自動(dòng)化高通量技術(shù)在天然產(chǎn)物生物合成中的應(yīng)用

胡哲輝，徐娟，卞光凱

（1 中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所，廣東 深圳 518055； 2 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，果蔬園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430071）

天然產(chǎn)物通常是指來(lái)源于動(dòng)物、植物或微生物的次生代謝物。具有多種生物學(xué)功能及活性，廣泛應(yīng)用于藥物、食品、營(yíng)養(yǎng)添加劑和化妝品等領(lǐng)域［1］。特別是在癌癥治療和傳染病防治方面，天然產(chǎn)物藥物發(fā)揮著重要作用［2-3］。相較于傳統(tǒng)的有機(jī)合成分子，天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜多樣，通常具有良好的生物活性和多種生物學(xué)功能。目前，新穎天然產(chǎn)物挖掘以及高附加值天然產(chǎn)物高效合成仍是該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

迄今為止，研究人員已通過(guò)產(chǎn)物直接分離、同源激活和異源表達(dá)等策略挖掘了大量天然產(chǎn)物［4-5］。然而，這些經(jīng)典的研究策略存在挖掘通量低和產(chǎn)物合成效率低等共性問(wèn)題，難以滿(mǎn)足天然產(chǎn)物研究高速發(fā)展的需求［6-7］。為了解決這些問(wèn)題，一方面，可利用基因組、代謝組和轉(zhuǎn)錄組等多組學(xué)方法挖掘新穎的天然產(chǎn)物生物合成元件；另一方面，可利用數(shù)據(jù)庫(kù)現(xiàn)有功能元件，對(duì)代謝通路和生物合成途徑進(jìn)行理性設(shè)計(jì)和優(yōu)化，以構(gòu)建高效底物供給的微生物底盤(pán)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的高效合成［8-9］。在過(guò)去的二十年中，研究人員已利用高效底物供給的微生物底盤(pán)實(shí)現(xiàn)了多種天然產(chǎn)物的高效合成，如生物燃料法尼烯［10］，抗瘧疾藥物青蒿素前體青蒿酸［11-12］，抗癌藥物紫杉醇前體紫杉二烯［13-14］，以及檸檬烯、瓦倫烯等香精原料［15-17］。

然而，在取得一系列研究進(jìn)展的同時(shí)，天然產(chǎn)物生物合成研究仍面臨諸多挑戰(zhàn)。首先，在產(chǎn)物挖掘方面，隨著基因組數(shù)據(jù)的快速增長(zhǎng)，功能未知的天然產(chǎn)物生物合成基因（簇）數(shù)量已遠(yuǎn)超已知功能的基因簇。因此，如何有效利用海量基因組信息高效挖掘天然產(chǎn)物“暗物質(zhì)”成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)［18］。其次，在產(chǎn)物高效合成方面，研究人員需要投入大量時(shí)間來(lái)對(duì)菌株和發(fā)酵生產(chǎn)工藝進(jìn)行代謝工程、酶工程和發(fā)酵工程等多個(gè)方面的系統(tǒng)改造和優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的高效合成［19-21］。此外，在產(chǎn)物篩選和檢測(cè)方面，快速、靈敏、高通量的目標(biāo)產(chǎn)物篩選和檢測(cè)方法的匱乏仍然是限制其生物合成研究高效開(kāi)展的瓶頸之一。因此，研究人員亟需開(kāi)發(fā)更快速、靈敏且高通量的篩選和檢測(cè)方法，以推動(dòng)天然產(chǎn)物的挖掘和高效合成改造過(guò)程。

針對(duì)上述問(wèn)題，自動(dòng)化高通量（automated high-throughput， Auto-HTP）技術(shù)在天然產(chǎn)物的挖掘、高效合成和快速篩選等研究領(lǐng)域逐漸得到廣泛應(yīng)用，并取得了顯著的成果［22-23］。利用自動(dòng)化高通量設(shè)備進(jìn)行海量的工程化試錯(cuò)，取代傳統(tǒng)的勞動(dòng)密集型研究范式，能夠更快速、低成本、多循環(huán)地完成“設(shè)計(jì)-構(gòu)建-測(cè)試-學(xué)習(xí)”這一閉環(huán)，實(shí)現(xiàn)天然產(chǎn)物的高效自動(dòng)化挖掘，并為構(gòu)建高附加值化合物細(xì)胞工廠提供可行方案［24-26］。本文聚焦于Auto-HTP技術(shù)在天然產(chǎn)物生物合成領(lǐng)域的應(yīng)用。首先，介紹了相對(duì)于傳統(tǒng)篩選方法，高通量篩選的優(yōu)缺點(diǎn)，以及Auto-HTP工作站的組成部分和運(yùn)行流程，并概述了目前國(guó)內(nèi)外Auto-HTP基礎(chǔ)設(shè)施平臺(tái)的發(fā)展現(xiàn)狀。隨后，重點(diǎn)介紹了當(dāng)前Auto-HTP技術(shù)在天然產(chǎn)物挖掘、高效合成和快速檢測(cè)方面的研究進(jìn)展。最后，總結(jié)了目前Auto-HTP技術(shù)在天然產(chǎn)物生物合成領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)，并展望了未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。Auto-HTP技術(shù)的應(yīng)用將為天然產(chǎn)物的深入挖掘和高效生物合成提供強(qiáng)大的支撐。

