大鼠椎間融合模型的建立以及力學測試

陳洪籌,林宏生,羅美香,陳詩強

(1.深圳市寶安區(qū)石巖人民醫(yī)院骨科,廣東 深圳 518108;2.暨南大學第一附屬醫(yī)院骨科,廣東 廣州 510632)

脊柱領(lǐng)域中最為常見手術(shù)為脊椎融合手術(shù),多見于頸椎不穩(wěn)定、腰椎退行性滑脫及椎間盤損傷,通過脊椎融合手術(shù)展開并有效穩(wěn)定椎體,進一步降低神經(jīng)受壓所致疼痛［1］。當前相關(guān)研究指出,如何選擇融合模型并為試驗結(jié)果提供可靠數(shù)據(jù)為當前學者需要解決問題之一。目前多通過動物試驗?zāi)M脊椎椎體間植骨融合手術(shù)方法［2］。從動物上開展椎體間植骨融合,其手術(shù)操作復雜性高,椎間不穩(wěn)定及融合材料較少等因素制約下,模型不被學者廣泛應(yīng)用［3］。本次研究開展中,利用大鼠開展椎間植骨融合,配合影像學、生物力學及組織學下,驗證模型可行性,為后期研究開展提供可靠實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料:2019年1月～2021年5月期間選取純種健康雄性SD大鼠60只(由動物中心提供,8～10 w,200～250 g/只),隨機分為三組,各20只,A組:植入自體骨量0.3 cm3,B組:植入自體骨量0.2 cm3,C組:不植骨(空白對照組)。所有試驗大鼠集中管理,自由飲水,保證生活環(huán)境光線充足,定期通風。

1.2方法

1.2.1動物模型制作:麻醉藥物為3%戊巴比妥,麻醉以腹腔注射,取背部手術(shù)區(qū)域并備皮、消毒,切口為皮膚脂棘突兩側(cè)3 mm,筋膜切開將髂骨暴露,鈍性分離取1.5 cm×1 cm髂骨塊,延伸切口尾骨根部,分離并取出平髂后上棘連線外椎體(第一尾椎)后,取出上下相鄰椎間盤,配合牙科磨鉆打磨暴露松質(zhì)骨,對上下椎體位置置入植入物,間距固定7 mm。制備植骨床,髂骨、椎體制作成0.3 cm3(A組)、0.2 cm3(B組)、0.0 cm3(C組、空白對照),顆粒狀骨置入其中,4-0可吸收線封閉關(guān)閉切口。術(shù)后處理:每12 h予以丁諾菲止痛,維持2 d,術(shù)后3 d常規(guī)青霉素鈉肌內(nèi)注射,并自由飲食,常規(guī)術(shù)后10 d拆線。對試驗期間,并發(fā)癥發(fā)生及死亡、傷口愈合情況進行觀察。

1.2.2評價方法:①骨相關(guān)細胞因子試驗:分別在術(shù)后動物模型后0、3、5、7、14、30 d抽取靜脈血總計3 ml,分別監(jiān)測鼠骨鈣素(BGP)、骨堿性磷酸酶(BALP)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、骨形態(tài)蛋白(BMP-2)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的光密度值(OD值)。試驗采取酶聯(lián)免疫分析試劑盒開展,將獲取血液樣本放置在自然溫室下,自然放置凝固后,并以3 500 r/min離心10 min,取得血清放置在-20℃冰箱中冷凍保存,等待檢測。當血樣標本取全后,依據(jù)試劑盒說明書進行各項指標檢測;②放射學檢查:術(shù)后1、2、3個月在麻醉后,DR X線放射學對各個時間點展開檢查。依據(jù)有無骨形成、假關(guān)節(jié)/融合評分,由3個未參與試驗醫(yī)生觀察,依據(jù)放射學評分表進行評分:0分:無骨形成;1分:有少量新生骨形成或明確假關(guān)節(jié);2分:中等量新生骨形成,明確假關(guān)節(jié);3分:形成良好新生骨,可能假關(guān)節(jié);4分:良好新生骨形成,可能假關(guān)節(jié);5分:確定融合;③組織學觀察:4%多聚甲醛固定,5%硝酸脫鈣梯度脫水,透明,石蠟包埋,矢狀位切片,厚度為5 μm,HE、Masson染色后鏡下觀察;④生物力學驗證:半定量法:觸診法作為常見方式,利用手觸摸脊柱融合節(jié)段活動情況,并辨別融合效果,判斷是否存在假關(guān)節(jié)。有限元分析方法:通過三維CT并對提供數(shù)據(jù)造模,開展有限元分析,對相鄰椎間盤以及上下接觸面應(yīng)力情況分析。

2 結(jié)果

2.1大鼠試驗結(jié)局:試驗手術(shù)實施期間,術(shù)中失血只數(shù)為4只(A組3只,B組1只),術(shù)后感染死亡2只(A組1只,B組1只),5只中術(shù)后3 d有血腫,反復抽吸痊愈。3 d內(nèi)補齊所有死亡動物。融合率:4 w后隨機處死一半大鼠,手觸檢查:A組融合率為1只(10.00%),B組、C組未出現(xiàn)融合,6 w后處死另外一半大鼠,A組融合4只(40.00%),B組融合為4只(40.00%),C組為0只(0.00%)。

