶樹幾丁質(zhì)酶編碼基因(CsC7)相對(duì)表達(dá)量顯著提高。因此,本研究擬通過畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)茶樹CsC7蛋白,同時(shí)對(duì)該蛋白做抑菌活性分析,以期獲得有效的CsC7蛋白抑制劑,為研發(fā)防治茶樹真菌病害的綠色農(nóng)藥提供理論依據(jù),同時(shí)為抗真菌病害茶樹品種的選育提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌株、質(zhì)粒和試劑

“梅占”(編號(hào)GS13004—1985)采自安順市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院;質(zhì)粒pPICZαA、畢赤酵母X-33菌株、大腸桿菌(Escherichiacolistrain)DH5α購(gòu)于北京擎科生物科技有限公司。尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、厚孢鐮刀菌(Fusariumchlamydosporum)、灰霉菌(Botrytiscinerea)、白樺茸擔(dān)子菌(Inonotusobliquus)、脆弱毛霉菌(Mucorfragilis)、枯葉格孢腔菌(Pleosporaherbarum)、赤星菌(Alternariaalternata)均來自貴州大學(xué)茶學(xué)院茶生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室分離保存的菌種。

1.2 基因克隆

稱取“梅占”健康頂芽100 mg,加入液氮充分研磨至無成塊的植物組織。使用植物RNA提取試劑盒(DNase I) (ComWin Biotech,Jiangsu) 根據(jù)說明書提取總RNA,RNA 的質(zhì)量用Nano Drop儀進(jìn)行檢測(cè),使用GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit (Tsingke Biotechnology, Beijing) 從5 μg總RNA中獲得第一鏈cDNA?；谠瓶?0號(hào)茶樹的基因組數(shù)據(jù)的CsC7序列(登錄號(hào):TEA002526.1),使用DNAMAN-8軟件設(shè)計(jì)CsC7基因的特異性引物F1:ATGTCTCCAAAACAACCTCATTC和R1:TCAAACATTG CTCTTAATGCTAG,用于以cDNA為模板進(jìn)行目的基因的克隆。使用ExTaqTM聚合酶混合物(Takara Biomedical Technology,Beijing)在含有21.5 μL ddH2O、1.5 μL第一鏈cDNA、基因特異性引物 (CsC7-F1、CsC7-R1)各1 μL (20 μmol/L)和25 μL ExTaq聚合酶混合物的反應(yīng)混合物中進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。PCR程序設(shè)置為98 ℃下持續(xù)10 s,55 ℃持續(xù)30 s 和72 ℃ 3 min。PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖/GelRed凝膠上檢測(cè),并使用EZNA凝膠提取試劑盒(Omega Bio-Tek,Norcross,USA)純化相應(yīng)的DNA條帶。該產(chǎn)物與pGEM-T Easy Vector((Promega Corporation,Madison,USA)連接,在大腸桿菌DH5α中擴(kuò)增并進(jìn)行測(cè)序。使用Serial Cloner 1-3進(jìn)行序列分析,以確定CsC7序列。所有引物均由擎科生物科技公司重慶分公司合成。

1.3 CsC7蛋白生物信息學(xué)分析

使用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)信號(hào)肽、NetNGlyc (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預(yù)測(cè)糖基化位點(diǎn)、TMHMM(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域,使用在線網(wǎng)站ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)理化性質(zhì),使用ProtScale(http://web.expasy.org/ProScale)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的疏水性。

1.4 密碼子優(yōu)化及pPICZαA-CsC7質(zhì)粒的構(gòu)建

通過對(duì)CsC7進(jìn)行生物信息學(xué)分析,需將CsC7蛋白所含信號(hào)肽切除,即去掉前27個(gè)氨基酸,根據(jù)巴斯德畢赤酵母的密碼子偏好性(http://www.kazusa.or.jp/codon)對(duì)重組蛋白基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化,避開SacI酶切位點(diǎn),用巴斯德畢赤酵母中的高頻密碼子替換CsC7中的相應(yīng)密碼子;基因合成至 pPICZαA,目的基因緊挨著載體α-factor,C端帶上6個(gè)氨基酸His標(biāo)簽(CTCGAGAAAAGACACATCATCATCATCAT)。將所得重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-CsC7最終轉(zhuǎn)化為大腸桿菌E.coliDH5α,并在含有25 μg/mL博萊霉素的LB瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)16 h。首先使用設(shè)計(jì)的引物pPICZα-F:GACTGGTTCCAATTGACAAGC和pPICZα-R:GCAAATGGCATTCTGACATCC通過PCR鑒定陽性pPICZαA-CsC7質(zhì)粒克隆,并測(cè)序確認(rèn)陽性質(zhì)粒,然后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33。

