外泌體miRNA在NAFLD疾病進展中的作用與診斷潛力

龐碧瀅,黃娜娜,黃曉霞,李 馨,熊文婷,孔 波,姚 焱

(廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510000)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)常與以肥胖、2型糖尿病、胰島素抵抗、血脂異常等代謝綜合征密切相關(guān),NAFLD全球患病率高達25%,我國NAFLD患病率已趕超歐美發(fā)達國家,成為我國最大的慢性肝病,嚴(yán)重危害國民健康和社會發(fā)展［1］。 NAFLD發(fā)病機制復(fù)雜,發(fā)展周期長,其病理機制尚未完全闡明,無高效的微創(chuàng)診斷工具［2］。近年多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞來源的外泌體miRNA串?dāng)_細(xì)胞間信息交流,調(diào)控脂肪肝、肝臟炎性反應(yīng)、肝纖維化的形成,參與NAFLD疾病各階段的發(fā)展,是潛在的非侵入性生物標(biāo)志物,具有NAFLD疾病分期診斷潛力。本文就外泌體miRNA對脂肪肝、肝臟炎性反應(yīng)和肝纖維化的影響,探討外泌體miRNA作為生物標(biāo)志物在NAFLD疾病中的作用機制和診斷價值,為其在NAFLD進展中的基礎(chǔ)研究和診斷應(yīng)用提供新的見解。

1 外泌體miRNA的生物形成

miRNA作為短的非編碼序列,廣泛表達且穩(wěn)定存在,是調(diào)節(jié)基因表達的重要手段。成熟的miRNA與其他蛋白等成分運輸進入細(xì)胞外囊泡(EVs),根據(jù)大小和來源,EVs主要分為外泌體、微囊泡(MVs)和凋亡小體,EVs通過質(zhì)膜向外出芽的微囊泡途徑以及內(nèi)體膜內(nèi)向出芽的外泌體途徑進行細(xì)胞釋放,是運輸細(xì)胞間和組織器官間的通訊及細(xì)胞外循環(huán)生物標(biāo)志物的重要載體,對疾病診斷和預(yù)后具有重要意義［3］。成熟的miRNA常通過誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)相關(guān)途徑、miRNA基序介導(dǎo)的異質(zhì)性核蛋白(hnRNPs)依賴途徑、神經(jīng)酰胺依賴途徑和3′miRNA序列依賴途徑進入外泌體中,被釋放出細(xì)胞,通過與受體細(xì)胞膜融合、吞噬作用或配體受體結(jié)合的方式傳遞給受體細(xì)胞,進行細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［3-4］。

2 肝臟外泌體miRNA的主要來源

影響NAFLD疾病的外泌體miRNA主要來自脂肪組織、免疫細(xì)胞和肝臟細(xì)胞的分泌。脂肪組織作為動態(tài)的內(nèi)分泌器官,是外泌體miRNAs的主要來源,脂肪組織代謝和功能受損釋放的miRNAs與肥胖相關(guān)疾病發(fā)病機制密切相關(guān)［5］。脂肪組織和肝臟等主要代謝器官在功能受損時,脂肪組織中的脂肪細(xì)胞和免疫細(xì)胞改變循環(huán)中外泌體miRNA池,脂肪組織來源外泌體miRNA常將脂質(zhì)過剩信號傳導(dǎo)至肝臟,引起肝臟脂質(zhì)堆積,脂肪組織駐留的巨噬細(xì)胞的活化與脂毒性的雙重作用加劇NASH的發(fā)生［6］。肝臟健康或受損時,肝臟自身分泌的外泌體miRNA介導(dǎo)肝細(xì)胞間,肝實質(zhì)細(xì)胞與肝非實質(zhì)細(xì)胞間重要的通訊連接,肝臟免疫細(xì)胞和肝非實質(zhì)細(xì)胞活化促進肝臟炎癥因子和纖維化產(chǎn)生［7-8］。脂肪組織將外泌體miRNA分泌至肝臟調(diào)節(jié)代謝,肝臟也通過感知不同的代謝狀態(tài)分泌外泌體miRNA發(fā)送相應(yīng)的信號以應(yīng)對脂質(zhì)過載時的代謝變化［9］。外泌體miRNAs是連接肝臟和脂肪組織內(nèi)分泌調(diào)節(jié)回路的基礎(chǔ)。目前,串?dāng)_NAFLD發(fā)病的不同組織來源外泌體miRNA的作用機制仍是一大研究挑戰(zhàn)。

