施氮和間作對春小麥土壤叢枝菌根真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

王愛萍，姜彧宸，馮月，池田，董琦*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 晉中 030801；2.黃土高原特色作物優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，山西 晉中 030801）

叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是一種在土壤中廣泛分布的真菌，屬于球囊菌門（Glomeromycota），可以侵染80%的陸生植物根系并與植物形成互利共生關(guān)系［1］，擴大根系的吸收范圍和吸收表面積，給寄主植物提供氮、磷等礦質(zhì)營養(yǎng)，并提高植物對逆境的抗性，同時植物為AMF 生長提供所需要的碳源［2］。AMF 對維持自然生態(tài)系統(tǒng)的功能和穩(wěn)定具有重要意義。全球AMF物種豐富度范圍在341～1600 個OTU，甚至可能多于1600 個OTU［3］，?pik 等［4］報道鑒定形態(tài)的AMF約250 種，鑒定分子的為350～1000 種，Tedersoo等［5］報道共發(fā)現(xiàn)11 科25 屬250 種，Davison 等［6］報道AMF 有348種。

農(nóng)業(yè)施肥對AMF 群落組成有顯著影響，施氮影響AMF 群落組成，降低群落多樣性［7］。增施氮肥降低AMF 生物量、物種豐富度和多樣性［8-10］。還有研究表明，在磷含量有限的土壤中，施氮可增加AMF 物種的豐富度和多樣性；富磷土壤中，AMF物種減少［11-12］。也有研究表明，長期施氮對微生物生物量和群落組成沒有影響［13］，關(guān)于氮肥影響植物AMF 群落組成前人有報道，但肥料驅(qū)動AMF 群落組成變化的功能也知之甚少［14］。

土地利用方式對AMF 群落組成的影響很大［15］，間作與AMF 之間存在互利關(guān)系，由于間作間的相互作用，AMF 的多樣性和群落組成發(fā)生了變化［16］。Zhang 等［17］認為間作增加了大豆根際土壤AMF 多樣性，而相鄰玉米則沒有這種影響。大豆和玉米根際AMF 優(yōu)勢屬（Glomus）相對豐度隨施氮量的增加呈相反的變化趨勢。然而，也有研究表明間作不能改變AMF 的群落組成［18-20］。綜上所述，不同的研究者關(guān)于間作對AMF 群落組成影響的研究結(jié)果不一致。

小麥和豌豆間作是我國傳統(tǒng)間作方式之一，本研究通過施用不同的氮肥水平，對小麥根系土壤AMF 群落結(jié)構(gòu)和功能進行分析，探究不同施氮量和間作種植模式對AMF 生物群落結(jié)構(gòu)的影響，旨在為小麥的可持續(xù)生產(chǎn)以及農(nóng)田土壤有益微生物的發(fā)掘和利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗區(qū)概況和供試品種

試驗于2022 年3 月至7 月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)太谷校區(qū)農(nóng)作站進行，地理坐標東經(jīng)112°57′，北緯37°42′。太谷區(qū)2021 全年降雨量611.4 mm，2022年1-7 月降雨量199.7 mm。播前土壤含水量13.43%，試驗田土壤為壤土，全氮含量為0.945 g·kg-1，堿 解 氮33.88 mg·kg-1，有 效 磷10.45 mg·kg-1，速 效 鉀157.60 mg·kg-1，有 機 質(zhì)21.96 g·kg-1。供試春小麥品種為寧春5 號，豌豆品種為中豌8號。

1.2 試驗設(shè)計

采用隨機區(qū)組設(shè)計，設(shè)置4 個施氮量：0 kg·hm-2（N0）、90（N1）、180（N2）和270 kg·hm-2（N3），2 種種植模式：春小麥單作（SS）、春小麥和豌豆間作（SI）。施氮量以純氮計算，分別作為基肥在播種前一次性全部施入。春小麥和豌豆均于2022 年3 月1 日播種，且播量相同，均為225 kg·hm-2。間作小區(qū)為2行小麥間隔2 行豌豆，所有處理均為等行距種植，行距20 cm。小區(qū)面積5 m×5.2 m。每個處理設(shè)3 次重復(fù)。全生育期無追肥，只灌1 次水（3 月30 日），其余同當?shù)毓芾怼?/p>