1 自動(dòng)化高通量技術(shù)

1.1 自動(dòng)化高通量技術(shù)的優(yōu)勢(shì)

Auto-HTP技術(shù)的發(fā)展始于20世紀(jì)90年代初，并隨著對(duì)高通量處理的需求不斷增加，進(jìn)一步推動(dòng)了小型化和自動(dòng)化技術(shù)的發(fā)展［27］。自動(dòng)化步驟包括取樣、稀釋樣品、混合樣品轉(zhuǎn)移、目標(biāo)產(chǎn)物檢測(cè)以及數(shù)據(jù)分析等［28-29］。隨著新設(shè)備、新技術(shù)的推出，如菌落拾取器［30］、液體處理系統(tǒng)［31］、熒光激活細(xì)胞分選［32］和液體微流體技術(shù)［33］，Auto-HTP的應(yīng)用范圍得到極大的擴(kuò)展?，F(xiàn)如今，Auto-HTP已成為常規(guī)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，在合成生物學(xué)的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究中得到廣泛應(yīng)用。表1對(duì)比了傳統(tǒng)方法和Auto-HTP技術(shù)在天然產(chǎn)物挖掘、高效合成和快速檢測(cè)三個(gè)方面的特點(diǎn)，展示了Auto-HTP在天然產(chǎn)物生物合成領(lǐng)域廣闊的應(yīng)用前景。

表1 傳統(tǒng)方法與自動(dòng)化高通量方法在天然產(chǎn)物生物合成中的比較Table 1 A comparison of automated high-throughput and traditional methods in natural product biosynthesis

在利用“突變-篩選”策略獲取高產(chǎn)菌株的過(guò)程中，傳統(tǒng)方法通常使用瓊脂平板活性篩選，如基于透明圈或顏色圈的篩選，或是基于抗性瓊脂平板的選擇性篩選［34］［圖1（a）］。然而，這些方法對(duì)突變體間的微小差異的分辨率低，僅適用于對(duì)突變體庫(kù)進(jìn)行初步篩選，并需要結(jié)合其他方法進(jìn)行精確定量分析［35］。為了解決上述問(wèn)題，基于熒光或吸光度精確檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物的微孔板篩選法應(yīng)運(yùn)而生，并已廣泛應(yīng)用于酶和細(xì)胞工廠的定向改造［36-37］。通過(guò)引入自動(dòng)單克隆采集系統(tǒng)、液體自動(dòng)處理系統(tǒng)等自動(dòng)化設(shè)備，研究通量得以提升，同時(shí)也顯著減少了人力和時(shí)間成本［38］。目前這些自動(dòng)化設(shè)備可以代替研究人員完成一些耗時(shí)的實(shí)驗(yàn)操作，包括分子克隆、質(zhì)粒構(gòu)建以及對(duì)應(yīng)底盤(pán)系統(tǒng)中目標(biāo)基因功能的測(cè)試等［圖1（b）］。目前已有研究人員將自動(dòng)化高通量設(shè)備引入天然產(chǎn)物的挖掘領(lǐng)域，結(jié)合高產(chǎn)微生物底盤(pán)，有效解決了傳統(tǒng)天然產(chǎn)物挖掘過(guò)程中效率低和通量低的瓶頸，具體內(nèi)容在將后文詳細(xì)介紹。

圖1 不同通量篩選方法的比較［41-42］Fig. 1 A comparison of different screening methods[41-42]