3 外泌體miRNA在NAFLD疾病發(fā)展中的作用

NAFLD是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn),脂質(zhì)大量堆積,持續(xù)性NAFLD進一步導(dǎo)致肝細(xì)胞的脂肪毒性、庫普弗細(xì)胞的氧化應(yīng)激升高和促炎因子的激活以及肝星狀細(xì)胞的活化,促進NAFLD的發(fā)展。脂肪組織、免疫細(xì)胞和肝臟細(xì)胞來源的外泌體miRNA與肝細(xì)胞間的信號通訊在脂肪變性、肝臟炎性反應(yīng)和肝纖維化發(fā)生過程中起到至關(guān)重要的作用。因此,了解不同來源外泌體miRNA與脂質(zhì)代謝、炎性反應(yīng)和肝纖維化的串?dāng)_機制,對認(rèn)識NAFLD疾病發(fā)展的基礎(chǔ)研究現(xiàn)狀有重要意義。

3.1外泌體miRNA與脂肪肝:體內(nèi)循環(huán)中的脂肪酸超過組織儲存和氧化能力時,游離脂肪酸被攝入肝細(xì)胞內(nèi),脂肪酸在肝內(nèi)代謝失衡,脂質(zhì)大量堆積,容易引起脂肪變性［10］。外泌體miRNA在脂質(zhì)合成、脂肪酸氧化等脂質(zhì)代謝中起重要調(diào)節(jié)作用。脂肪細(xì)胞衍生的外泌體(ADEs)含豐富的miR-122,miR-122直接結(jié)合NAD依賴性去乙?；?Sirt1)的3′UTR抑制其表達,Sirt1過表達可逆轉(zhuǎn)ADEs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、糖脂代謝、肝臟炎性反應(yīng)和纖維化的增加,抑制ADEs中miR-122可緩解NAFLD的進展、脂質(zhì)和糖代謝、肝臟炎性反應(yīng)和纖維化［11］。研究表明,miR-122通過靶向Sirt1抑制LKB1/AMPK通路促進肝臟脂肪生成［12］。抑制miR-122可阻斷TLR4/MyD88/NF-κB p65信號通路,緩解油酸誘導(dǎo)的人原代肝細(xì)胞脂質(zhì)積累和炎性反應(yīng)［13］?？芍?富含miR-122的外泌體對降低脂肪酸β氧化,誘導(dǎo)脂肪變性形成脂肪肝的作用尤為突出。除了外泌體miR-122外,肥胖小鼠外泌體miR-192、miR-27a-3p和miR-27b-3p增加,降低脂肪組織和肝臟中過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)表達和脂肪酸氧化能力,肝臟吸收過量脂肪酸,誘發(fā)肝臟脂肪變性［14］。miR-199a-5p在小鼠脂肪組織和HEK293細(xì)胞的外泌體中高表達,下調(diào)哺乳動物不育20樣激酶1 (MST1)表達,影響固醇調(diào)控序列結(jié)合蛋白(SREBP-1c)表達和AMPK信號級聯(lián),上調(diào)肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(CPT1α)和脂肪酸合酶(FASN)的表達,抑制脂肪分解,促進肝脂滴形成,加劇肝細(xì)胞脂質(zhì)積累,使用含anti-miR-199a-5p的外泌體可減輕脂肪變性［15］。在脂肪肝形成過程中,脂肪組織常通過外泌體miRNAs將脂質(zhì)代謝失調(diào)的信號傳導(dǎo)至肝臟,在肝臟脂肪酸氧化、脂肪合成與分解等脂質(zhì)代謝過程起動態(tài)調(diào)節(jié)作用,誘導(dǎo)肝臟吸收過量游離脂肪酸,大量蓄積脂肪。