1.5 畢赤酵母轉(zhuǎn)化及蛋白表達(dá)純化

構(gòu)建的pPICZαA-CsC7質(zhì)粒通過SacI線性化,并通過電穿孔法 (GenePulser,Bio-Rad,USA)轉(zhuǎn)入畢赤酵母 X-33細(xì)胞[24]。在含有100 mg/L 博萊霉素的YPD(1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%瓊脂)平板上選擇轉(zhuǎn)化的單菌落進(jìn)行菌落PCR并測(cè)序鑒定后挑選7個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子表達(dá)小試,將最優(yōu)表達(dá)轉(zhuǎn)化子命名為CsC7-6。

250 mL 錐形瓶中加入 50 mL YPG 培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%蛋白胨、3%乙醇和3%甘油),接入最優(yōu)表達(dá)轉(zhuǎn)化子CsC7-6,30 ℃ 220 r/min培養(yǎng)至菌液飽和; 轉(zhuǎn)移到50 mL 離心管中,4 000 r/min離心5 min,棄上清; 用50 mL BMMY 培養(yǎng)基(1%酵母提取物,2%蛋白胨,100 mmol/L磷酸鉀,pH=6.0,1.34% YNB(不含氨基酸的酵母氮堿),0.005%生物素和0.5%甲醇)重懸菌體,轉(zhuǎn)移至新的250 mL無菌錐形瓶中,加入甲醇至終濃度0.5%(V/V),28 ℃ 220 r/min培養(yǎng)6 d;為了誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白的表達(dá),每24 h加入100%甲醇至終濃度為0.75%; 第6天上午收集菌液,4 000 r/min離心5 min,收集上清。

30 mL 的重力柱中填裝 5 mL Ni-NTA beads;用5 mL Lysis buffer(50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,10 mmol/L imidazole,pH=8.0,過濾除菌) 平衡柱子,重復(fù) 3 次; 50 mL 蛋白溶液分兩次過柱;加入10 mL Wash buffer (50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,20 mmol/L imidazole,pH=8.0,過濾除菌)進(jìn)行洗雜,重復(fù)5次;加入5 mL Elution buffer (50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,250 mmol/L imidazole,pH=8.0,過濾除菌)洗脫,即得到純化后蛋白并儲(chǔ)存在-80 ℃進(jìn)行進(jìn)一步分析。用 Western Blot 檢測(cè),蛋白質(zhì)濃度用BCA蛋白質(zhì)試劑盒(中國(guó)南京建成生物工程研究所有限公司)測(cè)定。

1.6 抗真菌活性測(cè)定

酵母純化蛋白按照體積比1∶1與PDA培養(yǎng)基混勻后倒入培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中,以不加入外源試劑PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。

將尖孢鐮刀菌、厚孢鐮刀菌、灰霉菌、白樺茸擔(dān)子菌、脆弱毛霉菌、枯葉格孢腔菌、赤星菌接種在PDA培養(yǎng)基上,25 ℃恒溫倒置暗培養(yǎng)7 d。用無菌打孔器取菌斑邊緣6 mm菌餅,接種于混有目的蛋白的PDA培養(yǎng)基中心位置,25 ℃恒溫倒置暗培養(yǎng),每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

采用“十字交叉法”測(cè)量菌落直徑并拍照記錄,根據(jù)生長(zhǎng)抑制率公式[25]計(jì)算生長(zhǎng)抑菌率。

抑菌率/%=[(對(duì)照組病原菌的直徑-處理組病原菌直徑)/對(duì)照組病原菌直徑]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsC7生物信息學(xué)分析

對(duì)CsC7編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè),結(jié)果顯示,該蛋白的分子式為C1463H2226N386O436S9,分子量為32 486.63 kD,等電點(diǎn)為8.42,不穩(wěn)定指數(shù)為41.41,總平均疏水指數(shù)為-0.140,脂肪族指數(shù)為80.86;用TMHMM Server v2.0軟件預(yù)測(cè)目標(biāo)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域,如圖1所示,目標(biāo)蛋白N端和C端都在細(xì)胞膜外部,因此CsC7蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)。

圖1 跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

應(yīng)用在線網(wǎng)站NetNGlyc預(yù)測(cè)目標(biāo)蛋白的糖基化位點(diǎn)數(shù)目,如圖2所示,目標(biāo)蛋白可能含有1個(gè)糖基化位點(diǎn),推測(cè)畢赤酵母工程菌分泌表達(dá)的CsC7蛋白分子量可能與預(yù)測(cè)的蛋白分子量有偏差。

