基于高通量液相色譜質譜技術的菌株篩選與關鍵分子定量分析研究進展

吳玉潔，劉欣欣，劉健慧，楊開廣，隨志剛，張麗華，張玉奎

（1 中國科學院大連化學物理研究所，中國科學院分離分析化學重點實驗室，遼寧 大連 116023； 2 大連理工大學化學學院，遼寧 大連 116024； 3 中國科學院大學，北京 100049）

合成生物學是21世紀新興的交叉學科，是以工程化的設計理念，對生物體進行設計、改造乃至重新合成的研究領域［1-2］，被認為是繼“DNA雙螺旋結構發(fā)現(xiàn)”和“人類基因組計劃”后的第三次生物技術革命［3］。微生物細胞工廠（microbial cell factory，MCF）是合成生物學的重要研究內容，被越來越多地應用于生命科學、能源環(huán)境、食品農業(yè)及先進材料等領域，推動著當前生物技術的發(fā)展與進步［4-6］。

近些年來，隨著基因編輯技術的進步，MCF的構建策略從最初的隨機誘變逐步向全基因組水平定制化改造發(fā)展［7］，生物學家可以在短時間內獲得103～107量級的菌株突變體文庫。然而，缺乏靈敏準確的高通量篩選方法限制了MCF的改造進化。合適的信號檢測策略是篩選方法建立的核心［8］，當前發(fā)展的高通量篩選方法多基于產物賦予菌株的顏色、細胞生長狀態(tài)或與產量相關的熒光信號等，應用于瓊脂平板、微孔板及液滴培養(yǎng)等不同培養(yǎng)類型菌株的快速檢測［9-10］。但對于那些不具有顏色、熒光信號等表觀性狀的菌株，開發(fā)基于質譜的無標記高通量檢測方法就顯得尤其重要［11］。

此外，在菌株改造進化及發(fā)酵監(jiān)測過程中，對代謝通路上關鍵分子（如代謝酶和代謝物）進行精準定量分析的需求日益凸顯。而且當待測MCF的樣本數(shù)量較大時，對檢測方法通量也提出了更高要求［12］。當前對代謝通路中關鍵蛋白質的定量主要采用蛋白質免疫印跡法（Western blot，WB）或導入熒光蛋白標簽策略。WB具有特異性強、敏感性高的特點，但通量低且定量準確性較差［13-14］；熒光蛋白標簽無毒、成像對比度高，然而其可選顏色有限且存在光漂白問題［15-17］。核磁共振技術（nuclear magnetic resonance，NMR）可以通過整合質子信號來識別和量化關鍵代謝物分子，NMR樣品制備快且損失小，不依賴于分離技術，具有高度可重復性。然而，NMR的低靈敏度限制了其在關鍵分子定量研究中的應用［18］。

液相色譜具有優(yōu)異的分離能力，可實現(xiàn)目標分子的高效分離，而質譜因其高特異性、高靈敏度的特點，具有強大的檢測能力，二者均可以分析小分子及生物大分子。因此，色譜、質譜技術在生命科學領域得到了廣泛的應用，尤其在蛋白質和代謝物定性定量分析方面發(fā)揮了重要作用［19-21］。近些年來，高通量液相色譜、質譜技術的進步革新，使其成為合成生物學菌株篩選及關鍵分子定量研究的有力工具。

本文總結分析了近年來高通量液相色譜、質譜技術在菌株篩選及關鍵分子定量方面的研究進展，從樣品制備、色譜分離、質譜采集及數(shù)據(jù)處理層面展開介紹，并對這一領域未來的前景及挑戰(zhàn)進行簡要闡述，以期為該領域的研究人員提供參考。

1 基于高通量質譜技術的菌株篩選方法

MCF構建過程中會產生大量菌株突變體文庫，需要建立高通量篩選方法。質譜具有靈敏度高且無需特異性標記等特點，可以為無表觀性狀MCF高通量篩選提供關鍵技術支撐。目前，菌株高通量篩選依賴的質譜技術包括：解吸電離質譜、電噴霧電離（electron spray ionization，ESI）質譜和原位電離（ambient ionization，AI）質譜?；谫|譜的菌株篩選方法主要包括如下步驟：樣品制備、色譜分離、質譜信號采集及數(shù)據(jù)處理和分析。

1.1 菌株高通量篩選中的樣品制備方法

樣品制備是連接菌株培養(yǎng)與質譜檢測的關鍵環(huán)節(jié)。菌種培養(yǎng)液中含有無機鹽、緩沖液、各種表面活性劑等質譜無法兼容的成分，因此需要對樣品進行預處理。對于可分泌到細胞外的待測物，菌株樣品制備相對簡單，通過萃取或者稀釋后即可進行質譜分析。而對于細胞內待測物，則需要菌體破碎、待測物提取等樣品預處理過程。而且，針對不同的菌株培養(yǎng)模式，如瓊脂平板培養(yǎng)、微孔板培養(yǎng)和液滴培養(yǎng)等，其對應的樣品制備流程也有所差異。

用于菌株高通量篩選的解吸電離質譜技術主要包括基質輔助激光解吸電離（matrix-assisted laser desorption ionization，MALDI）質譜、自組裝單層解吸電離（self-assembled monolayer desorption ionization，SAMDI）質譜和納米結構啟動質譜（nanostructure initiator mass spectrometry，NIMS）。MALDI電離源具有較高的耐鹽性，通常可將菌株分析物直接加在靶板上，待風干后再添加基質以輔助樣品離子化。針對不同類型的樣本，可選用不同的基質，如α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA）、2，5-二羥基苯甲酸（2，5-dihydroxybenzoic acid，DHB）或芥子酸（sinapinic acid，SA）等。對于微孔板及液滴培養(yǎng)的菌株，借助自動化移液系統(tǒng)和基質噴霧儀等設備可快速實現(xiàn)上述操作。而對于瓊脂平板培養(yǎng)的菌株，通常借助膜轉移法［22］，使菌落轉移至放在瓊脂平板上的膜上生長，隨后將膜上菌落生物質印跡在載玻片上，噴涂基質后進行質譜檢測。在MALDI的基礎上結合自組裝單層技術產生的SAMDI質譜技術，通常使用自動液體處理器將微孔板培養(yǎng)的菌株待測物轉移到經功能基團修飾的SAMDI靶板上，通過孵育將反應物富集在靶板上，添加基質后再進行質譜采集［23］。相對于SAMDI，NIMS技術利用含氟聚合物修飾的多孔硅芯片富集分析物，進而采用聲學沉積裝置輔助加樣，且無需添加基質即可進行質譜檢測［24-25］。

