非小細胞肺癌病人血清不規(guī)則趨化因子表達及與腫瘤負荷、微血管密度相關(guān)性研究

朱世祥，闞海峰，曹海燕

作者單位：如皋市人民醫(yī)院、南通大學附屬如皋醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，江蘇 南通226500

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌80%以上，其中大多病人確診時已處于晚期，放化療敏感性差，即使采用靶向治療，預后效果亦不盡人意，因此尋找與NSCLC侵襲相關(guān)的指標，對于如判斷病情進展、評價療效等意義重大［1-2］。目前雖然胃泌素釋放肽前體（Pro-GRP）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、細胞角蛋白片段19（CYFRA21-1）、鱗狀細胞癌抗原（SCC）等腫瘤標志物可對NSCLC診治提供一定參考，但存在假陽性、假陰性的不足，所以有必要研究新的標志物［3-5］。不規(guī)則趨化因子（fractalkine）定位于染色體16q13，卵巢癌病人血清fractalkine高于良性腫瘤、健康對照人群，并是口腔癌骨侵襲的標志物，提示fractalkine可能與多種癌癥有關(guān)［6-7］。現(xiàn)階段關(guān)于NSCLC病人血清fractalkine表達及與腫瘤負荷、微血管密度（MVD）關(guān)系報道較少，本研究對此進行探討，期待為臨床加深對NSCLC機制方面認識及診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 按照1∶1∶1分別選取如皋市人民醫(yī)院2020年9月至2022年5月標準化差異法下年齡、性別、身體質(zhì)量指數(shù)、病灶數(shù)量均衡可比的69例NSCLC病人（NSCLC組）、69例肺部良性疾病病人（良性組）、體檢中心69例健康對照人群（對照組）作為研究對象，其中NSCLC組2015年國際肺癌研究學會更新的第8版分期：T1期10例，T2期26例，T3期27例，T4期6例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例；有遠處轉(zhuǎn)移16例，無遠處轉(zhuǎn)移53例；良性組包括錯構(gòu)瘤22例，神經(jīng)纖維瘤15例，肺血管瘤16例，脂肪瘤16例。納入標準：NSCLC的診斷參考《中國原發(fā)性肺癌診療規(guī)范（2015年版）》［8］；良性組均經(jīng)病理檢查證實；首次確診；自愿簽署知情同意書；無其他癌癥病史。排除標準：肝腎嚴重功能障礙者；不能配合研究者；有造影劑過敏史者；血液系統(tǒng)疾病者；伴急性感染者；妊娠期、哺乳期者。全部對象均知曉研究內(nèi)容，自愿加入，本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。各組基線資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 三組基線資料比較

1.2 方法

1.2.1 血清fractalkine及腫瘤標志物檢測 主要試劑、儀器：全自動免疫分析儀（i2000，美國雅培）；酶標儀（芬蘭LabsystemsDragon公司W(wǎng)ellscanMK3型）；血清fractalkine及腫瘤標志物試劑盒（美國R&D公司）。檢測方法：于就診時采集病人5 mL靜脈血，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定檢測血清fractalkine水平，電化學發(fā)光法檢測NSE、Pro-GRP、CYFRA21-1、SCC水平。

1.2.2 腫瘤負荷評估 檢查方法：PET/CT儀（美國GE公司，Discovery STE型），靜脈注射示蹤劑18F-FDG 3.7 MBq/kg，從顱頂掃描至股骨中上段。圖像分析：運用超級迭代法處理圖像，在病灶最大層面勾畫感興趣區(qū)，AW4.4工作站固定閾值法測量，計算機軟件自動輸出NSCLC原發(fā)與轉(zhuǎn)移灶相關(guān)代謝參數(shù)，記錄原發(fā)灶最長徑、全身腫瘤代謝體積（MTVwb）及全身病灶總糖酵解值（TLGwb）。

1.2.3 MVD檢測 主要試劑、儀器：兔抗人CD34單克隆抗體（江西江藍純生物試劑有限公司）；免疫組化試劑盒（上海聯(lián)邁生物）；顯微鏡（日本Olympus BX53）。檢測方法：取NSCLC活檢標本進行石蠟包埋切片，采用免疫組化方法檢測MVD，兔抗人CD34單克隆抗體標記，顯微鏡10×10倍下找到血管密度最高的十個區(qū)域，40×10倍下對每個視野中血管數(shù)量進行計數(shù)，取平均值作為MVD最終數(shù)值。