3.2外泌體miRNA與肝臟炎性反應(yīng):脂毒性肝細(xì)胞周圍的中性粒細(xì)胞浸潤是NASH的標(biāo)志性特征,脂肪組織巨噬細(xì)胞的數(shù)量和狀態(tài)與炎性反應(yīng)緊密相關(guān),巨噬細(xì)胞從抗炎的M2型轉(zhuǎn)換成促炎的M1型的過程中,產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子,加劇炎性反應(yīng)。脂肪毒性和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)在NASH的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用,驅(qū)動脂肪肝向更加嚴(yán)重的NASH演變［16］。脂毒性損傷可誘導(dǎo)肝細(xì)胞源的外泌體miR-192-5p高水平釋放,通過調(diào)節(jié)Rictor/Akt/FoxO1信號通路,介導(dǎo)促炎巨噬細(xì)胞的激活,誘導(dǎo)一氧化氮合酶、白細(xì)胞介素6和腫瘤壞死因子α表達增加,同時抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白雷帕霉素不敏感伴侶(Rictor)的蛋白表達,從而進一步抑制Akt和叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子O1 (FoxO1)的磷酸化水平,誘導(dǎo)炎性反應(yīng),外泌體miR-192-5p是NASH的潛在無創(chuàng)生物標(biāo)志物和治療靶點［17］。脂肪毒性還通過誘導(dǎo)肝細(xì)胞溶酶體功能障礙,抑制細(xì)胞外囊泡的降解,增加外泌體miR-122-5p釋放,引起M1巨噬細(xì)胞極化發(fā)生炎性反應(yīng),因此,改善溶酶體功能并抑制miR-122水平可能是NASH潛在的治療手段［18］。抑制細(xì)胞外囊泡相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP2)可消除細(xì)胞間肝miR-122向肝巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)移并減少性反應(yīng)［19］。此外,研究發(fā)現(xiàn)肝巨噬細(xì)胞-庫普弗細(xì)胞(KCs)在NASH的發(fā)病中起重要作用,KCs產(chǎn)生內(nèi)源性miR-690,通過外泌體分泌到肝細(xì)胞、肝巨噬細(xì)胞(RHMs)和肝星狀細(xì)胞(HSC)中,直接抑制肝星狀細(xì)胞中的纖維生成、RHMs中的炎性反應(yīng)和肝細(xì)胞中的新生脂肪生成,庫普弗細(xì)胞miR-690的特異性敲除可促進NASH發(fā)?。?0］。有研究表明,肥胖小鼠中性粒細(xì)胞來源的外泌體miR-223被肝細(xì)胞上的低密度脂蛋白受體(LDLR)選擇性攝取,抑制肝巨噬細(xì)胞活化,減少活性氧的產(chǎn)生和促炎介質(zhì)的產(chǎn)生,中性粒細(xì)胞與肝細(xì)胞之間的通訊在控制NAFLD的進展中起著重要作用［6］。脂肪細(xì)胞源外泌體miR-34a分泌到巨噬細(xì)胞中,作為促炎的關(guān)鍵介質(zhì)通過抑制Kruppel樣因子4的表達來抑制M2極化,刺激炎性反應(yīng)發(fā)生,將脂質(zhì)過剩的信號傳遞給脂肪駐留的巨噬細(xì)胞,加劇肥胖誘導(dǎo)的包括肝臟在內(nèi)的全身炎性反應(yīng)和代謝失調(diào)［21］。這些機制表明外泌體miR-690、miR-122、miR-223和miR-34a是減少肝臟炎性反應(yīng)發(fā)生的干預(yù)靶標(biāo),脂毒性誘導(dǎo)的外泌體miRNAs介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化和遷移是推動肝臟發(fā)生炎性反應(yīng)損傷的主要因素。脂肪細(xì)胞、免疫細(xì)胞和肝細(xì)胞間外泌體miRNA信息的串?dāng)_,不僅加速肝細(xì)胞死亡,還促進NAFLD疾病向關(guān)鍵的NASH階段發(fā)展。因此,深入研究肝細(xì)胞、外泌體miRNA與巨噬細(xì)胞的互作機制和通訊交流,對延緩甚至阻斷NAFLD發(fā)展具有重要意義。

