高粱根際高親和性解磷復(fù)合菌系的構(gòu)建及溶磷、促生效果

白文斌，馮家璇，高振峰

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 高粱研究所，山西 晉中，030600；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，山西 晉中，030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太原，030031）

磷作為植物生長(zhǎng)發(fā)育過程必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素之一，是植物體內(nèi)各種物質(zhì)的重要組成部分，參與植物體內(nèi)眾多代謝反應(yīng)。植物缺磷會(huì)導(dǎo)致根系生長(zhǎng)受限，延緩作物生長(zhǎng)，造成作物減產(chǎn)，因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中施用磷肥成為維持或提高作物產(chǎn)量的重要栽培措施之一［1-2］。然而，我國(guó)耕地有效磷含量普遍偏低［3］，且近年來受“高投入、高產(chǎn)出”栽培觀念的影響，磷肥過量施用問題在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中時(shí)有發(fā)生，不僅增產(chǎn)效果不顯著，而且作物當(dāng)季磷肥利用率普遍低于30%［4-5］，導(dǎo)致大量磷被土壤固定轉(zhuǎn)化為難以被植物吸收利用的難溶性磷酸鹽，這不僅造成資源浪費(fèi)，同時(shí)也帶來了一系列環(huán)境問題［6］。根據(jù)20 世紀(jì)80 年代全國(guó)第二次土壤普查的數(shù)據(jù)，我國(guó)耕地中的難溶性磷含量約占土壤總磷含量的95%～99%［7］。因此，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中活化利用土壤中的難溶性磷，對(duì)磷肥減量施用和保護(hù)我國(guó)生產(chǎn)磷肥所需的不可再生資源——磷礦具有重要意義。

解磷微生物是一種可將土壤中難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為植物可以吸收利用的有效磷的特殊微生物，目前國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)植物根際、非根際土壤、植物體內(nèi)、動(dòng)物體內(nèi)、磷礦地、海洋等生境下的放線菌、真菌和細(xì)菌解磷微生物進(jìn)行了大量研究，其中以解磷細(xì)菌微生物資源最為豐富，約占溶磷微生物總數(shù)的1%～50%，且主要種類為伯克霍爾德菌屬（Burkholderia）和芽孢桿菌屬（Bacillu）［8-10］。近年來，國(guó)內(nèi)外研究者雖還對(duì)解磷微生物的生物學(xué)作用和作用機(jī)制進(jìn)行了大量研究［10-11］，且相關(guān)研究成果為基于解磷微生物的土壤難溶性磷活化利用、作物低磷栽培和磷肥減施目標(biāo)實(shí)現(xiàn)提供了新思路和科學(xué)依據(jù)，但目前有關(guān)高粱根際解磷微生物的研究還較少［12-14］，特別是構(gòu)建有機(jī)—無機(jī)難溶性磷復(fù)合菌群方面的研究還少見相關(guān)報(bào)道。此外，受土壤環(huán)境、作物根際微環(huán)境及栽培模式等多種因素的影響，不同作物根際、不同菌種或菌株的溶磷能力存在一定差異［15-16］，因此，本研究以高粱為研究對(duì)象，以實(shí)現(xiàn)土壤中難利用磷的高效利用為核心目的，借助解磷細(xì)菌對(duì)土壤難溶性磷的活化作用優(yōu)勢(shì)，利用課題組前期分離、鑒選出的解磷細(xì)菌資源，構(gòu)建既可在高粱根際有效定殖，又可同時(shí)降解土壤有機(jī)和無機(jī)難溶性磷的復(fù)合菌系，并對(duì)其促生和高粱耐低磷特性進(jìn)行研究，旨在為高粱節(jié)磷栽培技術(shù)和解磷細(xì)菌生物有機(jī)肥開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料來源

供試菌株：以高粱栽培課題組前期從不同作物根際、不同生境土壤中分離、純化，并由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室-80℃保藏和經(jīng)16S rDNA 序列鑒定的7 株解磷細(xì)菌為供試菌株（表1）。

表1 供試菌株編號(hào)、來源及解磷特性Table1 Strain number，source and characteristics of phosphate solubilization

供試高粱品種與土壤：供試品種為晉糯3 號(hào)、晉雜22 號(hào)和晉雜2001 號(hào)，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)高粱研究所提供。供試土壤為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)高粱研究所東白試驗(yàn)基地耕地土壤，類型為潮褐土，質(zhì)地為黏壤土?；A(chǔ)試驗(yàn)田土壤理化性質(zhì)為：pH 為8.44，有機(jī)質(zhì)20.6 g·kg-1，全氮0.063 g·kg-1，全磷1.23g·kg-1，速效磷10.55 mg·kg-1，速效鉀111.4 mg·kg-1。

1.1.2 培養(yǎng)基、主要試劑和儀器

LB 液體培養(yǎng)基、無機(jī)磷培養(yǎng)基、有機(jī)磷培養(yǎng)基、NA 固體培養(yǎng)基、利福平、Salkowski 顯色液等。所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1FD，浙江蘇凈凈化）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（DH4000A，天津市通利信達(dá)儀器廠）、恒溫振蕩培養(yǎng)箱（DHZD，上海培因?qū)嶒?yàn)儀器有限公司）、紫外可見分光光度計(jì)（SP-UV2500，上海光譜儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 高粱根際高親和性解磷細(xì)菌的篩選