ESI質譜也是用于菌株篩選的另一主要工具，通常適用于微孔板和液滴培養(yǎng)的菌株。對于微孔板培養(yǎng)的菌株，由于ESI源耐鹽性較差，樣品通常需要經過萃取或色譜分離［26］后上樣。芯片多通道納噴離子源（triversa nanomate，TVNM）是在ESI電離源基礎上，通過整合液體萃取表面分析技術（liquid extraction surface analysis，LESA）發(fā)展起來的新一代離子源。該技術通過吸頭在樣品表面位置進行微萃取，通過自動電噴霧進樣將萃取得到的納升級樣品進入質譜分析，因其操作便捷而大大提高了基于ESI質譜技術的篩選通量。值得關注的是，商業(yè)化的RapidFire系統(tǒng)和聲學輔助系統(tǒng)也是兩個有前景的高通量分析平臺，已經在抗體、藥物篩選方面有所應用［27-31］。RapidFire系統(tǒng)可以在幾秒鐘內實現(xiàn)上樣、固相萃?。╯olid-phase extraction，SPE）及質譜進樣［32］；以聲霧電離（acoustic mist ionization，AMI）和聲學液滴噴射（acoustic droplet ejection，ADE）為主的聲學輔助技術，通過無接觸方式利用聲能從微孔板中噴出樣品薄霧或納升液滴，最快可在0.5 s內完成質譜進樣［33-35］。聲學輔助技術與RapidFire相比速度有所提升，且無需基質優(yōu)化及點樣，適用于基于微孔板培養(yǎng)的菌株篩選。對于液滴培養(yǎng)的菌株，可將菌株產物稀釋后直接進行在線檢測［36］。此外，一些在線微萃取研究工作［37-39］也為開發(fā)復雜液滴培養(yǎng)條件下的菌株樣本制備方法提供了參考。

近些年來，AI質譜技術因其可在敞開環(huán)境下操作并實現(xiàn)原位、實時的質譜分析成為研究熱點。其中，解吸電噴霧電離（desorption electrospray ionization，DESI）質譜常用于瓊脂平板菌株的高通量篩選，采用微孔膜支架（microporous membrane scaffolds，MMS）［40］將待測樣本轉移至載玻片上進行后續(xù)質譜檢測。新發(fā)展的快速蒸發(fā)電離（rapid evaporative ionization，REI）質譜作為一種新型AI質譜技術，可直接采樣，無需樣品制備，是菌株高通量篩選技術的理想選擇之一。

1.2 菌株高通量篩選中的質譜檢測方法

雖然液相色譜質譜聯(lián)用技術具有高分辨率、高靈敏度的優(yōu)點，但是色譜分離往往需要較長時間，難以實現(xiàn)高通量分析。因此，當前基于質譜的菌株高通量篩選方法通常避免采用色譜分離，而是在樣品制備后直接進行質譜檢測。

1.2.1 基于解吸電離質譜技術的菌株篩選方法

解吸電離質譜技術的典型代表是MALDI質譜。該技術首先將微生物樣品與基質分別點加在鋼靶上，晾干后形成共結晶。而后在激光照射下，共結晶中的基質分子吸收激光能量并幫助樣品分子電離，進入質量分析器進行檢測［41］。MALDI離子源通常與飛行時間質量分析器（time of flight analyzer，TOF）聯(lián)合使用［42］，稱為基質輔助激光解吸飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）。MALDITOF MS具有檢測窗口較大、掃描速率快、耐鹽性高和成本相對較低的特點［43-44］，非常適用于菌株的高通量篩選。對于瓊脂平板菌落的篩選，Zhao等［45］開發(fā)了基于MALDI-TOF MS的?；溋字Ｄ憠A檢測方法，將中鏈脂肪酸（medium-chain fatty acid，MCFA）量化信息轉化為m/z730峰和m/z758峰的相對強度，并將其作為檢測指標用于高產MCFA的釀酒酵母菌株篩選，實現(xiàn)了每分鐘30個樣品的分析通量。此外，視覺輔助識別技術的引入也大幅提高了菌落分析的速度。Sweedler等［22］結合機器視覺算法開發(fā)了基于MALDI-TOF MS的瓊脂平板菌落高通量篩選方法。該方法巧妙地采用膜轉移策略將平板上分散的菌落轉移至靶板上，利用菌斑自動識別技術對隨機分布的大腸桿菌菌落取樣分析，以每個樣品小于2.5 s的速度進行檢測，并在天然產物文庫篩選中驗證了該方法的實用性。對于微孔板培養(yǎng)的菌株，Sweedler團隊［46］開發(fā)了將樣本位置轉換為MALDI檢測坐標的算法，在大腸桿菌及熒光假單胞菌文庫實現(xiàn)高通量檢測（每個樣品小于2 s），拓展了MALDI質譜技術在菌株篩選中的應用。此外，選用金納米顆粒代替DHB作為分析脂肪酸的基質，以增強檢測信號強度。為了評估無標記質譜技術在活性酶快速篩選方面的能力，Si等［47］報道了應用于環(huán)二肽合酶的定向進化改造的MALDI-TOF MS篩選平臺，對重組大腸桿菌突變體文庫進行高通量篩選（每個樣品5 s）。最近該研究團隊將這一技術運用到羊毛硫肽化合物突變體文庫篩選［48］，且基本實現(xiàn)整個流程的自動化。此外，Cramer等［49］進一步將大氣壓（atmospheric pressure，AP）與MALDI結合，開發(fā)了一種液體大氣壓基質輔助激光解吸電離（AP-MALDI）裝置，可用于肽、抗生素和脂質三類不同物質的高通量大規(guī)模樣品分析，每秒至少可檢測5個樣品，優(yōu)化得到的液體基質可用于分析復雜生物液體，為培養(yǎng)環(huán)境復雜的菌株篩選提供選擇。對于微滴培養(yǎng)的菌株，也有使用MALDITOF MS直接篩選的報道［50-51］。Dittrich等［51］利用自制裝置將液滴轉移在平板上的確定位置，進而通過基于平行玻片的液滴分離方法獲得細胞上清液樣品。該方法結合離線MALDI-TOF MS檢測，可在幾秒內并行處理數(shù)千個液滴，并成功應用于分泌甜蛋白酵母的篩選。由此可見，MALDI質譜是目前適用于不同培養(yǎng)類型菌株高通量篩選的通用平臺。