1.3 樣品的采集

春小麥成熟期，每個小區(qū)隨機選取5 株小麥植株，采集0～10 cm 深度的小麥根系，去掉大塊土壤后，輕輕抖落小麥根系附著的土壤，將混合后的土壤樣品標記后立即放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 AMF 群落結(jié)構(gòu)的測定

采用SDS 法提取土壤樣品的基因組DNA，檢測質(zhì)量后以稀釋的基因組DNA 為模板，使用特異引 物（F：5′-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG-3′和 R：5′-CCCAACTATCCCTATTAATCAT-3′）進行PCR 擴增。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，對檢測合格的PCR 產(chǎn)物回收后構(gòu)建文庫。通過Illumina HiSeq 高通量測序平臺進行測序。對得到的原始序列根據(jù)QIIME 過濾后獲得高質(zhì)量的序列，并與Unite 數(shù)據(jù)庫進行比較，使用UCHIME 算法檢測嵌合體序列并去除，最終得到有效序列?；谟行蛄羞M行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類和物種分類。根據(jù)OTUs 聚類結(jié)果對每個OTU 的代表序列做物種注釋以及進行豐度和Venn 圖分析。選用FunGuild 進行功能注釋，通過PCA 降維分析不同樣本間的差異。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應(yīng)用Excel 2016 記錄數(shù)據(jù)，用T-test 進行差異顯著性檢驗，使用Origin 2020繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施氮量和間作處理春小麥根系土壤AMF 群 落OTU 組 成

物種積累箱形圖反映了連續(xù)采樣下新物種的出現(xiàn)率。在一定范圍內(nèi)，隨著樣本量的增加，如果箱形圖的位置出現(xiàn)急劇上升，說明群落中發(fā)現(xiàn)了大量的物種；當箱形圖的位置趨于平坦時，說明該環(huán)境下的物種不會隨著樣本量的增加而顯著增加。從圖1 可以看出，小麥根系土壤AMF 群落OTU 組成的所有樣品中新種的出現(xiàn)趨于平緩，說明抽樣充分，數(shù)據(jù)可以用于分析。

韋恩圖可以直觀看出不同處理春小麥根系土壤AMF 群落OTU 組成之間的差異及共有物種的情況。圖2 顯示，單作春小麥根系土壤AMF 群落OTU 個數(shù)為13，而間作為10 個。單作模式中，N0特 異 性AMF 群 落OTU 為2 個，占 總OTU 數(shù) 的15.38%，N1 和N3 中特異性O(shè)TU 均為3 個，占比均為23.08%，N2 中特異性O(shè)TU 最少，為1 個，占比7.69%。N0、N1、N2 和N3 共 有 的OTU 數(shù) 量 為2個，占比15.38%。間作模式中，N0 特異性AMF 群落OTU 為1 個，占總OTU 序列數(shù)的10.00%，N2和N3 處理特異性O(shè)TU 均為2 個，占比均為20.00%，N1 沒有特異性O(shè)TU。N0、N1、N2 和N3共有的OTU 數(shù)量為3，占比30.00%。

圖2 不同施氮量和間作處理春小麥根系土壤AMF 韋恩圖Fig.2 Venn graph of AMF community of spring wheat root soil under different nitrogen application rates and intercropping treatments

2.2 不同施氮量和間作處理春小麥根系土壤AMF 群落結(jié)構(gòu)