（1）解磷菌高粱根際定殖能力測(cè)定：首先，參照高振峰等［17］描述的菌株活化方法、利福平抗性菌株誘導(dǎo)方法、遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)方法來對(duì)低溫保藏的7 株解磷細(xì)菌進(jìn)行活化、利福平抗性誘導(dǎo)和抗性菌株利福平抗性遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)，獲得利福平抗性標(biāo)記菌株；其次，以主栽高粱品種晉糯3 號(hào)、晉雜22 號(hào)和晉雜2001 號(hào)為試驗(yàn)對(duì)象，通過田間試驗(yàn)在高粱出苗30 d 后采用灌根接種法將100 mL 于LB 培養(yǎng)液28 ℃、160 r·min-1發(fā)酵24 h 且用無菌水調(diào)整菌液濃度為1.0×105cfu·mL-1的解磷細(xì)菌菌懸液接種至高粱根際，并于接種20 d 后收集根際土壤；最后，參照許昌超等［18］描述的方法，制備根際土壤懸浮液，稀釋1.0×105倍后采用平板涂布法于抗生素平板上檢測(cè)有機(jī)、無機(jī)磷降解細(xì)菌存活數(shù)量，進(jìn)而篩選出可在高粱根際土壤中高效定殖的有機(jī)、無機(jī)磷降解細(xì)菌。

（2）解磷細(xì)菌產(chǎn)IAA 能力差異分析：不同菌株接種至LB 培養(yǎng)液中在28 ℃、160 r·min-1條件下震蕩培養(yǎng)72 h 后，于8500 r·min-1、4 ℃下離心10 min收集上清液后采用Salkowski 比色法［19］測(cè)定不同解磷細(xì)菌產(chǎn)IAA 能力，并配制不同濃度IAA 標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 mg·L-1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.012x+0.002 9；R2=0.998 4；x代表IAA 濃度/（mg·L-1）；y代表OD530），用于發(fā)酵液中IAA 含量計(jì)算。

（3）解磷細(xì)菌促生效果田間試驗(yàn)：于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)高粱研究所東白試驗(yàn)基地，通過田間小區(qū)灌根接種試驗(yàn)測(cè)定各菌株對(duì)高粱生長(zhǎng)的促生作用。菌懸液制備方法與1.2.1（2）相同；菌液灌根濃度和用量分別為1.0×106cfu·mL-1和100 mL；灌根時(shí)間為高粱苗后30 d，間隔5 d 連續(xù)接種3 次，并于最后一次接種20 d 后，于小區(qū)中隨機(jī)選擇10 株測(cè)定高粱株高和莖粗。每小區(qū)5 m2，每處理重復(fù)3次。

1.2.2 菌株間親和性檢測(cè)［20］

首先，采用劃線法將鑒選出的較優(yōu)解磷和促生細(xì)菌接種至NA 平板上，培養(yǎng)36 h 后，使用接種環(huán)分別接種至LB 培養(yǎng)液中，并于28 ℃、160 r·min-1條件下恒溫震蕩培養(yǎng)48 h；其次，使用無菌水調(diào)整菌液濃度 為1.0×104cfu·mL-1，并 取1 mL 涂 布 于NA 平板；最后，待平板表面干燥后，將滅菌的濾紙片（Φ=5 mm）置于平板表面，每平板3 個(gè)，并于濾紙片上分別加入不同待測(cè)菌株不同濃度菌懸液（1.0×106和1.0×105cfu·mL-1）10 μL（即濾紙片待測(cè)菌株濃度分別為1.0×104和1.0×103cfu·mL-1），置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，觀察濾紙片周圍是否形成拮抗圈，并測(cè)量抑菌圈大小。所有菌株均被用作平板菌株和測(cè)試菌株，進(jìn)行交叉測(cè)試，各處理和試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.3 高粱根際高親和性解磷菌復(fù)合菌系構(gòu)建

以復(fù)合菌系的OD600吸光值和發(fā)酵液中可溶性磷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過響應(yīng)面CCD 設(shè)計(jì)（表2）對(duì)4 株可在3 高粱品種根際良好的定殖的解磷細(xì)菌較優(yōu)組合配比進(jìn)行優(yōu)化，從而構(gòu)建出對(duì)難溶性有機(jī)磷和無機(jī)磷均具有較好降解效果的復(fù)合菌系。

表2 復(fù)合菌系響應(yīng)面CCD 設(shè)計(jì)因素和水平表Tabe 2 The factors and levels of CCD design for response surface of compound bacteria單位：cfu·mL-1

（1）種子發(fā)酵液的制備

將4 菌株分別接種至LB 液體培養(yǎng)基中，于160 r·min-1、28 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)24 h 后，使用無菌發(fā)酵液將4 菌株發(fā)酵液中的菌濃度統(tǒng)一調(diào)整為1.0×105cfu·mL-1后開始后續(xù)試驗(yàn)。