在MALDI基礎上發(fā)展起來的SAMDI技術，由美國西北大學MiIan Mrksich團隊［52］提出并進行了系統(tǒng)研究。SAMDI利用自組裝單層技術在靶板上修飾功能基團，可在復雜體系中特異性富集分析物并進行質譜檢測［23，53］。Mrksich等［23］利用SAMDI技術將靶板表面修飾馬來酰亞胺基團，通過加成反應將未純化的反應產物固定在自組裝單層上，用于篩選大腸桿菌產生的細胞色素P411突變體文庫，將5000個變體的篩選時間從24 d（1次重復）縮短為17 h（4次重復）。SAMDI技術還被廣泛應用于酶活性篩選［54-57］，展現(xiàn)了其在菌株高通量篩選方面的應用潛力。

此外，為了解決常規(guī)解吸質譜需要添加基質的問題，斯克利普斯研究院的Gary Siuzdak團隊于2007年開發(fā)了NIMS技術［58］。該技術首先通過對載體材料進行電化學刻蝕得到納米結構表面（如多孔硅表面），之后在納米結構表面捕獲氟化物以形成“引發(fā)劑”層，并將待測分子吸附在“引發(fā)劑”層的表面［59］。當受到離子束或激光擊打時，“引發(fā)劑”可以釋放和離子化待測分子，隨后進入質譜進行檢測（如圖1所示）。盡管利用NIMS分析不同待測物時所選用的氟化物有所差別，但與MALDI相比，減少了基質的干擾。這使得NIMS技術可以更容易分辨出離子峰，提高檢測靈敏度，成為菌株高通量篩選的有前景平臺［24-25］。Keasling團隊［25］提出了一種點擊輔助NIMS酶活性測定法（probing enzymes with click-assisted NIMS，PECAN），通過將點擊化學與NIMS相結合，對復雜基質中的酶活性進行高通量質譜檢測，并利用該方法成功篩選了大腸桿菌細胞色素P450突變體文庫。

圖1 NIMS原理圖Fig. 1 Schematic of NIMS

1.2.2 基于電噴霧電離質譜技術的菌株篩選方法

ESI質譜技術通過施加高電壓將液體樣品霧化成微小液滴，在輔助氣作用下溶劑蒸發(fā)，液滴表面電荷密度逐漸增加，最后形成極小的帶電離子進入質量分析器進行檢測［60］。ESI屬于軟電離方式，適合于分析極性強、熱穩(wěn)定性差的生物大分子。然而，由于ESI電離源耐鹽性較差，菌株樣本通常需要經過提取凈化或色譜分離后進行質譜采集。Ellis等［26］開發(fā)了超快速（84 s）液相色譜質譜聯(lián)用方法和條形碼納米孔測序相結合的菌株檢測方法，解決了色譜分離通常占用大量時間的問題，在24 h內篩選1000個菌落，得到12株三萜樺木酸產量提高的釀酒酵母菌株。融合LESA技術的新一代TVNM離子源是用于菌株高通量篩選的另一良好工具，LESA使用溶劑萃取提取樣品，得到的樣品直接進入質譜檢測，可以最大限度減少基質效應。Sweedler課題組［61］將LESA技術、聲學液體工作站及穩(wěn)定同位素標記方法結合，成功用于酵母菌株衣康酸、三乙酸內酯和棕櫚酸的高通量絕對定量篩選，每個樣品檢測過程大約需要1 min。然而，可能是由于樣品提取效率不一致和基質干擾的原因，LESA技術尚未廣泛用于工程菌株篩選。除了上述應用于微孔板培養(yǎng)菌株的方法，基于ESI的質譜技術也被用于篩選液滴培養(yǎng)的菌株［36，62］。Dusny等［36］將微流控芯片技術與在線ESI質譜檢測結合，將納升級液滴通過集成發(fā)射器直接注入ESI電離源檢測，用于篩選不同生長介質中生產賴氨酸的谷氨酸棒桿菌優(yōu)勢菌株，篩選通量為每分鐘60個樣品。

1.2.3 基于原位電離質譜技術的菌株篩選方法

自2004年美國普渡大學Cooks等［63］首次報道以來，DESI目前已成為AI質譜的代表性技術。該技術通過向樣品噴射由ESI 產生的帶電霧滴實現(xiàn)樣品離子化，經氮氣吹掃干燥后，分析物以氣相離子形式進入質譜檢測（如圖2所示）。

圖2 DESI源原理圖［63］Fig. 2 Schematic of the DESI source[63]

DESI可在大氣壓條件下工作，通過調節(jié)噴霧溶劑種類提高對待測物的選擇性檢測，且無需復雜的樣品預處理，是適用于菌株高通量篩選的有效方法。DESI通常與質譜成像技術（mass spectrometry imaging，MSI）結合，將產物量化信息映射到其空間位置，以區(qū)分菌落邊界并產生質譜強度信息［64-65］。Barran等［64］利用DESI-MSI技術，對大腸桿菌生物催化劑產物解氨酶及P450單加氧酶進行實時篩選，通量約每分鐘60個樣品。McLean等［65］同樣使用DESI-MSI技術，結合MMS取樣方法對工程大腸桿菌中的游離脂肪酸進行快速原位分析，從樣本轉移到采集質譜數(shù)據(jù)，每個菌落樣本需要8 min。

REI質譜是近些年來新興的AI質譜技術， 于2009年由帝國理工學院Takáts團隊［66］提出。該技術通過電離切割樣品釋放氣溶膠，再通過導管將氣溶膠直接吸入到質譜儀進行檢測，特別適合原位快速分析。Taka?ts等［67］將激光與REI技術結合，發(fā)展了激光輔助快速蒸發(fā)電離（laser-assisted rapid evaporative ionization，LA-REI）質譜技術（圖3），激光可實現(xiàn)菌株代謝物即時半定量分析。

圖3 LA-REI源原理圖［68］Fig. 3 Schematic of the LA-REI source[68]

將該方法用于評估酵母菌株中紫色桿菌素和白樺酸的生產水平，以每分鐘6個菌落的通量直接從酵母菌落采樣，通過篩選數(shù)百個菌落后成功分離出1株高產菌株，其白樺酸產量提高了2.5倍。LA-REI質譜快速、便捷的優(yōu)勢使其在菌株高通量篩選方面具有巨大潛力［68］。