隨著生物技術(shù)快速進(jìn)步和儀器設(shè)備的革新，熒光激活細(xì)胞分選（fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）和液滴微流控分選（droplet-based microfluidic sorting，DMFS）技術(shù)在天然產(chǎn)物的快速檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用［31-32］。其中，F(xiàn)ACS是一種基于流式細(xì)胞儀的高效熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)，可根據(jù)單個(gè)細(xì)胞的熒光信號(hào)差異進(jìn)行精確分選，其通量高達(dá)每秒106個(gè)細(xì)胞［39-40］。該技術(shù)已較為成熟，并適用于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞膜上的目標(biāo)產(chǎn)物的篩選［圖1（c）］。對(duì)于胞外游離產(chǎn)物，則需要結(jié)合液滴微流控技術(shù)對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行封裝，并對(duì)其周邊微環(huán)境進(jìn)行分析［圖1（d）］［41］。此外，F(xiàn)ACS和DMFS與生物傳感器、拉曼光譜等先進(jìn)技術(shù)結(jié)合，可以進(jìn)一步提高天然產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選通量和效率。

1.2 自動(dòng)化高通量設(shè)施平臺(tái)的建立

在當(dāng)前天然產(chǎn)物研究中，Auto-HTP的有效利用對(duì)于加快天然產(chǎn)物研究具有重要意義。通過(guò)自動(dòng)化替代傳統(tǒng)的費(fèi)時(shí)費(fèi)力的常規(guī)操作，例如分子克隆和菌株構(gòu)建，可以實(shí)現(xiàn)快速、大規(guī)模的工程試錯(cuò)閉環(huán)運(yùn)行，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)自然界豐富天然產(chǎn)物資源的快速挖掘［43］。自動(dòng)化高通量設(shè)施平臺(tái)在國(guó)內(nèi)外得到積極發(fā)展，為自動(dòng)化合成生物技術(shù)的進(jìn)一步推動(dòng)提供了支持。例如，美國(guó)伊利諾伊大學(xué)的iBioFAB（Illinois Biological Foundry for Advanced Biomanufacturing）、英國(guó)愛(ài)丁堡大學(xué)的EGF（Edinburgh Genome Foundry）和帝國(guó)理工學(xué)院為核心組建的SynBICITE（Synthetic Biology Innovation， Commercial and Industrial Translation Engine）等機(jī)構(gòu)［24］。此外，全球合成生物設(shè)施聯(lián)盟（Global Biofoundry Alliance， GBA）的成立進(jìn)一步促進(jìn)了全球范圍內(nèi)的合作和交流［44］。其中，中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院牽頭建設(shè)的“深圳合成生物研究重大科技基礎(chǔ)設(shè)施”與天津大學(xué)合成生物學(xué)前沿科學(xué)中心成為GBA中來(lái)自中國(guó)的發(fā)起單位［45］，展示了中國(guó)在該領(lǐng)域的重要地位和貢獻(xiàn)。

在合成生物學(xué)的研發(fā)過(guò)程中，快速試錯(cuò)具有巨大優(yōu)勢(shì)。因此，除國(guó)家科研機(jī)構(gòu)，自動(dòng)化高通量篩選技術(shù)也成為企業(yè)的關(guān)鍵技能。包括Amyris、Ginkgo Bioworks、凱賽生物等國(guó)內(nèi)外合成生物學(xué)領(lǐng)域重要企業(yè)，都已建立了高通量、自動(dòng)化、數(shù)據(jù)化的篩選平臺(tái)，以縮短從菌株改造到實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)的研發(fā)周期。Ginkgo Bioworks公司作為自動(dòng)化平臺(tái)的先驅(qū)之一，其第一代自動(dòng)化鑄造廠每月可完成多達(dá)1.5萬(wàn)個(gè)自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)，隨后推出的Biowork2進(jìn)一步提高了設(shè)備集成度和小型化程度，使效率提升了6倍［46］。這些設(shè)施平臺(tái)在硬件方面采用微孔板作為載具，并配備自動(dòng)化儀器，例如自動(dòng)化移液工作站、自動(dòng)冷凍離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、連續(xù)分液儀、封膜儀、撕膜儀、自動(dòng)化PCR儀和自動(dòng)挑克隆機(jī)器人等。這些儀器之間通過(guò)軌道機(jī)械臂對(duì)接，實(shí)現(xiàn)樣品、試劑和耗材在不同設(shè)備之間的自動(dòng)化傳輸［圖2（a）］。同時(shí)，還需要一個(gè)集成軟件系統(tǒng)自動(dòng)化控制儀器設(shè)備的正常運(yùn)行［47］。以釀酒酵母為例，Auto-HTP工作站可自動(dòng)化完成分子克隆、酵母轉(zhuǎn)化、菌株篩選等實(shí)驗(yàn)室常規(guī)操作［圖2（b）］，極大地提高工作效率并節(jié)省了人力和物力成本。