（2）解磷細(xì)菌復(fù)合菌系的構(gòu)建

首先，依據(jù)菌株親和性測(cè)定結(jié)果，選擇1.0×104和1.0×103cfu·mL-1分別為最低和最高濃度，通過響應(yīng)面CCD 設(shè)計(jì)5 個(gè)初始混合發(fā)酵濃度水平（表2）和30個(gè)試驗(yàn)處理；其次，根據(jù)設(shè)計(jì)好的30個(gè)試驗(yàn)處理混合好4菌株，按照1%接種量接種至新鮮的有機(jī)和無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，160 r·min-1、28 ℃恒溫發(fā)酵培養(yǎng)72 h 后檢測(cè)各培養(yǎng)液（1.0×104稀釋液）在600 nm 下的吸光值和可溶性磷濃度，以空白發(fā)酵液為調(diào)零對(duì)照；再次，通過方差分析中的III 型平方和分析、響應(yīng)面圖、RDA 分析相結(jié)合的方法明確不同菌株不同配比下的互作關(guān)系，并在此基礎(chǔ)上利用III 型平方和分析模型進(jìn)行復(fù)合菌系優(yōu)選配比組合預(yù)測(cè)，得出復(fù)合菌系不同菌株較優(yōu)配比組合；最后，通過發(fā)酵試驗(yàn)驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性，進(jìn)而構(gòu)建出解磷活性突出的解磷細(xì)菌復(fù)合菌系。

1.2.4 復(fù)合解磷菌群對(duì)高粱耐低磷特性的影響及促生效果

（1）解磷菌復(fù)合發(fā)酵液的制備

采用LB 發(fā)酵液獲得4 菌株單菌株種子發(fā)酵液；隨后依據(jù)1.2.2 中構(gòu)建的復(fù)合菌起始發(fā)酵配比混合好4 菌株 接種至新 鮮LB 發(fā)酵液中，于160 r·min-1、28 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)72 h 后終止發(fā)酵獲得復(fù)合解磷菌群發(fā)酵液，用于后續(xù)試驗(yàn)。

（2）田間試驗(yàn)

田間試驗(yàn)于山西省晉中市榆次區(qū)山西農(nóng)業(yè)大學(xué)東白試驗(yàn)基地（112°40′E，37°32′N，海拔802 m）進(jìn)行。該試驗(yàn)基地屬溫帶大陸性半干旱季風(fēng)氣候區(qū)，春季干旱多風(fēng)、夏季高溫多雨、秋季旱澇無常、冬季寒冷少雪。降雨主要集中于6-9 月，年均氣溫9～10 ℃，＞0 ℃積溫3990 ℃，無霜期151 d 左右，最少日照數(shù)2535 h，多年平均降水量約450 mm。

以晉糯3 號(hào)為試驗(yàn)材料，采用二因素完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，菌液因素設(shè)置0、1.0×104、1.0×106、1.0×108和1.0×1010cfu·mL-15 個(gè)水平［25］；磷肥用量設(shè)置：P0（不施磷肥）、P1（減磷1/4）、P2（減磷1/3）、P3（減磷1/2）和P4（減磷2/3）；以正常施肥不加菌劑（即正常施用氮225 kg·hm-2、磷75 kg·hm-2、鉀肥75 kg·hm-2）為對(duì)照（CK），每小區(qū)10 m2，于苗后30 d 使用復(fù)合解磷菌系發(fā)酵液灌根，每株100 mL，每隔7 d 灌根1 次，連續(xù)灌根處理4 次，并于最后一次灌根結(jié)束后20 d 測(cè)定高粱地上部、地下部相關(guān)形態(tài)指標(biāo)。對(duì)照組采用等量、相同稀釋倍數(shù)的空白發(fā)酵液代替菌液灌根。各處理重復(fù)3 次，并在收獲期測(cè)定各小區(qū)產(chǎn)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，origin 2018 制作柱形圖，SPSS 17.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同高粱品種解磷細(xì)菌定殖力差異分析

通過利福平抗性誘導(dǎo)獲得了gz4-1、gz5-2、gz2-2、1-1、1-3、1-7 和3-5 抗生素抗性標(biāo)記菌株，且抗生素抗性標(biāo)記法定殖力檢測(cè)結(jié)果表明（圖1）：不同菌株在不同高粱品種根際定殖能力有一定差異；7 株解磷細(xì)菌中以菌株gz4-1、gz2-2、1-1 和1-3 在3個(gè)高粱品種根際定殖力較優(yōu)，4 菌株接種20 d 后在3個(gè)高粱品種根際的菌落數(shù)仍可達(dá)4.0×105cfu·g-1以上；菌株gz4-1在晉糯3號(hào)高粱根際土壤中的菌落數(shù)量明顯高于晉雜2001 號(hào)和晉雜22 號(hào)（P＜0.05）；菌株gz2-2、1-1 在晉雜2001 號(hào)高粱根際土壤中的菌落數(shù)量明顯高于晉糯3 號(hào)（P＜0.05），但菌株1-1在晉雜22 號(hào)根際土壤中的菌落數(shù)量卻顯著高于晉雜2001 號(hào)（P＜0.05）；菌株1-3 在晉雜22 號(hào)和晉糯3 號(hào)高粱根際土壤中的菌落數(shù)量明顯高于晉雜2001號(hào)（P＜0.05），且在晉雜22 號(hào)和晉糯3 號(hào)高粱根際土壤中的菌落數(shù)量差異不顯著。說明，菌株gz4-1、gz2-2、1-1 和1-3 均可在山西主推高粱品種（晉雜22 號(hào)、晉糯3 號(hào)和晉雜2001 號(hào)）根際土壤中良好定殖。