綜上所述，不同類型的質譜技術為菌株高通量篩選提供有力工具，篩選速率可以達到秒級，相關內容總結見表1。此外，一些其他質譜技術，如MALDI源與ESI源結合產生的基質輔助激光解吸電噴霧電離（matrix-assisted laser desorption electrospray ionization，MALDESI）質譜，也展現(xiàn)出超快的檢測速度［69-70］，為菌株高通量篩選方法的開發(fā)提供了潛在可能。

表1 基于高通量質譜技術的菌株篩選研究匯總Table 1 Summary of strain screening studies based on high-throughput mass spectrometry

1.3 高通量數(shù)據(jù)處理和分析

自動化的質譜檢測會產生海量數(shù)據(jù)，需要后續(xù)數(shù)據(jù)平臺快速同步分析以滿足高通量篩選需求。當前的數(shù)據(jù)處理分析流程通常基于商業(yè)化軟件或根據(jù)實際工作流程編寫相應代碼，以實現(xiàn)整個篩選過程的順利運行。

針對解吸電離質譜技術產生的數(shù)據(jù)，常用的SpectralAnalysis［71］、Flex Analysis（Bruker）、TOF/TOF Series Explorer（AB Sciex）等軟件可滿足基本的處理分析需求。此外，有些研究基于Python、MATLAB平臺，自行編寫代碼以匹配實際篩選流程。Sweedler團隊［46］基于Python開發(fā)了macroMS程序，該程序通過對一定質荷比范圍內的離子總數(shù)求和對MALDI-TOF MS成像數(shù)據(jù)的處理，同時創(chuàng)建了數(shù)據(jù)可視化分析網(wǎng)頁，并生成樣本數(shù)據(jù)熱圖，成功用于產MCFA的釀酒酵母菌株的高通量篩選。Si等［22］開發(fā)了用于多元統(tǒng)計分析的算法，結合t分布-隨機鄰近嵌入（t-SNE）對數(shù)據(jù)進行降維可視化分析，以快速評估和識別具有所需表型的突變體。對于ESI質譜技術的數(shù)據(jù)處理分析，可以借助Protein Metrics Intact Mass、MassLynx（Waters）、MultiQuant（AB Sciex）等平臺處理。

基于DESI、NIMS的質譜篩選技術通常與成像技術結合，OpenMSI平臺［72］是處理上述質譜成像數(shù)據(jù)的有效工具。為了進一步提高數(shù)據(jù)處理通量，Bowen等［73］開發(fā)了OpenMSI陣列分析工具包（OpenMSI Arrayed Analysis Toolkit，OMAAT）。該軟件基于Python編寫，并集成了OpenMSI平臺，可用于存儲、共享和分析MSI數(shù)據(jù)，解決了大型質譜成像數(shù)據(jù)集快速處理問題，將基于NIMS技術檢測的384個樣品成像數(shù)據(jù)分析時間縮短為原時長的1%。

2 基于高通量液相色譜質譜技術的菌株關鍵分子定量分析方法

菌株代謝通路中的關鍵蛋白及小分子代謝物的高通量精準定量分析，不僅是深入認識代謝通路調控機制的重要手段，也有助于加速MCF進化的效率。相比于傳統(tǒng)的基于WB的蛋白檢測方法和基于NMR的代謝分子檢測方法，基于高通量液相色譜質譜的蛋白質組學和代謝組學技術具有定量準確性高、重現(xiàn)性好等特點，在工程菌株關鍵分子定量環(huán)節(jié)發(fā)揮著重要作用。根據(jù)分析檢測流程，分為四個關鍵步驟：樣品制備、色譜分離、質譜檢測及數(shù)據(jù)處理。

2.1 高通量樣品制備方法

隨著液相色譜質譜聯(lián)用技術的進步，大批量MCF樣品中關鍵分子的定量分析成為可能，同時也對樣品制備的通量及重現(xiàn)性提出了挑戰(zhàn)。近年來，自動化移液工作站相繼問世［74-75］，配合微孔板實現(xiàn)批量化樣品預處理。儀器代替手工操作不僅大大提升了樣品制備通量，而且也顯著提高了樣品處理的重現(xiàn)性。

傳統(tǒng)基于自下而上（bottom-up）的蛋白質組學樣品預處理流程包括蛋白質提取、變性、還原、烷基化、除鹽和酶解等步驟，通常在自由溶液中離線操作完成，整個流程步驟多、耗時久、損失大。為了提高預處理通量，Petzold等［76］發(fā)展了3步模塊化樣品制備方案，包括菌株裂解、蛋白提取定量及酶解，結合Biomek-NX自動化移液工作站可在1 h內完成96個樣品的酶解前流程，并被成功用于革蘭氏陰性細菌和真菌樣品的預處理。為了加快樣品制備流程并減少樣品損失，Krijgsveld團隊［77-78］發(fā)展了單罐固相增強樣品制備（singlepot solid-phase-enhanced sample preparation，SP3）方法，利用羧基包覆的順磁珠與樣品之間的親疏水相互作用，在18 min內完成蛋白質捕獲，隨后進行原位除鹽及酶解處理實現(xiàn)蛋白樣品制備?；赟P3方法與96微孔板，Armengaud等［79］開發(fā)了一個高通量樣品制備平臺，省略了還原及烷基化過程，將酶解時間縮短為15 min，實現(xiàn)了細菌蛋白樣品的快速制備。Paulo課題組［80］將SP3與串聯(lián)質量標簽（tandem mass tag，TMT）技術結合，使用opentrons OT-2移液工作站開發(fā)了半自動SL-SP3-TMT（streamlined-SP3-TMT）樣品制備方法（酶解操作需在額外的加熱振蕩器上進行），可在9 h內實現(xiàn)96個酵母樣品的半自動化TMT標記化制備。此外，研究者還報道了針對蛋白質翻譯后修飾的高通量樣品制備方法。Lipton等［81］發(fā)展了一種自動化系統(tǒng)，利用大容量固定化金屬離子親和色譜（immobilized metal affinity chromatography，IMAC）柱增加肽負載量同時減少洗滌時間，實現(xiàn)細菌樣品中磷酸肽的高效富集。Leutert等［82］將SP3方法和基于Fe-IMAC磁珠的磷酸化富集技術進行整合，發(fā)展了一種高通量的磷酸化蛋白質組學分析流程（rapid-robotic phosphoproteomics，R2-P2），結合King Fisher Flex自動化移液工作站可在5 h內實現(xiàn)釀酒酵母磷酸化蛋白質組預處理。