圖2 自動(dòng)化高通量工作站Fig. 2 Automated high-throughput workstation

隨著合成生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，自動(dòng)化、智能化、信息化的研究平臺(tái)已成為工、農(nóng)、醫(yī)等各大領(lǐng)域應(yīng)用的科研利器。例如，伊利諾伊大學(xué)趙惠民教授團(tuán)隊(duì)［48］開(kāi)發(fā)了一種自動(dòng)化組裝類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子感受器核酸酶（transcription activator-like effector nucleases， TALEN）蛋白的方法。該方法利用iBioFAB平臺(tái)實(shí)現(xiàn)DNA自動(dòng)化組裝，每天可以構(gòu)建多達(dá)1000個(gè)編碼TALEN蛋白的DNA，且每對(duì)TALEN表達(dá)載體的成本僅為商業(yè)售價(jià)的0.3%。此外，iBioFAB平臺(tái)可全自動(dòng)對(duì)釀酒酵母基因組進(jìn)行定向進(jìn)化，快速獲得最具乙酸耐受能力的酵母菌株［49］。基于Auto-HTP平臺(tái)在其他領(lǐng)域展現(xiàn)的強(qiáng)大功能，我們有理由相信該策略將為天然產(chǎn)物研究提供強(qiáng)有力的支持。

2 自動(dòng)化高通量技術(shù)在天然產(chǎn)物生物合成中的應(yīng)用

2.1 天然產(chǎn)物的挖掘

傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物挖掘策略通常是基于單一生物樣本，對(duì)其天然產(chǎn)物直接分離、同源激活、異源表達(dá)。這些經(jīng)典策略一定程度上實(shí)現(xiàn)了天然產(chǎn)物的有效挖掘［4，50］。然而，在面對(duì)低豐度的產(chǎn)物挖掘時(shí)仍顯得捉襟見(jiàn)肘，且大部分研究仍局限于單個(gè)基因（簇）的異源表達(dá)，存在通量低、耗時(shí)長(zhǎng)和效率低等問(wèn)題［51］，使得天然產(chǎn)物的挖掘進(jìn)入了瓶頸期。為應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，武漢大學(xué)劉天罡教授［5］提出“一類(lèi)鑰匙一類(lèi)鎖”的研究理念，并開(kāi)發(fā)了一系列微生物萜類(lèi)高產(chǎn)底盤(pán)，以充分釋放酶的產(chǎn)物合成潛力。這種方法顯著提高了產(chǎn)物產(chǎn)量，將研究效率提升了3～5倍，加速了萜類(lèi)合酶的挖掘進(jìn)程。

近年來(lái)，隨著基因組測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)計(jì)算工具興起和蓬勃發(fā)展，使得大量微生物基因組信息得以擴(kuò)展并存儲(chǔ)在數(shù)據(jù)庫(kù)中［52-55］。這為研究人員提供了大量功能未知的天然產(chǎn)物生物合成基因（簇），然而傳統(tǒng)的個(gè)性化挖掘策略難以滿(mǎn)足海量基因（簇）挖掘的需求。因此，劉天罡教授團(tuán)隊(duì)［56］將自動(dòng)化高通量平臺(tái)引入天然產(chǎn)物生物合成領(lǐng)域，并結(jié)合釀酒酵母高產(chǎn)底盤(pán)，對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)所有真菌來(lái)源稀有嵌合萜類(lèi)合酶進(jìn)行挖掘，成功地從34個(gè)新的嵌合萜類(lèi)合酶中鑒定了24個(gè)二萜和二倍半萜產(chǎn)物［圖3（a）］，數(shù)量超過(guò)了已報(bào)道該類(lèi)酶總數(shù)的一倍。該策略為萜類(lèi)化合物的挖掘提供了一個(gè)強(qiáng)大而高效的方法，擺脫了對(duì)生物樣本的依賴(lài)，充分挖掘并利用數(shù)據(jù)庫(kù)現(xiàn)有資源。同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了萜類(lèi)合酶的跨物種批量研究和實(shí)驗(yàn)過(guò)程的自動(dòng)化，推動(dòng)了萜類(lèi)天然產(chǎn)物挖掘進(jìn)入規(guī)?；妥詣?dòng)化研究階段［57-58］。

圖3 基于生物鑄造平臺(tái)對(duì)新功能萜類(lèi)基因（簇）的高效挖掘及抗炎新分子mangicol J的高效合成［51，56］Fig. 3 The application of biocasting in efficient mining of new functional terpenoid genes (gene clusters) and the biosynthesis of mangicol J, a new anti-inflammatory molecule[51,56]