2.2.1 科水平相對豐度的變化

圖3 為AMF 群落科水平的相對豐度，可以看出，AMF 科水平主要有3 種，相對豐度排名從高到低依次為球囊霉科（Glomeromyceae，95.14%）、原囊霉目未知科（unidentified Archaeosporales sp.，3.47%）和類球囊霉科（Paraglomeraceae，1.39%），分別屬于球囊菌綱（Glomeromycetes）球囊霉目（Glomerales）、原囊菌綱（Archaeosporomycetes）原囊 霉 目（Archaeosporales）和 類 球 囊 菌 綱（Paraglomeromycetes）類球囊霉目（Paraglomerales）。單作中，隨著施氮量增加，球囊霉科的相對豐度增加，至N3 最高，占據(jù)100%豐度。施氮量為N0 時，與其他施氮水平相比，原囊霉目未知科的相對豐度最高；施氮量為N1、N2 時，類球囊霉科的相對豐度最高；施氮量為N3 時，球囊霉科的相對豐度最高。在間作處理中，施氮量增加至N1 處理后，只有球囊霉科1 種。施氮量為N0 時，與其他施氮水平相比，原囊霉目未知科的相對豐度最高；施氮量為N1、N2、N3 時，球囊霉科的相對豐度最高。同樣的施氮水平，N0 處理下，間作明顯提高了原囊霉目未知科的相對豐度，降低了球囊霉科的相對豐度；當施氮量為N1、N2 時，間作處理降低了類球囊霉科的相對豐度，提高了球囊霉科的相對豐度。說明種植方式和氮肥對于AMF 科水平的群落結(jié)構(gòu)均有影響，施氮和間作二者的相互作用明顯降低了科類水平的AMF 群落結(jié)構(gòu)的豐富度，施氮導(dǎo)致AMF 群落豐度低的科水平群落有更替，高氮（N3）處理明顯降低了科類水平AMF 的群落多樣性。

圖3 春小麥根系土壤AMF 群落科水平的相對豐度Fig.3 Relative abundance of AMF community at family level in spring wheat root soils

2.2.2 屬水平的相對豐度變化

圖4 顯示AMF 群落屬水平主要有5 種不同的屬，相對豐度排名由高到低依次為管柄囊霉屬（Funneliformis，51.39%）、未 知 屬（undefined，38.89%）、根孢囊霉屬（Rhizophagus，4.86%）、其他未知原囊霉目類真菌（undefinedArchaeospora-les，3.47%）和類球囊霉屬（Paraglomus，1.38%）。管柄囊霉屬（Funneliformis）和根孢囊霉屬（Rhizophagus）均屬于球囊霉科（Glomeromyceae）。單作模式中，隨著施氮量的增加，未知球囊霉屬的相對豐度增加，在N3 達到43.2%；管柄囊霉屬相對豐度隨著施氮量增加先增加后減少，在N1 時達到最高；根孢囊霉屬相對豐度隨著施氮量的增加呈現(xiàn)先降低再增加趨勢，在N1 時相對豐度為0；其他未知原囊霉目類真菌僅在N0 時出現(xiàn)；類球囊霉屬在單作N1、N2 時存在。間作所有施肥處理中，未知球囊霉屬相對豐度隨著施氮量的增加表現(xiàn)為先增加后降低再增加趨勢，在N1 處最高；管柄囊霉屬在N2時相對豐度最大；根孢囊霉屬僅存在于N3 處理下；其他未知原囊霉目類真菌同單作一樣，僅在N0 出現(xiàn)。相同的施氮水平下，N0、N1、N2 水平單作的屬豐度多樣性明顯高于間作，N3 水平二者數(shù)目持平。說明施氮量和種植模式影響植物根系土壤AMF 群落屬水平的多樣性，低氮（N1）與中氮（N2）水平下，間作明顯降低了AMF 群落屬水平的群落多樣性。

圖4 春小麥根系土壤AMF 群落屬水平的相對豐度Fig.4 Relative abundance of AMF community at genus level in spring wheat root soils