對于代謝物而言，樣本制備流程通常包括采樣、猝滅、細胞內/外代謝物提取［18］。細胞外代謝物存在于培養(yǎng)基中，僅需要將培養(yǎng)基與微生物菌株分離，進行下游檢測即可。而細胞內代謝物所處的環(huán)境復雜，代謝物之間可以迅速轉化，因此處理流程更為復雜。尤其在進行大量菌株的代謝物樣本制備時，需要盡可能對每一步操作進行優(yōu)化。為了提高采樣速度及猝滅效率，人們開發(fā)了自動化采樣猝滅裝置［83-85］。最近，Blank等［86］開發(fā)了一種基于不可逆電穿孔的采樣裝置，通過脈沖電場調節(jié)微流控芯片的流量，可在數(shù)秒內實現(xiàn)細胞內代謝物的采樣、猝滅及提取處理，適用于細胞壁和細胞膜特性不同的多種細胞類型。此外，提取也是代謝物樣品制備的重要環(huán)節(jié)，包括細胞破碎以及隨后的代謝物提取和樣品濃縮等步驟。當前常用的細胞破碎方法可分為基于超聲、微波及研磨等過程的物理破碎方法，基于熱乙醇、乙腈等有機試劑的化學破碎方法，以及基于溶菌酶等破壁酶的酶解法。代謝物提取方法主要有蛋白質沉淀法（protein precipitation，PPT）、液液萃取法（liquid-liquid extraction，LLE）及SPE技術等［87］。其中，SPE技術由于回收率更高，可將分析物與干擾組分有效分離，是當前代謝物提取的主要方法。其利用在短管里填充固體吸附劑，選擇性地吸附樣品溶液中的目標物質，隨后選用適當強度的溶劑沖洗雜質，最后洗脫獲得目標物質。為了滿足高通量分析的需求，目前自動化固相萃取技術也已問世。Six等［88］發(fā)展了一種基于SPE的無標記質譜檢測方法（簡稱：BacPK），結合RapidFire系統(tǒng)，在2 h內完成細菌裂解、提取及固相萃取等操作，用于檢測大腸桿菌細胞內化合物的總積累量。在SPE基礎上發(fā)展起來的固相微萃取技術（solid-phase microextraction，SPME）集萃取、濃縮及進樣于一體［89］，也被用于菌株中微量代謝物的快速樣品制備［90-92］。SPME具有樣品用量少、選擇性高及使用便捷的優(yōu)點，易于實現(xiàn)自動化。Pawliszyn等［90］開發(fā)并應用不同的SPME涂層，發(fā)展了同時提取大腸桿菌中疏水性和親水性代謝物方法，并與96孔板結合，可在4 h左右完成腸桿菌中代謝物提取、洗滌及解吸過程，隨后又將該方法應用于肉桂醛對大腸桿菌的殺菌機制研究［93］。

高通量樣品制備方法的革新，將樣品預處理時間從原來的數(shù)天縮短至幾小時，使大規(guī)模菌株樣本快速處理成為可能。但是，由于樣品制備流程步驟多，且步驟之間多需要進行轉移，還未實現(xiàn)全流程完全自動化。借助新興的智能自動化平臺，實現(xiàn)樣品制備全流程集成化、自動化已成為未來的發(fā)展趨勢。

2.2 高通量色譜分離方法

目前，液相色譜質譜聯(lián)用技術在針對大量菌株樣本的關鍵分子定性定量分析中占據(jù)主導地位，可用于細胞工廠代謝通路路徑識別和優(yōu)化［94］，指導MCF的理性設計，并為基因組尺度代謝網(wǎng)絡模型（genome-scale metabolic model，GEM）構建提供支撐。色譜分離可實現(xiàn)復雜樣品的高效分離，大幅提高后續(xù)質譜檢測的準確度和靈敏度，是液相色譜質譜聯(lián)用技術的關鍵環(huán)節(jié)。

傳統(tǒng)液相色譜質譜聯(lián)用技術基于納升流速，靈敏度雖高，但較長的分離時間嚴重限制了分析通量。近些年來，以毛細管流速（capillary-flow）液相色譜、微升流速（micro-flow）液相色譜及分析流速（analytical-flow）液相色譜為代表的高通量色譜技術應運而生［95］，結合不同的分離模式，為解決大隊列樣本不同類型關鍵分子的快速檢測提供技術支撐。Petzold等［96］采用C18色譜柱（50 mm×2.1 mm），流速400 μL/min，梯度25 min，聯(lián)合Agilent 6460三重四極桿質譜儀，對大腸桿菌中的600多條肽（367個蛋白）進行了定量。Ralser等［97］基于HSS T3色譜柱（150 mm×300 μm），在5 μL/min及19 min有效分離梯度條件下與TripleTOF 6600聯(lián)用，定量來自796個酵母菌株的1576個蛋白質，實現(xiàn)了非整倍體的系統(tǒng)分析，揭示了其在蛋白質組水平上的劑量補償。以上色譜分離主要采用經典的反相液相色譜（reverse phase liquid chromatography，RPLC）模式。它采用非極性介質作為固定相，極性溶液為流動相，根據(jù)溶質極性差別對復雜樣品進行分離。對于MCF中的糖類、磷酸化合物等強極性分子，常用的檢測模式為親水相互作用色譜（hydrophilic interaction chromatography，HILIC）。HILIC采用了親水固定相和疏水流動相，在分離過程中，親水固定相表面首先形成一個水層，親水的極性分子集中在固定相周圍的水層，而低極性的分子溶解在有機相中。Paglia等［98］報道了用于小分子極性代謝物的常規(guī)高通量檢測方法，基于HILIC分離和四極桿飛行時間質譜檢測模式，在10 min分離梯度及400 μL/min流速下全面分析糖、磷酸化合物、嘌呤和嘧啶、核苷酸等多種小分子極性代謝物。Brouwers等［99］建立了高通量脂質分子分析流程，使用HILIC分離柱（50 mm×4.6 mm）在1 mL/min流速及4 min梯度內與質譜聯(lián)用檢測223個脂質分子。

此外，丹麥Evosep公司于2018年推出新型Evosep One液相系統(tǒng)，包含了用于樣品洗脫及梯度存儲的低壓泵和同步快速上樣及色譜分離的高壓泵，創(chuàng)新型的高低壓管路設計消除了樣品間色譜柱平衡時間［100］，可在6 min有效梯度內實現(xiàn)每天200個樣品的檢測通量［101-102］。Evosep One系統(tǒng)通量高及穩(wěn)定性好的優(yōu)勢為大規(guī)模低樣本量的菌株關鍵分子定量分析提供選擇。