隨后該團(tuán)隊(duì)采用組合生物合成策略，對(duì)絲狀真菌萜類(lèi)合酶基因簇進(jìn)行系統(tǒng)挖掘。開(kāi)發(fā)了以米曲霉（Aspergillus oryzae）作為底盤(pán)的Auto-HTP生物鑄造體系，在自動(dòng)化平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)了從質(zhì)粒構(gòu)建、基因簇重建到生物活性篩選等全流程的高通量自動(dòng)化操作。利用該方案，成功地重建了39個(gè)絲狀真菌萜類(lèi)基因簇，構(gòu)建了208個(gè)突變株，并檢測(cè)到185個(gè)萜類(lèi)產(chǎn)物［圖3（b）～（e）］，將實(shí)驗(yàn)周期縮短至29天，極大地提高了研究效率，并實(shí)現(xiàn)了研究方法的迭代升級(jí)。通過(guò)該方案，獲得具有顯著抗炎活性的二倍半萜產(chǎn)物mangicol J［圖3（c）］，并揭示了其生物合成機(jī)制［圖3（d）］。通過(guò)代謝途徑改造，將mangicol J產(chǎn)量提升了111倍［圖3（e）］［51］。這一“基于微生物高產(chǎn)底盤(pán)和生物鑄造平臺(tái)”的萜類(lèi)產(chǎn)物創(chuàng)新挖掘策略，為萜類(lèi)產(chǎn)物的挖掘和開(kāi)發(fā)提供了包括“基因簇挖掘—活性篩選—生物合成機(jī)制解析—產(chǎn)物高效合成”等流程在內(nèi)的高效解決方案，克服了傳統(tǒng)挖掘方法中通量低的限制。相信該策略將在未來(lái)推動(dòng)其他類(lèi)型天然產(chǎn)物的快速挖掘，并加速天然產(chǎn)物研究領(lǐng)域的發(fā)展。

2.2 天然產(chǎn)物的高效合成

微生物細(xì)胞工廠在生物制造中扮演著重要的角色，但通常需要經(jīng)過(guò)多輪迭代改造才能滿(mǎn)足實(shí)際的生產(chǎn)需求。這一過(guò)程中，高效獲得具有目標(biāo)特性的工程菌株至關(guān)重要［59］。然而，受通量低和檢測(cè)速度慢等多種因素限制，傳統(tǒng)方法在突變體大規(guī)模篩選時(shí)耗時(shí)較長(zhǎng)［32，60］。通過(guò)Auto-HTP可以快速高效地對(duì)一系列底盤(pán)細(xì)胞進(jìn)行多維改造，從而獲得高效天然產(chǎn)物微生物細(xì)胞工廠。例如，Amyris公司的自動(dòng)化菌株改造平臺(tái)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)底盤(pán)細(xì)胞的持續(xù)改造，配置的高通量、自動(dòng)化、數(shù)據(jù)化的篩選系統(tǒng)每周平均可以篩選出350個(gè)高產(chǎn)法尼烯菌株，顯著縮短了從菌株改造到實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)的研發(fā)周期。利用該平臺(tái)成功在人工酵母中合成角鯊烯，用于替代傳統(tǒng)的鯊魚(yú)肝油提取方法［44］。這種技術(shù)不僅為醫(yī)藥、食品等多個(gè)領(lǐng)域提供了優(yōu)良的細(xì)胞工廠，也是實(shí)現(xiàn)“造物致用”的重要手段之一。