圖1 不同解磷細(xì)菌在3 種主推高粱品種根際土壤中定殖力差異Fig.1 The differences of colonization ability of different phosphorus solubilizing bacteria in rhizosphere soil of three main sorghum varieties

2.2 解磷細(xì)菌產(chǎn)IAA 能力差異及其對(duì)高粱株高的影響

以IAA 標(biāo)品為對(duì)照，采用Salkowski比色法對(duì)7株高效解磷細(xì)菌的產(chǎn)IAA 能力進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)：7菌株均可分泌IAA，但不同菌株分泌能力存在一定差異；7 菌株產(chǎn)IAA 能力為gz2-2＞gz4-1＞1-1＞1-3＞gz5-2＞3-5＞1-7，且以菌株gz2-2 產(chǎn)IAA 能力最強(qiáng)（25.7 mg·L-1），菌株gz4-1、1-1 和1-3 的產(chǎn)IAA 能力雖然弱于菌株gz2-2，但顯著高于菌株gz5-2、3-5 和1-7（P＜0.05），且發(fā)酵72 h 后的IAA濃度可達(dá)8.0 mg·L-1以上（圖2）。說明菌株gz4-1、gz2-2、1-1和1-3具有較高促生潛力。

圖2 不同解磷細(xì)菌產(chǎn)IAA 能力差異Fig.2 Differences in IAA production ability among different phosphorus solubilizing bacteria

另外，通過田間接種試驗(yàn)亦可反映出菌株gz4-1、gz2-2、1-1 和1-3 對(duì)高粱生長(zhǎng)具有明顯促進(jìn)作用，3 個(gè)高粱品種接種4 菌株后的高粱株高均高于菌株1-7、gz5-2 和3-5；3 個(gè)高粱品種中菌株gz4-1 和1-3對(duì)晉雜22 號(hào)和晉糯3 號(hào)的株高提高效果，優(yōu)于晉雜2001；菌株gz2-2 則對(duì)晉雜22 號(hào)和晉雜2001 的促生效果優(yōu)于晉糯3 號(hào)；菌株1-1 對(duì)3 個(gè)品種的促生效果無明顯差異（P＞0.05；圖3）。

圖3 不同解磷細(xì)菌對(duì)3 種主推高粱品種株高的影響Fig.3 Effects of different phosphorus solubilizing bacteria on plant height of three main sorghum cultivars

2.3 不同解磷細(xì)菌間親和力強(qiáng)度差異

由表3 可見，當(dāng)菌株1-1 和1-3 作為平板菌株時(shí)，菌株1-1 和1-3 之間存在強(qiáng)親和力，但二者卻均與其余2 個(gè)測(cè)試菌株之間表現(xiàn)為親和，且當(dāng)降低菌株gz4-1和gz2-2測(cè)試菌株濃度后菌株1-1和1-3與二者表現(xiàn)為弱親和，而降低菌株1-1 和1-3 濃度后卻又表現(xiàn)為強(qiáng)親和；菌株gz4-1 和gz2-2 之間具有強(qiáng)親和力，且當(dāng)二者濃度較高時(shí)可增強(qiáng)其與菌株1-1和1-3 之間的親和力。說明不同菌株之間不同濃度配比會(huì)對(duì)菌株之間親和力產(chǎn)生影響［20］，且在4 菌株復(fù)合菌系構(gòu)建中應(yīng)適當(dāng)降低菌株1-1 和1-3 濃度的同時(shí)，提高菌株gz4-1和gz2-2濃度。

表3 菌株間親和性測(cè)試結(jié)果Table 3 The results of strains affinity testing

2.4 解磷細(xì)菌復(fù)合菌系較優(yōu)配比篩選結(jié)果

運(yùn)用Designexpert 10.0 對(duì)表4 的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并對(duì)CCD 設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，建立OD600、磷濃度（有機(jī)組）、磷濃度無機(jī)組與4菌株初始復(fù)合濃度之間的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)回歸方程：

OD600=1.30+0.055×A+0.13×B-0.11×C+0.025×D+0.11×AB-0.023×AC+0.099×AD+0.15×BC-0.30×BD+0.053×CD+0.073A2+0.035B2-0.011C2+0.051D2；

磷濃度（有機(jī)組）=3.05+0.83×A-0.28×B+0.55×C-0.49×D-0.24×AB-0.70×AC+0.067×AD+0.098×BC+0.20×BD-0.38×CD+0.16A2-0.19B2+0.33C2-0.021D2；