多色譜柱系統(tǒng)開辟了提升分離通量的另一路徑。雙液相色譜平臺可以充分利用上樣時質譜采集的空閑時間，提高檢測通量［103-104］。Mann課題組［104］開發(fā)了樣品制備與雙液相色譜平臺平行的高通量工作流程，優(yōu)化樣品采集時間為15min，可在1 d內完成96個較低或中等復雜度樣品的分析檢測。值得關注的是，商業(yè)化Transcend TLX系統(tǒng)，結合在線SPE技術及多通道液相色譜分離，有效提高質譜檢測利用率，已在病毒蛋白鑒定中有所應用，可以達到每天超過500個樣本的分析通量［105］，是高通量色譜分離方面很有前景的平臺。

2.3 高通量質譜檢測方法

質譜擁有卓越的檢測能力，可在一次運行中對成百上千個關鍵分子進行分析。為滿足不同檢測規(guī)模和監(jiān)測目標的需求，人們可以采用非靶向型技術和靶向型技術對蛋白質或代謝物分子進行質譜分析，例如數(shù)據(jù)依賴型采集（data-dependent acquisition， DDA）是典型的非靶向采集技術，選擇反應監(jiān)測（selected reaction monitoring，SRM）是靶向采集技術的代表。

2.3.1 關鍵分子非靶向定量分析

非靶向分析是一種無偏向性檢測技術，側重對微生物體內某一類物質（如蛋白質、代謝物）進行系統(tǒng)性檢測，全面深入分析微生物表達特征并發(fā)現(xiàn)影響菌株產量的關鍵差異分子。關鍵分子非靶向定量分析通常使用無標記定量（label free quantitation，LFQ）策略，通過比較同一離子在多個樣品中的質譜信號差異，可以對不同樣本中同一分子的含量進行相對定量分析［106］。此外，穩(wěn)定同位素標記定量是另一種常用的非靶向定量分析策略。該方法通過代謝標記或體外標記，在蛋白或肽段上引入13C、15N等穩(wěn)定同位素［107］。使不同樣品中同一肽段具有不同的質量標簽。在對混合樣品進行質譜分析時，不同來源的同一肽段產生不同的信號離子，根據(jù)它們的峰強度進行定量分析［108-109］。無標記定量方法具有更寬的動態(tài)范圍和更深的覆蓋度，而穩(wěn)定同位素標記方法的定量精度和準確性更高［110］。DDA是經典的非靶向質譜采集模式，即首先進行一級質譜全掃描，隨后對一級譜圖中選中的強度較高的母離子進行二級掃描［111］。由于這種方式獲得的譜圖質量較高，因此在分子定性定量檢測中應用廣泛。然而，傳統(tǒng)DDA模式隨機性大，導致數(shù)據(jù)重現(xiàn)性較差，易產生大量缺失值。近年來發(fā)展起來的數(shù)據(jù)非依賴型采集模式（data-independent acquisition，DIA），即不依賴一級譜中的離子強度信息，對每個窗口區(qū)域所有母離子進行連續(xù)碎裂檢測。該方法可以獲得所有碎片離子信息（見圖4），提高了數(shù)據(jù)利用度，具有重現(xiàn)性好、定量準確性高及通量高等優(yōu)點［113-114］，逐漸成為關鍵分子高通量定量分析的有力工具。Mann等［115］建立一種快速DIA分析方法，與RPLC聯(lián)用，在2.2 d內定量檢測了100個酵母蛋白質組樣品。Ralser課題組［116］發(fā)展了Scaning SWATH模式，結合800 μL/min分析流速，可在5 min內對來自酵母的1900種蛋白進行相對定量。值得注意的是，DIA采集模式也有其不足，即在獲得更多信息的同時增加了譜圖分析難度。此外，離子淌度（ion mobility，IM）技術［117］可以根據(jù)離子大小和形狀差異引起的漂移時間差來實現(xiàn)第四維度的分離，有效降低譜圖復雜程度及數(shù)據(jù)匹配的假陽性，可以進一步提高鑒定準確度。Burgess等［118］采用兩性離子親水相互作用色譜（ZICHILIC）與漂移管離子淌度-四極桿飛行時間（DTIM-QTOF）質譜模式，開發(fā)了一種高覆蓋度的非靶向代謝組學快速工作流程，在800 μL/min流速及3.5 min梯度條件下檢測到細菌細胞內2139個代謝物分子特征。

圖4 非靶向采集模式原理圖［112］Fig. 4 Schematic diagram of the untargeted acquisition mode [112]

2.3.2 關鍵分子靶向定量分析

靶向分析側重于已知關鍵分子的定量檢測，通過針對性地檢測代謝通路中的關鍵蛋白及代謝物，克服了非靶向采集過程中大量離子干擾及低豐度離子不易檢測的問題。靶向分析通常用于關鍵分子的絕對定量，使用待測組分標準品或在樣品中加入內標物質，通過比較標準品或內標物質與待測樣品質譜信號峰面積進行定量。對于代謝物分子的絕對定量，通常由不同濃度的標準品得到標準曲線，使用內標物質消除系統(tǒng)誤差，在標準品濃度與峰面積、目標物質峰面積已知的情況下，計算出樣品中目標物質的含量［119］。對于蛋白質的絕對定量，已經發(fā)展了絕對定量分析（absolute quantification，AQUA）［120］、基于定量肽段聚合物（concatemer of quantification peptides，QconCAT）［121］、蛋白標準品絕對定量（protein standard absolute quantification，PASQ）［122］等多種方法，通過合成標準肽段或構建重組蛋白，經過質譜分析，達到對目標肽段準確定量的目的。以上絕對定量方法的本質是通過已知標準物質的量化信息來間接得到目標蛋白質或代謝物的絕對量。SRM［123］是最經典的靶向采集技術，該技術基于三重四極桿質譜對目標物進行分析，通過第一重四極桿選擇目標分子的母離子，隨后在第二重四極桿中發(fā)生碎裂，再由第三重四極桿進行目標碎片離子檢測。目標分子母離子的碰撞碎裂效率與離子傳輸和離子聚焦相關，增加多極桿數(shù)目可提升傳輸效率卻影響離子聚焦，為了平衡二者以獲得更好效果，常選用六極桿碰撞池對母離子進行碎裂，但是在表述上依然采用三重四極桿的說法。在SRM基礎上發(fā)展起來的多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）技術，可實現(xiàn)多個碎片離子同時監(jiān)測，由于二者根本原理一致，可不做明顯區(qū)分。SRM/MRM技術特異性強、靈敏度高且重現(xiàn)性好，在微生物關鍵分子定量分析研究中應用廣泛［94］。Petzold等［124］開發(fā)了基于高流速RPLC和SRM檢測技術的高通量靶向蛋白質組學方法，在5.5 min有效梯度內實現(xiàn)了大腸桿菌21條主要代謝途徑的400多種蛋白質的絕對定量分析，為大腸桿菌關鍵代謝通路蛋白質的快速精準定量分析提供了可靠的工具。Gao等［125］利用微流RPLC結合SRM采集模式，在32 min內實現(xiàn)了惡臭假單胞菌（P. putidaKT2440）中132種蛋白質的定量分析，揭示了惡臭假單胞菌KT2440在不同碳源及培養(yǎng)基中這些酶的表達水平的變化。Herrg?rd課題組［126］開發(fā)了一種用于高通量定量代謝組學的快速反相離子配對液相色譜三重四極桿質譜（rapid reverse phase ion-pairing liquid chromatography triple quadrupole mass spectrometry，RapidRIP）方法，結合MRM采集模式，該方法能夠在不到5 min的時間內定量分析氨基酸、核苷酸和輔因子等102種工程大腸桿菌的代謝物。高通量關鍵分子SRM/MRM分析方法的進步為深入認識并指導MCF代謝通路改造提供幫助。