近年來(lái)，研究人員通過(guò)不同的檢測(cè)原理和針對(duì)各種產(chǎn)物的策略，成功提高了多種天然產(chǎn)物工業(yè)菌株產(chǎn)量，為工業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了可觀的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［61-63］。例如，Lauchli等［64］成功合成了一種含有異戊二烯二磷酸的乙烯基醚，其結(jié)構(gòu)類(lèi)似于FPP，經(jīng)萜類(lèi)合酶（terpene synthase，TPS）催化后該分子會(huì)釋放出甲醇。接著，在倍半萜合酶BcBOT2定向進(jìn)化過(guò)程中，研究人員使用甲醇偶聯(lián)酶測(cè)定法對(duì)萜類(lèi)產(chǎn)物hemiacetal進(jìn)行測(cè)定，并利用高通量篩選技術(shù)對(duì)2800個(gè)突變株進(jìn)行篩選。在保證產(chǎn)物組成、酶活等其他特性不變的前提下，大幅提升了該酶的熱穩(wěn)定性。這一技術(shù)的應(yīng)用成功加速了hemiacetal的工業(yè)化生產(chǎn)研究進(jìn)程，同時(shí)也為其他具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的萜類(lèi)化合物研究提供了一種可行的方法。Furubayashi等［65］開(kāi)發(fā)了一種基于底物競(jìng)爭(zhēng)的TPS高通量比色測(cè)定方法，通過(guò)TPS與類(lèi)胡蘿卜素合成途徑對(duì)底物的競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致最終溶液的顏色深淺差異，來(lái)評(píng)估紫杉二烯合酶、馬兜鈴烯合酶、香葉醇合酶的活性。Zhou等［66］通過(guò)易錯(cuò)PCR對(duì)酪氨酸解氨酶（tyrosine ammonia-lyase，TAL）進(jìn)行隨機(jī)誘變，并利用auto-HTP快速、高通量篩選高產(chǎn)突變株，通過(guò)檢測(cè)315 nm處的吸光度從眾多突變株中篩選出3種對(duì)香豆酸生產(chǎn)滴度最高的：MT-S9N，MT-A11T和MT-E518V。對(duì)三位點(diǎn)同時(shí)突變（MT-S9N/-A11T/-E518V）進(jìn)一步提高了酶活性，相較于野生型TAL提高了65.9%。

此外，研究人員通過(guò)改進(jìn)傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法，不僅提升了培養(yǎng)通量和培養(yǎng)能力，還進(jìn)一步降低了試劑耗材的消耗和勞動(dòng)力成本［67-68］。其中，由我國(guó)研究人員研發(fā)的微生物微液滴培養(yǎng)儀，能夠利用液滴微流控、光電傳感與控制和自動(dòng)化技術(shù)，實(shí)現(xiàn)微生物液滴的平行培養(yǎng)、生長(zhǎng)曲線測(cè)定和適應(yīng)性進(jìn)化［69］。該系統(tǒng)在常見(jiàn)微生物如大腸桿菌、釀酒酵母和乳酸桿菌等方面表現(xiàn)出穩(wěn)定的傳代能力，使微生物能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化、高通量自適應(yīng)性進(jìn)化，從而獲得在某些脅迫條件下耐受性增強(qiáng)的菌株［70-71］。鑒于該系統(tǒng)的高度綜合性和多功能性，未來(lái)可在微生物培養(yǎng)條件的多因素優(yōu)化［72］以及單細(xì)胞液滴的高通量培養(yǎng)［73-74］等方面得到廣泛應(yīng)用。

2.3 天然產(chǎn)物的檢測(cè)

在開(kāi)發(fā)各類(lèi)天然產(chǎn)物高效合成細(xì)胞工廠的過(guò)程中，準(zhǔn)確檢測(cè)和精準(zhǔn)定量目標(biāo)代謝至關(guān)重要。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，如氣相色譜、液相色譜、質(zhì)譜和核磁共振［75］，已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的檢測(cè)。然而這些方法存在一些限制，如耗時(shí)長(zhǎng)、通量低以及對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率和純度要求較高。為此，近年來(lái)涌現(xiàn)出一系列天然產(chǎn)物高通量的篩選方法，如基于紫外/可見(jiàn)光譜、熒光光譜和生物傳感器的熒光篩選方法。紫外/可見(jiàn)光譜適用于具有相對(duì)復(fù)雜分子結(jié)構(gòu)或帶有顏色的天然產(chǎn)物，如阿維菌素［32］、番茄紅素［76］、頭孢菌素C等［77］，可以通過(guò)直接測(cè)量吸光度進(jìn)行篩選。對(duì)于那些沒(méi)有明顯吸光度特性的產(chǎn)物，可以通過(guò)添加pH指示劑、與金屬離子螯合、與酶或化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)來(lái)檢測(cè)［30，78-79］［圖4（a）］。該方法已廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)天然產(chǎn)物檢測(cè)中，并且由于酶標(biāo)儀體積較小，更易與自動(dòng)化設(shè)備整合，進(jìn)一步提高了檢測(cè)通量和效率。例如，趙惠民團(tuán)隊(duì)［80］將iBioFAB自動(dòng)化平臺(tái)與機(jī)器學(xué)習(xí)算法相結(jié)合，通過(guò)吸光度對(duì)番茄紅素進(jìn)行精確定量，實(shí)現(xiàn)了番茄紅素生物合成途徑的快速迭代優(yōu)化。與紫外/可見(jiàn)光譜類(lèi)似，基于熒光光譜的HTP可以根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)品的特性分為直接和間接檢測(cè)方法［圖4（b）］。例如，Gao等［81］通過(guò)重組紅色熒光蛋白篩選纖維素酶，將內(nèi)切葡聚糖酶活性提高了1.6～2.3倍。使用熒光染料/探針進(jìn)行篩選也是常見(jiàn)方法，例如使用熒光染料標(biāo)記死細(xì)胞或活細(xì)胞［32］，用羅丹明定量甲萘鯤和聚蘋(píng)果酸［82-83］。另外，利用（2S）-柚皮素與金屬離子相互作用產(chǎn)生的紫外熒光光譜，可以實(shí)現(xiàn)（2S）-柚皮素的快速檢測(cè)［84］。此外，基于產(chǎn)生熒光信號(hào)的化學(xué)或酶偶聯(lián)反應(yīng)的方法也廣泛應(yīng)用于改良工業(yè)微生物菌種的篩選［85-86］。相較于傳統(tǒng)的氣相/液相色譜法，這些方法有著便捷、迅速、高通量的特點(diǎn)，并且易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，將成為未來(lái)助力天然產(chǎn)物快速檢測(cè)的重要工具。