磷濃度（無機(jī)組）=3.64-0.54×A+0.29×B-0.52×C+1.35×D+0.079×AB-0.15×AC-0.48×AD-0.44×BC-0.54×BD-0.21×CD-0.16A2-0.24B2-0.30C2-0.22D2。

另外，通過RDA 分析（圖4）可以看出菌株1-1起始濃度與復(fù)合菌系OD600及磷濃度（無機(jī)組）之間夾角為鈍角，說明菌株1-1 濃度過高會(huì)加劇各菌株之間的拮抗效應(yīng)，且抑制整個(gè)復(fù)合菌系的難溶性無機(jī)磷降解能力；菌株gz4-1 菌株起始濃度與磷濃度（無機(jī)組）之間夾角為鈍角，但卻與磷濃度（有機(jī)組）之間夾角為銳角且角度顯著小于其余菌株，說明gz4-1 菌株起始濃度的增加會(huì)抑制復(fù)合菌系難溶性無機(jī)磷降解能力，但卻顯著提升了有機(jī)磷降解能力；同 菌株gz4-1 相比，菌株gz2-2 和1-3 則表現(xiàn)出相反結(jié)果。另外，依據(jù)各菌株與響應(yīng)指標(biāo)之間夾角大小及線長(zhǎng)度可以得出復(fù)合菌系中4 菌株對(duì)OD600指標(biāo)抑制強(qiáng)度大小依次為1-1＞gz4-1＞1-3＞gz2-2；對(duì)磷濃度（有機(jī)組）的抑制強(qiáng)度大小依次為1-3＞gz2-2＞1-1＞gz4-1；對(duì)磷濃度（無機(jī)組）的抑制強(qiáng)度大小依次為1-1＞gz4-1＞1-3＞gz2-2。

圖4 基于RDA 分析的4 菌株起始發(fā)酵濃度與復(fù)合菌系OD600、磷濃度（有機(jī)組）、磷濃度（無機(jī)組）之間的互作關(guān)系Fig.4 The interaction between the initial fermentation concentration of four strains and the compound bacteria OD600，phosphorus concentration （organophosphorus treatment），and phosphorus concentration （inorganic phosphorus treatment）based on RDA analysis

通過方差分析（III 型平方和）可知：響應(yīng)因子OD600、磷濃度（有機(jī)組）和磷濃度（無機(jī)組）均表現(xiàn)為模型顯著和失擬項(xiàng)不顯著，說明該模型適用于相關(guān)數(shù)據(jù)分析，且后續(xù)分析及較優(yōu)配比預(yù)測(cè)結(jié)果可靠（表5）。OD600響應(yīng)因子方差分析和響應(yīng)面結(jié)果顯示：因素B（gz2-2）和BD（gz2-2 和1-3）互作對(duì)4 菌株復(fù)合后的OD600 值影響顯著，且BD 互作響應(yīng)面彎曲度明顯大于其它因素兩兩互作，因此在構(gòu)建4菌株復(fù)合菌群時(shí)要注意控制B 因素和BD 互作影響，使其向促進(jìn)菌株生長(zhǎng)方向發(fā)展（附圖1；表4）。磷濃度（有機(jī)組）方差分析和響應(yīng)面結(jié)果顯示：因素A（gz4-1）、C（1-1）、D（1-3）和AC（gz4-1 和1-3）互作對(duì)4 菌株復(fù)合后的有機(jī)磷降解效果影響顯著（P＜0.05），且AC 因素互作后的響應(yīng)面彎曲度較大，在后期構(gòu)建4 菌株復(fù)合菌群要注意控制A、C、D 和AC互作因素，優(yōu)化出有利于有機(jī)磷降解的較優(yōu)復(fù)合菌群（附圖2；表5）。磷濃度（無機(jī)組）方差分析和響應(yīng)面結(jié)果顯示：僅A（gz4-1）、C（1-1）和D（1-3）單因素會(huì)對(duì)4 菌株復(fù)合后的無機(jī)磷降解效果產(chǎn)生顯著影響（P＜0.05）；4 因素兩兩互作中以BC、BD 和CD 響應(yīng)面彎曲度較高，但對(duì)無機(jī)磷降解效果影響不顯著（P＞0.05），在后期構(gòu)建4菌株復(fù)合菌群要注意控制A、C、D 因素的影響，進(jìn)而優(yōu)化出有利于無機(jī)磷降解的較優(yōu)復(fù)合菌群（附圖3；表5）。因此，綜合考慮RDA 和方差分析結(jié)果，初步推薦菌株起始濃度大小為gz4-1＞gz2-2＞1-1＞1-3。

表5 基于方差分析（III 型平方和）的各因素與復(fù)合菌系OD600 值、磷濃度之間的互作關(guān)系Table 5 The interactive relationship between various factors and the OD600 value and phosphorus concentration of the microbial consortium based on analysis of variance（type III sum of squares）