此外，針對混合型高分辨質譜系統(tǒng)（如四極桿離子阱質譜、四極桿飛行時間質譜），人們發(fā)展了平行反應監(jiān)測（parallel reaction monitoring，PRM）技術，可以對母離子產生的所有碎片離子進行檢測（如圖5所示）。

相比于SRM/MRM，PRM選擇性及靈敏度更高，且由于避免了母子離子對的選擇與優(yōu)化，更便于方法開發(fā)，已在菌株關鍵分子定量方面有所報道［127-130］，在大規(guī)模樣本定量分析方面展現(xiàn)出了應用潛力。

隨著高通量液相色譜和質譜技術的發(fā)展與進步，人們已經可以在數(shù)分鐘內實現(xiàn)MCF中的大量蛋白及代謝物的規(guī)?；糠治觯瑸榇笈繕颖究焖贆z測提供技術支撐，相關總結內容見表2。

表2 基于液相色譜質譜技術的菌株關鍵分子定量研究匯總Table 2 Summary of quantitative studies of key molecules of strains based on liquid chromatography mass spectrometry

2.4 菌株關鍵分子定量分析中的高通量數(shù)據(jù)處理和生物信息學工具

高通量液相色譜質譜聯(lián)用檢測產生大量的數(shù)據(jù)信息，亟需發(fā)展高通量的數(shù)據(jù)處理平臺與之匹配。質譜采集產生的原始數(shù)據(jù)通常需要進行特征提取、噪聲過濾及峰提取和對齊等前處理操作，隨后進行多元統(tǒng)計分析和生物信息學分析［131］。這一過程可以借助軟件及商業(yè)化平臺進行，如MaxQuant、Spectronaut、MZmine、XCMS等。此外，已經報道了多項面向大型數(shù)據(jù)集處理及分析的研究工作。

2.4.1 數(shù)據(jù)處理

質譜采集的信號中含有大量背景噪聲信號。當樣品復雜程度高且目標信號峰強較低時，難以選定基線將目標信號與噪聲信號有效區(qū)分，處理不當會引入假陽性結果。因此準確區(qū)分樣本信號與噪聲信號對于后續(xù)定量分析十分重要。此外，高通量分析過程中產生大規(guī)模的數(shù)據(jù)集，為了提高數(shù)據(jù)處理通量，亟需發(fā)展高通量自動化的數(shù)據(jù)處理平臺。為了解決上述瓶頸問題，Aoshima等［132］開發(fā)了一種基于一級質譜數(shù)據(jù)的無標記峰檢測和定量算法（AB3D），該方法的主要特點為可以結合局部最小值及加權平均值算法進行峰值提取、降序處理所有排列候選峰。AB3D采用2D降序峰檢測、較少的模型擬合方法及簡便的操作步驟有助于快速處理大規(guī)模數(shù)據(jù)。使用革蘭氏陰性菌株Bartonella quintana測試了AB3D算法的定量能力及運行時間，發(fā)現(xiàn)其比四種現(xiàn)有軟件工具（MZmine2，MSight，SuperHirn和OpenMS）分析速度快大約1.2～15倍，但定量能力相當。相比于AB3D算法，MZmine2、OpenMS使用多種不同類型模型擬合峰以及嵌入可視化工具，靈活性強，但操作較為復雜［133-134］；MSight從原始數(shù)據(jù)文件生成圖像以用于基于圖像的峰檢測，提供更為直觀的數(shù)據(jù)信息，但計算相對昂貴［135］；SuperHirn使用多重比對策略結合聚類分析進行數(shù)據(jù)處理，但處理文件格式有限［136］。同位素標記提供了更準確、更可靠的關鍵分子定量信息，但產生數(shù)據(jù)集更加復雜，數(shù)據(jù)分析的難度和用時都大幅增加。Kiefer等［137］開發(fā)了基于Python平臺的DynaMet擴展包，用于從質譜原始數(shù)據(jù)中自動提取同位素標記特征，可在10 min內提取386個動態(tài)標記特征，并在芽孢桿菌及大腸桿菌動態(tài)標記實驗中測試了該方法的普適性。此外，基于人工智能和機器學習的大數(shù)據(jù)發(fā)展平臺也在合成生物學及代謝工程領域嶄露頭角，大大提升了分析效率［138-139］。Ralser課題組［140］開發(fā)了用于處理高度復雜DIA數(shù)據(jù)的軟件（DIA-NN），利用深度神經網(wǎng)絡分析（deep neural networks，DNNs）分辨真實信號與噪聲，發(fā)展新的量化和信號校正策略提高定性定量準確度，可在3 h內高通量完成364個酵母樣本的數(shù)據(jù)處理。