2.2組織學觀察:6 w后觀察三組切片標本結(jié)果,A組、B組中,融合組織有豐富骨橋,呈現(xiàn)成熟骨吸收,為類骨樣組織為表現(xiàn),互相連接形成骨小梁,被發(fā)育良好骨髓腔包繞。A組、B組未融合組:伴有新骨形成,少量新生骨、成熟骨組織,骨髓腔內(nèi)未完全再通,分布大量纖維樣組織,C組排列大量紊亂膠原纖維,未見到新生骨組織。

2.3A組、B組術(shù)后不同時間段骨相關(guān)細胞因子分析:兩組BGP、BALP、TGF-β、BMP-2、VEGF水平分別在術(shù)后0、3、5、7、14、30 d比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1,表2。

表1 A組術(shù)后不同時間段骨相關(guān)細胞因子分析

表2 B組術(shù)后不同時間段骨相關(guān)細胞因子分析

2.4三組不同時間段的X線評分:A組、B組術(shù)后2 w、術(shù)后3 w、術(shù)后4 w X線評分高于C組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 三組不同時間段的X線評分分,n=20)

3 討論

脊椎外科領(lǐng)域中,融合手術(shù)成為常見一類治療手段,但當前臨床應(yīng)用過程中,仍然存在較多問題未解決,如自體骨來源受限、取骨區(qū)域并發(fā)癥、假關(guān)節(jié)形成等［4］。當前為進一步解決上述問題,多數(shù)學者做出相應(yīng)研究。遵循研究對象,可分為臨床研究與動物實驗研究。但當前各項研究實施及應(yīng)用中,局限性較大,由于實驗開展中非控制性因素較多,其研究結(jié)果會對實驗結(jié)果造成干擾,引起偏倚［5］。動物實驗開展中,往往具備下述幾點優(yōu)勢:遵循相同動物種類、年齡、性別以及體重等所致結(jié)果因素可控性較高,此時個體之間所致差異性較小。同時,基于外科技術(shù)所致因素控制下,局部環(huán)境一致,可準確對療效改變進行評價。利用組織學方法,定性、定量評價試驗中獲取生物學結(jié)果［6］。利用破壞生物力學試驗對機械完整性評估。目前研究針對大鼠脊柱融合模型以外側(cè)路融合為主,臨床多采取上述椎間融合,但與臨床不符,本次研究依據(jù)大鼠脊柱解剖特點,設(shè)計全新脊柱融合模型制作方法［7］。

本次研究中,以大鼠第一尾椎作為動物模型建立部位,而上述部位暴露椎體后,極易取出,由于附著周圍肌肉組織中,伴有豐富血液利于術(shù)后恢復,融合骨塊生長速度較快。為此,靠近下方椎體未出現(xiàn)融合情況［8］。對其原因分析指出,與椎體位置較深不易取出相關(guān)聯(lián),且手術(shù)實施中會對神經(jīng)、血管造成損傷,依據(jù)上述因素綜合考慮,可取此處椎體更佳。上述結(jié)果顯示,外側(cè)入路融合手術(shù)整體成功率較高,表明本次試驗成功。通過組織學檢查,A組與B組融合組織中,表現(xiàn)出豐富骨橋、成熟骨吸收,特征表現(xiàn)為類骨樣組織,兩者相互連接后形成骨小梁,并被發(fā)育良好骨髓包圍［9］。C組以大量排列紊亂膠原纖維為主,未見到新生骨組織。此時經(jīng)組織學檢查后清晰觀察新生骨及骨量,但切片以外組織上無法明確觀察,會丟失融合塊信心［10］。針對上述因素,利用手觸檢查后,可有效辨別是否融合,經(jīng)X線檢查,X線對融合判斷存在一定局限性,且在動物試驗中,X線并非為判斷融合金標準,而是為一項參考標準。因此,試驗實施期間需配合其他檢查項目聯(lián)合進行,確定準確性［11］。大鼠椎間融合模型開展,據(jù)統(tǒng)計以后外側(cè)路融合中,假關(guān)節(jié)發(fā)生率為26.00%,而兔子后外側(cè)路融合中假關(guān)節(jié)發(fā)生率為33.00%～37.00%［12］。研究結(jié)果表明,對大鼠進行自體骨移植椎間融合情況分析,6 w后融合率40%,假關(guān)節(jié)比率為60%。進一步指出,非自然融合下具備成骨性,相比較自然融合,利用骨誘導材料或具有成骨性藥物所獲取結(jié)果中,經(jīng)手術(shù)方式與融合技術(shù)聯(lián)合下,可提供融骨成功率,減少并發(fā)癥率,與臨床椎間融合相符［13］。證實本次試驗開展具有一定臨床意義,后續(xù)可用于臨床,但仍需進一步深入研究探討。

綜上所述,本次試驗?zāi)Ｐ椭?將手術(shù)方式與融合技術(shù)相結(jié)合,進一步提高融合成功率,減少并發(fā)癥率,與臨床椎間融合相符。