1.3 觀察指標 ①比較各組血清fractalkine與腫瘤標志物。②分析血清fractalkine與各標志物診斷價值。③比較不同血清fractalkine水平病人腫瘤負荷、MVD。④分析血清fractalkine與腫瘤負荷、MVD關(guān)系。⑤比較NSCLC組治療前后血清fractalkine水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 24.0分析，計數(shù)資料用例（%）表示，以χ2檢驗，計量資料以表示，多組間比較以單因素方差分析，兩兩比較以LSD-t檢驗，同組治療前后的比較采用配對t檢驗；采用受試者操作特征（ROC）曲線下面積（AUC）分析血清fractalkine診斷NSCLC價值，不同AUC間的比較采用De-Long檢驗，應(yīng)用Pearson分析血清fractalkine與腫瘤負荷、MVD關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清fractalkine與腫瘤標志物比較NSCLC組血清fractalkine、Pro-GRP、NSE、CYFRA21-1、SCC高于良性組、對照組（P＜0.05），良性組血清fractalkine高于對照組（P＜0.05）；良性組血清Pro-GRP、NSE、CYFRA21-1、SCC與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 三組血清fractalkine與腫瘤標志物比較/

表2 三組血清fractalkine與腫瘤標志物比較/

注：fractalkine為不規(guī)則趨化因子，Pro-GRP為胃泌素釋放肽前體，NSE為神經(jīng)元特異性烯醇化酶，CYFRA21-1為細胞角蛋白片段19，SCC為鱗狀細胞癌抗原，NSCLC為非小細胞肺癌。①與對照組比較，P＜0.05。②與良性組比較，P＜0.05。

SCC/（μg/L）1.37±0.35 1.45±0.37 5.82±1.63①②460.26＜0.001組別對照組良性組NSCLC組F值P值例數(shù)69 69 69 fractalkine/（ng/L）363.90±47.26 422.03±153.59①646.44±208.12①②66.65＜0.001 Pro-GRP/（ng/L）28.75±9.02 30.99±8.74 79.64±20.01①②306.69＜0.001 NSE/（μg/L）13.92±4.74 14.38±4.52 34.52±11.71①②159.10＜0.001 CYFRA21-1/（μg/L）1.86±0.48 1.90±0.53 4.87±1.29①②283.60＜0.001

2.2 血清fractalkine與各標志物診斷價值 ROC曲線（NSCLC組為陽，良性組與對照組為陰）顯示，血清fractalkine診斷NSCLC的AUC與Pro-GRP、NSE、CYFRA21-1、SCC比較差異無統(tǒng)計學意義（DeLong=0.068、0.089、0.073、0.057，均P＞0.05），見表3。

表3 非小細胞肺癌69例血清fractalkine水平與腫瘤標志物的ROC曲線分析結(jié)果

2.3 不同血清fractalkine水平病人腫瘤負荷、MVD比較 根據(jù)2.2中獲取的最佳截斷值，將病人分為血清fractalkine低水平（＜460.40 ng/L）與高水平（≥460.40 ng/L），結(jié)果顯示，血清Fractalkine高水平病人原發(fā)灶最長徑、MTVwb、TLGwb、MVD均高于低水平病人（P＜0.05）。見表4。

表4 不同血清fractalkine水平的非小細胞肺癌69例腫瘤負荷、MVD比較/

表4 不同血清fractalkine水平的非小細胞肺癌69例腫瘤負荷、MVD比較/

注：fractalkine為不規(guī)則趨化因子，MVD為微血管密度，MTVwb為全身腫瘤代謝體積，TLGwb為全身病灶總糖酵解值。

例數(shù)3 3組別fractalkine低水平fractalkine高水平t值P值原發(fā)灶最長徑/mm 3.69±1.10 MTVwb/cm3TLGwb MVD/條3.30±0.92352.61±47.8827.84±8.01 45.66±9.25 8.52＜0.001 365.94±1.83 6.12＜0.001 5.82±1.34 9.02＜0.001 569.78±52.29 17.94＜0.001

2.4 血清fractalkine與腫瘤負荷、MVD關(guān)系 以NSCLC組血清fractalkine水平為X軸，原發(fā)灶最長徑、MTVwb、TLGwb、MVD為Y軸進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，血清fractalkine水平與原發(fā)灶最長徑（r=0.72）、MTVwb（r=0.73）、TLGwb（r=0.82）、MVD（r=0.76）呈正相關(guān)（均P＜0.05）。見圖1。

圖1 血清fractalkine水平與非小細胞肺癌腫瘤負荷、MVD關(guān)系：A為血清fractalkine與原發(fā)灶最長徑關(guān)系；B為血清fractalkine與MTVwb關(guān)系；C為血清fractalkine與TLGwb關(guān)系；D為血清fractalkine與MVD關(guān)系