此外，研究者還開發(fā)了一系列針對靶向采集模式的數(shù)據(jù)處理工具［141-143］。針對當前靶向檢測數(shù)據(jù)處理通量較低的問題，Aebersold等［141］開發(fā)了識別置信度轉移（transfer of identification confidence，Tric）算法填補了大規(guī)模靶向蛋白質組學數(shù)據(jù)集自動化分析的空白。該軟件利用碎片離子數(shù)據(jù)進行交叉比對、統(tǒng)一峰提取和定量策略，可將大規(guī)模靶向蛋白質組數(shù)據(jù)集分析誤差率降低為原來的1/3。Zhu等［142］開發(fā)了一種面向大規(guī)模靶向代謝組學數(shù)據(jù)處理的R包MRMAnalyzer，用于自動化處理基于MRM模式的代謝組學數(shù)據(jù)，可在20 min內處理包含8000個母子離子對的大腸桿菌代謝組學數(shù)據(jù)集。

2.4.2 數(shù)據(jù)分析

高通量檢測技術造就的“大數(shù)據(jù)”時代已經到來，對數(shù)據(jù)分析與挖掘提出了挑戰(zhàn)。為了更好地闡明預處理后的數(shù)據(jù)，需要對其進行深入的統(tǒng)計分析與生物信息學分析。Kang等［144］報道了代謝工程目標選擇和最佳菌株識別工具（metabolic engineering target selection and best strain identification tool，MESSI），用于預測與酵母生物生產相適配的高效底盤和調節(jié)組件。MESSI可以分析已有的高通量代謝組學數(shù)據(jù)，并將其轉換為相關代謝途徑，以獲得可實現(xiàn)目標化合物高產的最有效的釀酒酵母菌株。Karp等［145］開發(fā)了一款生物信息學工具（pathway tools，PTools），可以為單細胞生物、多細胞生物以及泛基因組和生物群落（如大腸桿菌）自動生成完整的代謝網(wǎng)絡圖，并可以進一步搜索和分析這些網(wǎng)絡。PTools也可用于可視化基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡，分析高通量代謝數(shù)據(jù)集，幫助研究人員更好地理解生物體內代謝網(wǎng)絡。對代謝通路關鍵分子數(shù)據(jù)處理及分析工具總結見表3。

表3 關鍵分子定量分析中數(shù)據(jù)處理軟件及生物信息學工具匯總Table 3 Summary of data processing software and bioinformatics tools in the quantitative analysis of key molecules

3 總結與展望

近年來，高通量液相色譜、質譜技術的發(fā)展為菌株篩選與關鍵分子定量分析提供有力支撐。在MCF高通量篩選方面，自動化設備的出現(xiàn)加速了樣品制備速度?；诮馕婋x、ESI和AI等不同類型的質譜技術為菌株高通量篩選提供多種選擇，可以兼容瓊脂平板培養(yǎng)、微孔板培養(yǎng)和液滴培養(yǎng)等不同模式下的菌株樣品。對于質譜篩選產生的大型數(shù)據(jù)集可結合商業(yè)化軟件平臺進行處理，或根據(jù)需求自行編寫程序以提高數(shù)據(jù)分析可靠性。在MCF代謝通路關鍵分子定量方面，自動化移液工作站的應用在提高分析通量的同時減少了人為誤差，其與自由溶液酶解或磁性富集材料表面酶解相結合實現(xiàn)了菌株蛋白質的快速樣品預處理，與SPE或SPME相結合實現(xiàn)了菌株代謝物快速樣品預處理。在色譜分離方面，以毛細管流速、微升流速及分析流速色譜為代表的高通量色譜技術縮短了分離時間；不同類型的分離模式，如RPLC及HILIC，為檢測不同類型關鍵分子提供多種選擇。在質譜檢測方面，以DIA為主的非靶向質譜采集模式彌補了DDA隨機性大的缺陷，成為高通量關鍵分子鑒定的有效選擇；SRM/MRM靶向采集模式為已知關鍵分子定量提供有力工具。此外，DIA-NN、Tric等用于處理大型組學數(shù)據(jù)集的軟件及生物信息學工具也已相繼報道。

目前，基于質譜技術的菌株高通量篩選方法仍處于起步階段，所采用的質譜技術以解吸電離、ESI及AI為主。值得關注的是，AI質譜通常耐鹽性較高，但對于某些MCF復雜的培養(yǎng)環(huán)境，如何對細胞外產物進行快速樣品制備仍是需要解決的問題；而在分析細胞內產物時，針對菌株裂解、提取等環(huán)節(jié)，開發(fā)出高通量、高重現(xiàn)性且自動化的樣品制備方法對于基于質譜的菌株高通量篩選顯得尤為重要。近年來，多個非色譜依賴的高通量質譜篩選方法顯示出令人驚訝的潛力，但這些方法犧牲色譜分離以提高分析通量，可能導致離子抑制及低覆蓋率等問題。此外，當菌株篩選通量足夠高時，需要進一步提高定量覆蓋度與準確度。另一個挑戰(zhàn)是處理高通量篩選所產生大型數(shù)據(jù)集的通用分析平臺發(fā)展緩慢，研究工作多聚焦于開發(fā)定制的數(shù)據(jù)分析程序或支持商業(yè)平臺的自制腳本，公開通用或商業(yè)可用的數(shù)據(jù)分析工具研究較少。在MCF代謝通路關鍵分子定量分析方面，樣品制備流程步驟繁多，不易實現(xiàn)全流程自動化。例如目前自動化蛋白質樣品制備流程通常不包含菌株裂解過程，而適用于細胞內代謝物提取的通用方法也較少。發(fā)展具備集成化、自動化和在線化特點的樣品制備方法可以進一步提升分析通量，或將成為未來一個研究熱點。與納流液相色譜相比，高流速液相色譜在提升分析通量的同時也損失了靈敏度，如何保證快速分離過程中的檢測靈敏度與定量準確度也是面臨的另一挑戰(zhàn)。此外，如何加快高通量組學分析平臺的數(shù)據(jù)處理速度，如何生成標準化的分析報告及大數(shù)據(jù)整合，便于公開訪問以更好闡釋內在機制將是值得關注的問題。

菌株高通量篩選是加速MCF進化的關鍵環(huán)節(jié)，代謝通路關鍵分子定量分析有助于細胞工廠的改造及生產監(jiān)測。隨著液相色譜和質譜技術的不斷進步，及其與自動化裝置、數(shù)據(jù)處理平臺的深度融合，它們在合成生物學菌株高通量篩選及關鍵分子定量分析方面的優(yōu)勢會愈發(fā)凸顯，必將推動基于合成生物學的生物智造領域的快速發(fā)展。