2.2.3 種水平的相對豐度及種類變化

種水平AMF 共鑒定出5種，相對豐度由高到低依次為地斗管囊霉（Funneliformis geosporum，51.39%）、球 囊 霉 科 未 知 種（Glomeraceaesp.，38.89%）、根 孢 囊 屬 未 知 種（Rhizophagussp.，4.86%）、原囊霉目未知種（Archaeosporalessp.，3.47%）和隱類球囊霉（Paraglomus laccatum，1.39%）。AMF 種在各處理中出現(xiàn)的頻度如表1 所示，地斗管囊霉和球囊科未知種出現(xiàn)的頻度最高，且所有處理均有出現(xiàn)。根孢囊屬未知種、原囊霉目未知種和隱類球囊霉在各處理的出現(xiàn)頻度不同，單作4 個施肥處理根孢囊屬未知種的出現(xiàn)頻率高于間作；單作與間作N0 處理均有原囊霉目未知種出現(xiàn)，但添加氮肥處理后均消失；單作N1 和N2 處理均有隱類球囊霉出現(xiàn)，間作4 個施肥處理則未出現(xiàn)。說明施氮處理降低了原囊霉目未知種的相對豐度，間作降低了隱類球囊霉的相對豐度。表明，施氮處理和間作均會影響AMF 的種群分布，從而改變AMF的群落結(jié)構(gòu)和特征，但對主要優(yōu)勢種地斗管囊霉和球囊霉科未知種的相對豐度影響不大。

表1 不同施氮量和間作下春小麥根系土壤AMF 種類分布Table 1 Distribution of arbuscular mycorrhizal fungi in root soil of spring wheat under different nitrogen application rates and intercropping

2.3 不同施氮量和間作處理春小麥根系A(chǔ)MF 群落功能的變化

根據(jù)樣品在數(shù)據(jù)庫中的功能注釋及豐度信息繪制熱圖，并從功能差異層面進行聚類，不同的顏色梯度反映不同處理中物種功能預(yù)測的含量，越接近紅色，含量越高。由圖5 可以看出，單作中，N0 在動物病原體-內(nèi)生菌-附生植物-植物病原-未定義的腐生物（Animal_Pathogen-Endophyte-Epiphyte - Plant_Pathogen - undefined_Saprotroph）菌群上存在優(yōu)勢，N1 在動物病原體-植物病原-土壤腐生菌-未定義的腐生物（Animal_Pathogen - Plant_Pathogen - Soil_Saprotroph - undefined_Saprotroph）菌群上存在優(yōu)勢，N2 在未定義的腐生物（undefined_Saprotroph）、真菌寄生蟲-未定義的腐生物（Fungal_Parasite-undefined_Saprotroph）、動物內(nèi)共生體-未定義的腐生物（Animal_Endosymbiont-undefined_Saprotroph）、植物病原（Plant_Pathogenh）菌群上存在優(yōu)勢，N3 在動物病原體-鎖骨內(nèi)生菌-真菌寄生蟲（Animal_Pathogen-Clavicipitaceous_Endophyte-Fungal_Parasite）、腐生木（Wood_Saprotroph）、動物病原體（Animal_Pathogen）、植物病原-土壤腐生菌- 腐 生 木（Plant_Pathogen - Soil_Saprotroph -Wood_Saprotroph）、腐生類（Saprotrophic）等多種功能菌群上均存在優(yōu)勢。間作模式中，N0 在苔蘚化（Lichenized）、糞腐生物-土壤腐生菌（Dung_Saprotroph-Soil_Saprotroph）菌群上均存在優(yōu)勢，N1在內(nèi)生菌-植物病原（Endophyte-Plant_Pathogen）、糞腐生物-未定義的腐生物-腐生木及其他類型（Dung_Saprotroph-undefined_Saprotroph-Wood_Saprotroph）、其它（Others）、動物病原體-定義的腐生物（Animal_Pathogen-undefined_Saprotroph）功能菌群上均存在優(yōu)勢，N2 在植物病原-腐生木（Plant_Pathogenh-Wood_Saprotroph）菌群上存在優(yōu)勢，N3在地衣寄生蟲-苔蘚化（Lichen_Parasite- Lichenized）菌 群 上 存 在 優(yōu) 勢。SSN1 和SSN0、SIN0 和SIN2、SIN3 和SSN2 分別聚為一類。說明不同施氮量和種植方式對AMF 功能菌群豐度有明顯的影響。