以O(shè)D600＞1.80、磷濃度（有機(jī)組）＞4.0 mg·L-1和磷濃度（無機(jī)組）＞4.0 mg·L-1為限制條件，進(jìn)行較優(yōu)配比優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)：依據(jù)各因素間互作和優(yōu)化配比限制條件優(yōu)化出5 個(gè)可信度較高（Desirability≥0.966）的較優(yōu)處理（表6），且根據(jù)Desirability 值越大越可靠原則選擇序號(hào)1 和2 兩個(gè)配比方案為復(fù)合菌群構(gòu)建較優(yōu)方案；隨后對(duì)2 種較優(yōu)方案進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)方案1 的OD600、磷濃度（有機(jī)組）和磷濃度（無機(jī)組）分別為1.85、4.13 mg·L-1、4.07 mg·L-1同預(yù)測(cè)值相比誤差分別為0.54%、0.48% 和0.74%；方案2的OD600、磷濃度（有機(jī)組）和磷濃度（無機(jī)組）分別為1.89、4.33 mg·L-1和4.26 mg·L-1，同預(yù)測(cè)值相比誤差分別為2.72%、5.60% 和5.45%。2 種優(yōu)選方案實(shí)際測(cè)量值均高于預(yù)測(cè)值，但方案2 誤差較大，因此選擇方案1 為較優(yōu)處理。說明菌gz4-1、gz2-2、1-1 和1-3 較優(yōu)復(fù)合菌群配比為：8.75×103、1.33×103、1.00×103和9.9.×103，在該配比下可最大限度發(fā)揮4 菌株各自解磷活性，且優(yōu)化結(jié)果與基于RDA 和方差分析的推薦結(jié)果一致，說明試驗(yàn)結(jié)果可靠性高。

表6 復(fù)合菌系起始發(fā)酵濃度較優(yōu)配比優(yōu)化結(jié)果Table 6 Optimal ratio of initial fermentation concentration for the microbial consortium

2.4 復(fù)合菌系與單一菌株的解磷及促生能力差異分析

由圖5 可見，在有機(jī)磷和無機(jī)磷培養(yǎng)液中接種復(fù)合菌系，發(fā)酵72 h 后培養(yǎng)液中的可溶性磷含量和IAA 濃度分別可達(dá)0.40 g·L-1和25.0 mg·L-1，且同單一菌株的溶磷能力和產(chǎn)IAA 能力相比顯著提升（P＜0.05），說明復(fù)合菌系很好地強(qiáng)化了4株解磷細(xì)菌的溶磷和產(chǎn)IAA 能力，應(yīng)用潛力顯著。

圖5 復(fù)合菌系與4 種單一菌株的解磷及促生能力差異Fig.5 The difference in phosphorus solubilization and growth promoting abilities between microbial consortium and four single strains

2.5 復(fù)合菌系不同接種濃度對(duì)高粱地上部表型及產(chǎn)量的影響

田間灌根試驗(yàn)結(jié)果表明：不同磷肥減量處理中，高粱地上部株高、莖粗和葉面積均隨著解磷復(fù)合菌群接種濃度的增大呈現(xiàn)先升高后逐漸下降趨勢(shì)，較優(yōu)接種濃度1.0×106～1.0×108cfu·mL-1；在最終產(chǎn)量方面，各磷肥減量處理中除P1（減量1/4）和P2（減量1/3）以接種濃度1.0×108cfu·mL-1產(chǎn)量較高外，其余處理均以接種量1.0×1010cfu·mL-1產(chǎn)量較高，說明磷肥減量程度與復(fù)合菌群接種濃度存在正相關(guān)關(guān)系（表6）。另外，同對(duì)照（正常施肥）相比，僅P1 和P2 處理復(fù)合菌群接種濃度為1.0×106和1.0×108cfu·mL-1時(shí)的高粱地上部表型及產(chǎn)量與對(duì)照相當(dāng)或高于對(duì)照，說明本研究構(gòu)建的復(fù)合菌群可使高粱栽培季磷肥減量1/4～1/3，且保障不減產(chǎn)，因此復(fù)合菌群田間接種推薦濃度為1.0×106～1.0×108cfu·mL-1（表7）。

表7 復(fù)合菌系不同接種濃度對(duì)高粱地上部表型及產(chǎn)量的影響Table 7 The effects of different inoculation concentrations of microbial consortium on the phenotype and yield of sorghum

2.6 復(fù)合菌系不同接種濃度對(duì)高粱地下部表型及生物量的影響

磷肥減量與復(fù)合菌群接種濃度互作對(duì)高粱地下部表型及干重影響的試驗(yàn)結(jié)果表明：不同磷肥減量處理中高粱地下部總根長(zhǎng)、總根體積、總表面積和總干重均同樣以復(fù)合菌群接種濃度為1.0×108cfu·mL-1時(shí)最高，且同樣在磷肥減量1/4處理（P1）和減量1/3 處理（P2）中，高粱根系形態(tài)及生物量在該接種濃度下恢復(fù)至對(duì)照或高于對(duì)照水平（表8）。說明本研究構(gòu)建的解磷復(fù)合菌群對(duì)提升高粱耐低磷特性具有較好效果，且較優(yōu)接種濃度為1.0×108cfu·mL-1。