圖2 糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

圖3 信號(hào)肽預(yù)測(cè)

使用SignaIP信號(hào)肽預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)目標(biāo)蛋白的信號(hào)肽。結(jié)果顯示,目標(biāo)蛋白含有1個(gè)信號(hào)肽,由于畢赤酵母表達(dá)載體自身含有1個(gè)α-分泌信號(hào)肽,因此要將目的蛋白的信號(hào)肽切除,即去掉前27個(gè)氨基酸。

2.2 CsC7基因密碼子優(yōu)化及載體構(gòu)建

本研究在去掉CsC7自身具有的信號(hào)肽后,不改變CsC7蛋白氨基酸序列的情況下,根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化了CsC7基因核苷酸序列。具體優(yōu)化位點(diǎn)所在位置見圖4紅色部分, 由金斯瑞生物科技有限公司將基因合成至 pPICZαA,目的基因緊挨著載體α-factor,C端帶上6個(gè)氨基酸His標(biāo)簽,載體示意圖如圖5所示。

圖4 畢赤酵母系統(tǒng)優(yōu)化后的CsC7基因序列及編碼氨基酸序列

圖5 CsC7畢赤酵母表達(dá)載體

注:M為DNA Maker(5 000 bp);1為線性化前質(zhì)粒;2為線性化后質(zhì)粒。

2.3 酵母工程菌構(gòu)建及篩選

將構(gòu)建完成的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SacI進(jìn)行線性化,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果如圖4所示,將含有CsC7基因的線性化重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33菌株,經(jīng)PCR篩選,圖7瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果說明,目的基因已整合到酵母染色體中。

注:M為DNA Maker(5 000 bp);1～8為不同克隆轉(zhuǎn)化子。

2.4 畢赤酵母重組蛋白的表達(dá)和純化

將PCR結(jié)果為陽性的單克隆菌落轉(zhuǎn)接后,待生長(zhǎng)濃度合適時(shí)誘導(dǎo), Western blot檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況,圖8檢測(cè)結(jié)果顯示蛋白分泌表達(dá),其中6號(hào)酵母轉(zhuǎn)化克隆子的蛋白表達(dá)效果最好,為了獲得大量純化的目的蛋白,將酵母轉(zhuǎn)化克隆子CsC7-6擴(kuò)大表達(dá)并進(jìn)行Ni-NTA beads純化,純化后用WB檢測(cè),結(jié)果(圖9)表明,蛋白樣品純化成功,未有其他雜帶。用BCA法測(cè)定其濃度(表1),在標(biāo)準(zhǔn)曲線上(圖10)計(jì)算出CsC7蛋白樣品經(jīng)過稀釋后的蛋白質(zhì)濃度為62 μg/mL,由稀釋倍數(shù)計(jì)算原CsC7純化蛋白質(zhì)濃度為150 μg/mL。

表1 蛋白濃度測(cè)定

注:M為Protein Marker;1～7為PCR檢測(cè)為陽性的菌落。其中用紅框標(biāo)注出的6號(hào)酵母轉(zhuǎn)化克隆子的蛋白表達(dá)效率最高,用于后續(xù)蛋白表達(dá)。

注: M為Protein Maker;1為流出液;2為純化蛋白;3為洗雜液;4為陽性對(duì)照牛血清蛋白。

圖10 蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線

注:A為脆弱毛霉菌;B為白樺茸擔(dān)子菌;C為尖孢鐮刀菌;D為赤星菌;E為灰霉菌;F為厚孢鐮刀菌;G為枯葉格孢腔菌。

2.5 CsC7蛋白異源表達(dá)及抗真菌活性測(cè)定

將脆弱毛霉菌、白樺茸擔(dān)子菌、尖孢鐮刀菌、赤星菌、灰霉菌、厚孢鐮刀菌、枯葉格孢腔菌等7種不同真菌分別接種在混有酵母異源表達(dá)CsC7純化蛋白和不加入外源試劑(對(duì)照)的PDA培養(yǎng)基中,不同真菌達(dá)到最高抑菌率的時(shí)間不同,結(jié)果顯示,培養(yǎng)2 d時(shí)對(duì)脆弱毛霉菌和灰霉菌的抑制率最高,分別為27.07%和32.23%;培養(yǎng)3 d時(shí)對(duì)尖孢鐮刀菌和厚孢鐮刀菌的抑制率最高,分別為39.21%和28.45%;培養(yǎng)4 d時(shí)對(duì)白樺茸擔(dān)子菌的抑制率最高,為21.90%;對(duì)赤星菌和枯葉格孢腔菌沒有顯著抑制作用。