圖5 FunGuild 功能注釋聚類熱圖Fig.5 FunGuild annotation clustering heat map

基于功能注釋的豐度統(tǒng)計結(jié)果進行PCA 降維分析，距離越接近，表示功能組成越相似。圖6 中每個彩色點表示1 個樣本，同一個處理的3 個重復(fù)使用同一種顏色和形狀表示。將同一處理3 個重復(fù)的點連接起來形成1 個三角形，三角形的面積越小，組內(nèi)重復(fù)性越好。紅色的點表示每個處理對應(yīng)的三角形的重心，點與點之間的距離越大，2 成分的組間的差異越大。由圖6 可以看出，主成分1（PC1）與主成分2（PC2）解釋方差分別為18.1%和15.9%，2個主成分累積貢獻率達到34.0%。除SSN3 和SIN1 外，其余處理的距離較聚集，功能組成相似。在單作中，除N3 外，其余施氮量組內(nèi)重復(fù)性強。間作中，隨著施氮量的增加，重復(fù)性先變?nèi)踉僮儚?，除N1 外，其余處理的功能性成分組內(nèi)均較為聚集。同樣的施氮水平下，N1 處理單作的重復(fù)性強于間作，N3 則間作強于單作。說明施氮量和間作對AMF功能性方面存在一定程度上的影響，間作與低氮處理二者的相互作用、單作與高氮處理二者的相互作用均會一定程度改變?nèi)郝涔δ芙M成。

圖6 FunGuild 功能注釋PCA 結(jié)果展示Fig.6 PCA result display of FunGuild function annotation

3 討論

由于許多AMF 在培養(yǎng)基中不可培養(yǎng)，因此鑒定環(huán)境中的AMF 分類群主要依賴于基于DNA 的方法［6］。本研究采用Illumina HiSeq 測序平臺對麥田土壤AMF 測序分析，結(jié)果表明屬于球囊菌門的AMF 科分類水平包括3 種，分別為球囊霉科（Glomeromyceae）、原囊霉目未知科（unidentified Archaeosporales sp.）和類球囊霉科（Paraglomeraceae），分別屬于球囊菌綱（Glomeromycetes）、原囊菌綱（Archaeosporomycetes）和類球囊霉綱（Paraglomeromycetes），這與儲薇等報道AMF 分為3 綱的報道一致［21］。楊文瑩等報道，我國陸地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)土壤中AMF 種類共有20 屬、125 種，其中以球囊霉屬（Glomus）和無梗囊霉屬（Acaulospora）最多［22］。而本研究中，相對豐度在1%以上的AMF 優(yōu)勢屬為管柄囊霉屬（Funneliformis）、undefined、根孢囊霉屬（Rhizophagus）、其他未知原囊霉目類真菌（undefined-Archaeosporales）和類球囊霉屬（Paraglomus）。雖 然AMF 的 宿 主 特 異 性 較 低［23］，但AMF 對宿主植物具有選擇性［24］，不同地域與不同植物的AMF 種群有差異，宿主植物的種類影響AMF分布［25］，這與宿主植物與AMF 間的親和力有關(guān)，二者的相互作用決定親和力和共生體的建立［26］，小麥根系通過自身活動改變土壤環(huán)境，進而選擇相應(yīng)的AMF 種群共生。