針對(duì)無(wú)法通過(guò)直接或間接顏色或熒光反應(yīng)檢測(cè)的天然產(chǎn)物，生物傳感器的熒光篩選策略可作為一種替代方案［87-88］。細(xì)菌感知環(huán)境中特定分子并相應(yīng)地觸發(fā)代謝反應(yīng)的能力為生物傳感器的開(kāi)發(fā)創(chuàng)造了許多機(jī)會(huì)［89］。生物傳感器由傳感器和報(bào)告器兩部分組成，其中傳感器能夠識(shí)別特定的細(xì)胞內(nèi)代謝物，而報(bào)告器則通過(guò)一系列與傳感器信號(hào)響應(yīng)的程序化遺傳回路產(chǎn)生定量信號(hào)。生物傳感器分為蛋白質(zhì)和核酸兩種類(lèi)型。蛋白質(zhì)生物傳感器通常以轉(zhuǎn)錄因子和熒光蛋白為基礎(chǔ)［90］。例如，Sun等［91］鑒定到一種能夠與白藜蘆醇發(fā)生反應(yīng)的MarR轉(zhuǎn)錄因子，利用該轉(zhuǎn)錄因子開(kāi)發(fā)的生物傳感器能夠有效區(qū)分白藜蘆醇與其前體物質(zhì)［原理如圖4（c）①、②所示］，在一輪FACS中，熒光響應(yīng)強(qiáng)度較對(duì)照組提高了667倍。另外，核酸生物傳感器則是以核糖開(kāi)關(guān)為基礎(chǔ)，核糖開(kāi)關(guān)是在細(xì)菌mRNA的5′-UTR中發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)元件，當(dāng)與特定代謝物結(jié)合后，會(huì)誘導(dǎo)構(gòu)象變化，并對(duì)下游基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和調(diào)控［92］。例如，Xiu等［93］設(shè)計(jì)了一種響應(yīng)柚皮素的RNA核糖開(kāi)關(guān)生物傳感器，當(dāng)該生物傳感器與柚皮素結(jié)合后，基因表達(dá)激活熒光信號(hào)產(chǎn)生［原理如圖4（c）③所示］。經(jīng)過(guò)遺傳改造的生物傳感器，可實(shí)現(xiàn)對(duì)天然產(chǎn)物快速、實(shí)時(shí)的檢測(cè)和高效的篩查。此外，將生物傳感器與其他先進(jìn)高通量技術(shù)（如FACS和DMFS）相結(jié)合，可以進(jìn)一步提升自動(dòng)篩選的效率［94］。

除了上述方法外，基于拉曼光譜、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和傅里葉變換近紅外光譜（FTNIR）等先進(jìn)儀器平臺(tái)的光譜技術(shù)也正在逐步得到應(yīng)用。其中，拉曼光譜具有快速、靈敏、無(wú)損、實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。例如，Wang等［96］開(kāi)發(fā)了一種集成的拉曼激活液滴分選微流體系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)蝦青素雨生紅球藻的精確化、高通量、高活性保持的分選。與拉曼光譜類(lèi)似，F(xiàn)TIR和FTNIR也是無(wú)損分析方法，具有高通量和快速自動(dòng)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。將這些光譜技術(shù)及其先進(jìn)的成像技術(shù)與Auto-HTP相結(jié)合，在天然產(chǎn)物的生物合成中具有巨大潛力。