3 討 論

植物生長(zhǎng)發(fā)育中可能受到各種病原菌侵害,進(jìn)而影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量。目前,主要使用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治[26],但化學(xué)農(nóng)藥在土壤中殘留時(shí)間長(zhǎng),對(duì)生態(tài)造成破壞,危及人類健康[27]。因此,為了自然環(huán)境及人類健康,尋找更健康的替代品成為當(dāng)務(wù)之急。

幾丁質(zhì)酶存在于細(xì)菌、真菌、昆蟲和植物等不同形式的生物體中,是一種具有降解真菌細(xì)胞壁作用的病程相關(guān)蛋白,當(dāng)植物(宿主)細(xì)胞處于病原體脅迫下時(shí),植物幾丁質(zhì)酶會(huì)強(qiáng)烈表達(dá),因此植物幾丁質(zhì)酶在對(duì)抗真菌病原體方面起著關(guān)鍵作用[28]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),不同抗性的茶樹品種在接種茶餅病病原菌(壞損外擔(dān)菌)后,茶樹幾丁質(zhì)酶CsC7相對(duì)表達(dá)量顯著提高,推測(cè)茶樹幾丁質(zhì)酶CsC7在茶樹抗真菌病害中扮演著重要角色。

在病原體攻擊期間,植物幾丁質(zhì)酶釋放出病原體反應(yīng)蛋白作為自我防御,在以往一些研究中已證實(shí)許多植物幾丁質(zhì)酶都具有潛在的抗真菌活性[29],如從烏頭葉豇豆(Vignaaconitifolia)中提取的幾丁質(zhì)酶可用于抑制真菌病原體[30],從尖葫蘆(Trichosanthesdioica)種子中提取的幾丁質(zhì)酶對(duì)黑曲霉和木霉均有抗真菌活性[31],使用純化的幾丁質(zhì)酶蛋白進(jìn)行微量滴定板測(cè)定中發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶對(duì)真菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)有抑制活性[32]。本研究通過使用酵母異源表達(dá)純化后的CsC7蛋白對(duì)脆弱毛霉菌、白樺茸擔(dān)子菌、尖孢鐮刀菌、赤星菌、灰霉菌、厚孢鐮刀菌、枯葉格孢腔菌7種真菌進(jìn)行抗菌活性分析,發(fā)現(xiàn)純化后的酵母異源表達(dá)蛋白CsC7對(duì)脆弱毛霉菌、白樺茸擔(dān)子菌、厚孢鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、灰霉菌有明顯抑制活性,這一研究結(jié)果表明,茶樹幾丁質(zhì)酶CsC7對(duì)多種茶樹真菌病害具有抑制作用,也為進(jìn)一步探究茶樹抗真菌病害分子機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

葉片病原體對(duì)植物的侵染涉及病原體滲透到內(nèi)部組織中,在那里它們從內(nèi)部細(xì)胞中獲取水和養(yǎng)分。各種細(xì)菌、卵菌和真菌利用氣孔開口作為主要的入侵途徑。作為對(duì)策,植物可以在感知到病原體時(shí)迅速關(guān)閉氣孔以限制其進(jìn)入。這種對(duì)氣孔關(guān)閉的控制,也稱為氣孔免疫,是植物先天免疫反應(yīng)之一[33-34]。高靜等[35]研究表明,葉面噴施酵母后,酵母能誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉。本實(shí)驗(yàn)通過在茶樹葉片表面噴施表達(dá)茶樹幾丁質(zhì)酶CsC7蛋白的畢赤酵母培養(yǎng)液,以酵母液體培養(yǎng)基為陰性對(duì)照,葉面噴施型的哈茨木霉可濕粉劑為陽性對(duì)照,蒸餾水為空白對(duì)照,在茶餅病發(fā)病期選取無肉眼可見病斑的茶樹為實(shí)驗(yàn)對(duì)象測(cè)量茶園中茶餅病田間發(fā)病情況,田間實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,酵母表達(dá)CsC7處理組相對(duì)蒸餾水處理組的病斑數(shù)降低了34.04%。本研究結(jié)果為研發(fā)防治茶樹真菌病害的綠色農(nóng)藥提供理論依據(jù),同時(shí)為抗真菌病害茶樹品種的選育提供理論支撐。