間作對AMF 有增殖作用，但宿主和鄰近植物對AMF 產(chǎn)生的影響不同［16］，AMF 對間作物種也可能表現(xiàn)出不同的反應(yīng)，這取決于鄰近效應(yīng)的強弱和土壤環(huán)境的相對變化［27-28］。本研究結(jié)果表明，間作影響小麥根系土壤AMF 群落屬水平的多樣性和種群分布，這可能與間作豌豆和麥田土壤特性有關(guān)，豌豆通過增加土壤有機質(zhì)和氮的有效性增加AMF多樣性［29］，此外，麥田土壤pH、礦質(zhì)營養(yǎng)等對AMF的生長、發(fā)育、侵染和繁殖均具有重要影響［30］。施氮影響AMF 群落組成，降低AMF 物種群落多樣性［7-10］，本研究結(jié)果也表明施氮明顯促進球囊霉科（Glomeromyceae）相對豐度增加。N0 處理下，間作明顯提高了未確定的原囊霉目未知科（unidentified Archaeosporales sp.）的相對豐度，降低了球囊霉科的相對豐度；當施氮量為N1、N2 時，間作處理降低了類球囊霉科的相對豐度，提高了球囊霉科的相對豐度。施氮導(dǎo)致豐度低的AMF 群落更替，高氮（N3）處理明顯降低了科類水平AMF 的群落多樣性，與前人研究結(jié)果一致。說明種植方式和氮肥以及二者的互作對于AMF 科分類水平的群落結(jié)構(gòu)均有影響，施氮和間作二者的相互作用明顯降低了科類水平的AMF 群落結(jié)構(gòu)的豐富度。氮肥對AMF群落的影響可能與土壤磷素有效性有關(guān)，在磷含量有限的土壤中，施氮可增加AMF 物種的豐富度和多樣性，但會導(dǎo)致富磷土壤中的AMF 物種減少［7］，當土壤有效氮較高時，AMF 利用土壤氮作為自身的營養(yǎng)，對碳需求增加，AMF 朝著減少互利共生的方向發(fā)展［7］。

種群的多樣性代表功能的多樣性，AMF 種群高度多樣化導(dǎo)致AMF 群落組成和多樣性對施加氮的敏感性有差異［31］，尤其對低水平氮肥的響應(yīng)［7］。施用氮肥直接影響AMF 群落內(nèi)的功能變化，可能減弱植物與AMF 的共生，AMF 功能的變化可歸因于氮肥帶來的AMF 群落組成的變化［7］。FunGuild功能注釋聚類熱圖結(jié)果顯示，SSN1 和SSN0、SIN0和SIN2、SIN3 和SSN2 分別聚為一類，表明AMF功能對土壤氮化學(xué)計量和間作的響應(yīng)不同。因此，需要進一步研究氮和間作在介導(dǎo)植物-AMF 動力學(xué)中的作用，對于全面了解AMF 在農(nóng)業(yè)中的作用具有重要意義。

4 結(jié)論

大 田 春 小 麥 根 系 土 壤AMF 分 為3 綱、3 目、3科、5 屬、5 種。其中科分類水平包括3 種，分別為球囊霉科（Glomeromyceae）、原囊霉目未知科（unidentified Archaeosporales sp.）和 類 球 囊 霉 科（Paraglomeraceae）；屬水平為5 種，分別為管柄囊霉屬（Funneliformis）、undefined、根孢囊霉屬（Rhizophagus）、其他未知原囊霉目類真菌（undefined Ar-chaeosporales）和類球囊霉屬（Paraglomus）；種類水平分為5 種，分別為地斗管囊霉（Funneliformis geosporum）、球囊霉科未知種（Glomeraceaesp.）、根孢囊屬未知種（Rhizophagussp.）、原囊霉目未知種（Archaeosporalessp.）和隱類球囊霉（Paraglomus laccatum）。施氮有利于球囊霉科（Glomeromyceae）相對豐度的增加，而低氮和中氮條件有利于單作模式類球囊霉科（Paraglomeraceae）相對豐度的增加。未施氮肥條件下，間作有利于原囊霉目未知科（unidentified Archaeosporales sp.）相對豐度的增加。施氮與間作二者的互作有利于球囊霉科（Glomeromyceae）相對豐度的增加。施氮量和間作以及二者的相互作用對AMF 科屬種分類水平的菌群結(jié)構(gòu)以及功能性方面均存在明顯的影響。