表8 復(fù)合菌系不同接種濃度對(duì)高粱根系形態(tài)及生物量的影響Table 8 The effects of different inoculation concentrations of microbial consortium on the morphology and biomass of sorghum root system

3 討論

隨著國(guó)家“減肥”政策的出臺(tái)與實(shí)施，近年來通過農(nóng)業(yè)技術(shù)專家的不懈努力，在穩(wěn)產(chǎn)前提下，我國(guó)雖已集成一批不同作物高效減量施肥技術(shù)［21-22］，從投入源頭上促進(jìn)了“減肥”的目標(biāo)實(shí)現(xiàn)，但從活化土壤難溶性磷角度來實(shí)現(xiàn)磷肥減施目標(biāo)的相關(guān)集成技術(shù)還不成熟，這與目前解磷微生物研究以基礎(chǔ)研究為主，且主要集中在室內(nèi)分離、鑒定、解磷特性分析、盆栽試驗(yàn)等方面以及多數(shù)離體高活性菌株難以在田間有效定殖和發(fā)揮解磷活性有關(guān)［10-16］。另外，目前已有大量研究表明，復(fù)合菌系在促生、固氮、秸稈降解、土壤修復(fù)和物質(zhì)強(qiáng)化合成等方面具有突出效果［23-27］，因此，本研究依托課題組通過室內(nèi)試驗(yàn)鑒選出的解磷細(xì)菌，首先，在大田條件下通過抗生素標(biāo)記法鑒選出可在高粱根際高效定殖且促生效果明顯的解磷細(xì)菌；其次，通過競(jìng)爭(zhēng)培養(yǎng)試驗(yàn)測(cè)定優(yōu)選解磷細(xì)菌之間的親和性，并在此基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面CCD 設(shè)計(jì)發(fā)酵試驗(yàn)對(duì)不同菌株之間的較優(yōu)配比進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而構(gòu)建復(fù)合菌系來強(qiáng)化解磷細(xì)菌溶磷效果；最后，通過大田試驗(yàn)對(duì)復(fù)合菌系與單菌株的田間促生和磷肥減量施用效果進(jìn)行驗(yàn)證分析，旨在構(gòu)建可在高粱根際高效定殖且具有較好解磷活性與促生效果的復(fù)合菌系，并明確其田間應(yīng)用潛力，為后期解磷細(xì)菌復(fù)合菌系生物有機(jī)肥產(chǎn)品開發(fā)與田間轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

3.1 不同解磷細(xì)菌在不同高粱品種根際定殖特性及促生效果差異

在大田條件下抗生素標(biāo)記法發(fā)現(xiàn)菌株gz5-2、1-7 和3-5 雖然在平板上具有較好解磷活性，但難以在主栽高粱品種（晉糯3、晉雜22 和晉雜2001）根際有效定殖，且未表現(xiàn)出良好促生效果，而菌株gz4-1、gz2-2、1-1 和1-3 卻表現(xiàn)出較好定殖和促生能力，說明不同菌株在同高粱品種或不同高粱品種根際定殖和促生能力存在一定差異，相關(guān)研究結(jié)論不僅同郭雨晴等［13］（可固氮、溶磷、產(chǎn)蛋白酶的菌株BN5、HN7、BP4、HD3 和SD5 中以節(jié)桿菌屬BP4 對(duì)高粱幼苗促生效果最好，而芽孢桿菌屬SD5 卻未表現(xiàn)出明顯促生效果）、雷學(xué)軍等［14］（菌株WD51 和WD20 具有較好溶磷、產(chǎn)IAA 能力，且對(duì)甜高粱促生效果明顯優(yōu)于其余菌株）、趙晨曦等［28］（3 株新型鉀細(xì)菌S-2、S-6、S-12 和磷細(xì)菌ACCC10010 具有顯著的解磷解鉀和促進(jìn)高粱生長(zhǎng)的能力，且促生效果優(yōu)于其余菌株）在解磷菌溶磷和高粱促生方面的結(jié)果相似，而且同郝亞妮等［29］、張慧敏等［30］、申云鑫等［31］研究結(jié)論（芽孢桿菌具有較強(qiáng)溶磷、產(chǎn)IAA 能力和促進(jìn)植物生長(zhǎng)作用，但不同菌株同樣存在活性差異）相同。然而，同解磷菌資源挖掘報(bào)道數(shù)量相比，目前有關(guān)解磷細(xì)菌在作物根際定殖特性和田間促生效果的研究報(bào)道還較少，而解磷菌可在作物根際高效定殖又是其轉(zhuǎn)化應(yīng)用的前提，因此，為促進(jìn)相關(guān)研究成果的落地轉(zhuǎn)化，我們?cè)诤笃趹?yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)基于大田試驗(yàn)的解磷菌定殖特性和促生菌株鑒選研究，進(jìn)而形成一批可切實(shí)落地轉(zhuǎn)化的解磷菌微生物資源［32］。