2.5 NSCLC組治療前后血清fractalkine比較NSCLC組53例接受手術(shù)治療后血清fractalkine水平較治療前顯著降低（t=8.08，P＜0.001）（見圖2）。

圖2 非小細胞肺癌（NSCLC組）53例手術(shù)前后血清不規(guī)則趨化因子（fractalkine）表達比較

3 討論

3.1 NSCLC病人血清fractalkine表達及診斷價值 本研究結(jié)果顯示，NSCLC組血清fractalkine、Pro-GRP、NSE、CYFRA21-1、SCC高于良性組、對照組，提示fractalkine、Pro-GRP、NSE、CYFRA21-1、SCC均與NSCLC組有關(guān)。Liu等［9］研究指出，肺癌組織中fractalkine表達高于癌旁組織、正常肺組織，與肺癌發(fā)病有關(guān)，本研究觀點與之存在相似之處，與之不同的是，本研究檢測的是血清中fractalkine表達水平，標本更易獲取，檢測更為簡便。汪定軍等［10］檢測了肺癌病人血清fractalkine水平，發(fā)現(xiàn)肺癌組顯著高于肺炎組、健康對照組，與本研究結(jié)論一致。fractalkine系趨化因子，能作用于自然殺傷細胞、T淋巴細胞等多種免疫細胞，導致NSCLC細胞免疫逃逸與免疫耐受，為NSCLC發(fā)生創(chuàng)造有利免疫微環(huán)境［11-12］。在以上研究基礎(chǔ)上，本研究還發(fā)現(xiàn)，血清fractalkine診斷NSCLC的AUC與Pro-GRP、NSE、CYFRA21-1、SCC相近，提示血清fractalkine可作為診斷NSCLC一個標志物，有助于及時發(fā)現(xiàn)NSCLC，及時治療，從而促進預后改善。

3.2 血清fractalkine表達與腫瘤負荷關(guān)系 腫瘤負荷反映了腫瘤大小、癌細胞數(shù)量、體內(nèi)癌灶數(shù)量、腫瘤活躍程度等，不僅有助于評估病人病情，還是治療決策、評價療效和預后等完美工具［13］。18FFDG PET/CT能評價疾病分期、提供多維度測量、顯示腫瘤代謝強度等，是評估NSCLC腫瘤負荷一種常用方法。其中原發(fā)灶最長徑可反映原發(fā)灶負荷，MTVwb、TLGwb可反映全身腫瘤代謝信息。當前關(guān)于血清fractalkine表達與NSCLC腫瘤負荷的報道鮮見，本研究首次對此進行研究發(fā)現(xiàn)，血清Fractalkine高水平病人原發(fā)灶最長徑、MTVwb、TLGwb、MVD均高于低水平病人，與原發(fā)灶最長徑、MTVwb、TLGwb呈正相關(guān)，提示血清Fractalkine越高，NSCLC腫瘤負荷越大。采用基因技術(shù)激活Fractalkine，可通過參與腫瘤細胞-椎體骨髓內(nèi)皮細胞相互作用，介導NSCLC脊柱轉(zhuǎn)移，證實Fractalkine過表達狀態(tài)會增加腫瘤活躍程度［14］。因此對NSCLC病人，采用相關(guān)藥物或基因靶向技術(shù)，沉默F(xiàn)ractalkine表達，可能有助于減少NSCLC腫瘤負荷，F(xiàn)ractalkine或可為NSCLC治療提供了一個新靶點與思路。但遺憾的是，目前對Fractalkine研究有限，如何利用Fractalkine及Fractalkine在體內(nèi)是否還與其他途徑相互作用尚不明確，這也是下一步的一個研究方向。

3.3 血清fractalkine表達與MVD關(guān)系 血管是腫瘤細胞、組織賴以存活、增殖、侵襲的基礎(chǔ)［15］。MVD可反映NSCLC腫瘤組織中新生血管情況，并與NSCLC侵襲性、預后、分期等息息相關(guān)［16-17］。本研究結(jié)果顯示，血清Fractalkine高水平病人MVD高于低水平病人，與MVD呈正相關(guān)，提示Fractalkine還與NSCLC血管生成有關(guān)，這可能是Fractalkine增加NSCLC腫瘤負荷的一個機制。在肺癌大鼠模型中，上調(diào)Fractalkine表達，可通過促新生血管形成機制，介導大鼠皮下腫瘤形成，促進肺癌細胞的侵襲和遷移［18］?？梢姲邢騀ractalkine，抑制其表達，還能通過抑制NSCLC新生血管形成，發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖作用。本研究還發(fā)現(xiàn)NSCLC組治療后血清fractalkine水平較治療前顯著降低，表明fractalkine有助于監(jiān)測療效，具有作為療效標志物潛質(zhì)。目前NSCLC的診斷中高分辨率CT的應(yīng)用較為普遍，但其存在輻射、可重復性差等不足，且對部分肺結(jié)節(jié)難以準確定性。通過血清fractalkine輔助診斷，具有可重復性高、經(jīng)濟性高的優(yōu)點，且其診斷可靠性高，尤其是在大樣本量人群的初步篩查中具有獨特的優(yōu)勢，呈現(xiàn)出重要的臨床意義。但本研究不足之處在于，僅納入了NSCLC作為研究對象，而小細胞肺癌病人中血清fractalkine表達情況以及是否有診斷、預后、療效評估價值尚不能明確，有待下一步積累充足的小細胞肺癌病例，進行觀測研究。

4 結(jié)論

NSCLC病人血清fractalkine升高，與病人腫瘤負荷、MVD有關(guān)，可作為診斷、評估病情及療效的標志物，并有望為NSCLC治療帶來新的靶點與思路。