3 總結(jié)與展望

當(dāng)前，人類(lèi)正面臨日漸嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，包括疾病肆虐、環(huán)境破壞和能源枯竭等。在過(guò)去的一個(gè)多世紀(jì)中，天然產(chǎn)物作為“環(huán)境友好”型先導(dǎo)分子，在醫(yī)藥健康和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，并得到廣泛應(yīng)用［97］。生物信息學(xué)分析表明，目前僅有3%的細(xì)菌來(lái)源天然產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)，即使是深入研究的類(lèi)群如鏈霉菌，仍存在大量未知的天然產(chǎn)物有待挖掘［98］。合成生物學(xué)作為新興的科學(xué)領(lǐng)域，在生物醫(yī)藥與大健康、生物化工、食品與農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域已經(jīng)取得了多項(xiàng)標(biāo)志性成果［99-100］。在合成生物學(xué)理念指導(dǎo)下，天然產(chǎn)物的挖掘效率得到進(jìn)一步提升。例如，Yuan等［51］采用“bottom-up”策略將39個(gè)基因簇重構(gòu)為208個(gè)突變株，獲得185種產(chǎn)物，充分釋放了基因簇中各個(gè)酶的催化潛力。此外，合成生物學(xué)工具，如各種微生物高產(chǎn)底盤(pán)和經(jīng)遺傳改造的生物傳感器，在天然產(chǎn)物的高效合成和快速檢測(cè)方面起到了重要的支持作用。因此，在合成生物學(xué)理念指導(dǎo)下，配備Auto-HTP平臺(tái)，可以更高效、充分地挖掘自然界中的天然產(chǎn)物“暗物質(zhì)”。

雖然Auto-HTP在不同領(lǐng)域中取得了應(yīng)用并提高了通量，并實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化，但仍然面臨一些挑戰(zhàn)。首先是成本問(wèn)題，建立一套完整的auto-HTP工作站需要多臺(tái)昂貴且維護(hù)成本高的機(jī)械自動(dòng)化設(shè)備，如菌落自動(dòng)拾取器和液體處理系統(tǒng)，這限制了其廣泛應(yīng)用。其次，一些HTP系統(tǒng)（如DMFS）操作過(guò)程復(fù)雜且技術(shù)性強(qiáng)，且現(xiàn)有裝置多由實(shí)驗(yàn)室研制，仍未得到大范圍推廣［101-102］。再次，目前主流的FACS和DMFS依賴(lài)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，雖然已有基于吸光度和拉曼光譜的DMFS報(bào)道［95，103］，但其靈敏度和篩選通量遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)要求，難以滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需求。最后，目前仍缺乏高度集成的工程化研究平臺(tái)，以進(jìn)行系統(tǒng)化的天然產(chǎn)物資源研究和挖掘。

雖然仍面臨諸多挑戰(zhàn)，但自動(dòng)化合成生物技術(shù)在天然產(chǎn)物生物合成領(lǐng)域已取得廣泛應(yīng)用。我國(guó)已建成或正在建設(shè)多個(gè)大型合成生物學(xué)基礎(chǔ)設(shè)施平臺(tái)，并將依托這些平臺(tái)進(jìn)一步挖掘未知生物合成元件、代謝途徑和天然產(chǎn)物?；诤铣缮飳W(xué)策略，研究人員可以從改造催化途徑酶、整合生物途徑和化學(xué)途徑，以及改造底盤(pán)細(xì)胞等方面著手，以實(shí)現(xiàn)高價(jià)值天然產(chǎn)物的高效合成［104］。隨著人工智能的快速進(jìn)步和生物大數(shù)據(jù)的不斷發(fā)展，我們相信，當(dāng)前Auto-HTP運(yùn)行模式有望進(jìn)一步提升，并降低成本。

綜上所述，自動(dòng)化合成生物技術(shù)近年來(lái)在天然產(chǎn)物的生物合成領(lǐng)域取得了多項(xiàng)突破性進(jìn)展。但作為近十年來(lái)迅速發(fā)展的研究手段，其仍處于發(fā)展初期［27］，需要合成生物、信息技術(shù)、自動(dòng)化等多領(lǐng)域的研究人員共同協(xié)作，對(duì)設(shè)施平臺(tái)進(jìn)行不斷的更新和優(yōu)化。盡管還存在著諸多不成熟的地方以及有待進(jìn)一步解決的問(wèn)題，但相信其具備的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)將會(huì)為天然產(chǎn)物的深入挖掘和高效生物合成提供強(qiáng)大支撐，為新型天然產(chǎn)物功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供可持續(xù)來(lái)源。