3.2 解磷細(xì)菌復(fù)合菌系的溶磷、促生作用

明確可在高粱主栽品種根際高效定殖且促生效果明顯的解磷細(xì)菌后，為進(jìn)一步強(qiáng)化其應(yīng)用效果，我們采用響應(yīng)面CCD 設(shè)計(jì)和發(fā)酵試驗(yàn)對(duì)其復(fù)合菌系解磷效果及菌株間的拮抗效果進(jìn)行了探究，并對(duì)復(fù)合菌系的解磷及促生能力同單菌株進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 菌株復(fù)合發(fā)酵過程中雖會(huì)表型出一定的拮抗作用，但經(jīng)起始發(fā)酵濃度優(yōu)化后有效降低了這種拮抗效應(yīng)；經(jīng)4 菌株較優(yōu)發(fā)酵起始濃度配比下形成的復(fù)合菌系不僅具備了同時(shí)降解難溶性有機(jī)、無機(jī)磷和促生能力，而且同單一菌株相比復(fù)合菌系的難溶性無機(jī)、有機(jī)磷降解及促生能力均得到明顯提高，但難溶性無機(jī)磷降解能力提升效果優(yōu)于有機(jī)磷。造成復(fù)合菌系對(duì)有機(jī)、無機(jī)難溶性磷降解能力提升效果差異的原因推測(cè)可能與菌株1-3 和gz2-2 菌體濃度較高或難溶性無機(jī)磷降解相關(guān)基因表達(dá)量高于有機(jī)磷降解相關(guān)基因有關(guān)，后期需進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，通過構(gòu)建復(fù)合菌系可強(qiáng)化原始單菌株功效的結(jié)論同王文麗［25］、韓曉云［26］和劉愛瑜等［33］在防治番茄青枯病、玉米芯生物降解和豆腐渣發(fā)酵復(fù)合菌系構(gòu)建研究所得結(jié)論相同，說明依托現(xiàn)有資源微生物構(gòu)建功能性復(fù)合菌系可能在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有更好應(yīng)用潛力，且將是后期研究的熱點(diǎn)之一。

3.3 解磷細(xì)菌復(fù)合菌系對(duì)高粱的減磷栽培效果

構(gòu)建出復(fù)合菌系后，為進(jìn)一步明確其在田間的應(yīng)用潛力，通過大田試驗(yàn)對(duì)復(fù)合菌系介導(dǎo)下的高粱耐低磷特性、促生效果及優(yōu)選處理濃度進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明：復(fù)合菌系在田間仍表現(xiàn)出較好應(yīng)用效果，且在復(fù)合菌系菌液濃度為1.0×108cfu·mL-1時(shí)可使高粱栽培季磷肥投入量降低1/4～1/3，且不影響高粱正常生長(zhǎng)和產(chǎn)量。相關(guān)研究結(jié)果同杜雷等［34］（解磷菌使用濃度達(dá)2.0×1010cfu·mL-1時(shí)，可使生菜栽培減磷1/2）、戴沈艷等［35］（施用伯克霍爾德菌屬T4 菌劑可使水稻栽培減磷30%）、劉選帥等［36］（雙接種叢枝菌根真菌和巨大芽孢桿菌PSB 可使紫花苜蓿減磷1/3）存在一定異同。另外，該復(fù)合菌系的解磷能力顯著高于目前已報(bào)道的甜高粱根際解磷菌WD51、WD20［18］和荒漠珍稀植物根際解磷BP4［17］，但產(chǎn)IAA 能力和對(duì)高粱的促生效果差異不明顯。研究結(jié)果不僅再次證實(shí)不同菌種或菌株在不同作物之間的解磷功效存在一定差異，而且證實(shí)接種解磷微生物可實(shí)現(xiàn)磷肥減量施用目標(biāo)。因此，研究不同作物專用功能微生物相關(guān)產(chǎn)品顯得尤為重要。

最后，雖然本研究通過抗生素標(biāo)記、田間試驗(yàn)、響應(yīng)面CCD 設(shè)計(jì)、發(fā)酵試驗(yàn)等方法鑒選出了4 株可在高粱根際高效定殖的解磷、促生細(xì)菌，并構(gòu)建了經(jīng)田間試驗(yàn)驗(yàn)證具有良好解磷、促生和減少高粱栽培季磷肥用量效果的復(fù)合菌系，但該復(fù)合菌系的解磷機(jī)制、物化（如：生物有機(jī)肥和生物制劑）、不同生態(tài)區(qū)應(yīng)用效果和配套使用技術(shù)還需進(jìn)一步研究，以期為高粱低磷栽培技術(shù)開發(fā)提供新產(chǎn)品和新思路。

4 結(jié)論

解磷細(xì)菌gz4-1、gz2-2、1-1 和1-3 不僅可在高粱根際高效定殖，還顯著促進(jìn)高粱生長(zhǎng)；利用4 菌株構(gòu)建的復(fù)合菌系后顯著強(qiáng)化解磷細(xì)菌的溶磷和產(chǎn)IAA 能力，且較優(yōu)起始發(fā)酵濃度配比為8.75×103、1.33×103、1.0×103和9.9×103cfu·mL-1；復(fù) 合 菌系在接種濃度為1.0×108cfu·mL-1時(shí)可使高粱栽培當(dāng)季減磷1/4～1/3。