3.3外泌體miRNA與肝臟纖維化:肝纖維化發(fā)生在慢性肝損傷過程中,肝星狀細(xì)胞(HSCs)的活化是肝纖維化的關(guān)鍵原因。在免疫細(xì)胞、肝巨噬細(xì)胞造血干細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞間外泌體miRNA信息的串?dāng)_在驅(qū)動肝纖維化發(fā)生中都起著至關(guān)重要的作用。脂毒性肝細(xì)胞源性外泌體miR-1297過表達,通過上調(diào)肝星狀細(xì)胞中纖維化促進基因(PCNA)表達,下調(diào)磷酸酶-張力蛋白基因(PTEN)表達,調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路,促進肝星狀細(xì)胞的活化和增殖,加速NAFLD的進展［22］。酸感離子通道1a (ASIC1a)可導(dǎo)致HSC-T6細(xì)胞活化,活化的HSC-T6細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體miR-301a-3p被靜止的HSC-T6細(xì)胞重吸收,靶向B細(xì)胞易位基因1(BTG1),促使HSC活化,促進肝纖維化過程［23］。THP-1巨噬細(xì)胞的外泌體miR-103-3p可通過靶向Kruppel樣因子4(KLF4)促進HSC的增殖和活化,肝纖維化患者血清外泌體miR-103-3p是肝纖維化的生物標(biāo)志物,巨噬細(xì)胞和HSC之間的串?dāng)_在肝纖維化發(fā)病中起重要作用［24］。巨噬細(xì)胞可分化為促炎M1表型和抗炎M2表型,M1型巨噬細(xì)胞可促進肝纖維化的發(fā)展。M1巨噬細(xì)胞來源的外泌體miR-125b-5p過表達靶向抑制Star相關(guān)脂質(zhì)轉(zhuǎn)移域基因(Stard13),提高HSC中MMP2、TIMP金屬肽酶抑制劑1(TIMP1)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Ⅰ型膠原蛋白(COL1)和NF-κB的表達,促進HSC活化［25］。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的旁分泌外泌體miRNA是細(xì)胞間通訊的重要信使,富集在MSCs外泌體中的miR-148a通過抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)通路,靶向Kruppel樣因子6(KLF6),抑制巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng),防止肝臟纖維化,miR-148a通過KLF6/STAT3信號調(diào)節(jié)肝內(nèi)巨噬細(xì)胞功能,為肝纖維化提供了潛在的治療靶點［26］。

4 外泌體miRNA作為NAFLD疾病診斷的生物標(biāo)志物

外泌體miRNAs作為脂肪組織和肝臟基因表達的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子,介導(dǎo)組織細(xì)胞間信息串?dāng)_,參與NAFLD疾病各階段發(fā)生過程。

4.1目前NAFLD的診斷手段:侵入性的肝臟活檢仍是臨床NAFLD疾病診斷的主要手段,但其經(jīng)濟成本巨大、取樣誤差大、可及性和重復(fù)性低［27］。臨床中,與NAFLD相關(guān)的脂肪變性、肝實質(zhì)炎癥和纖維化三種病理特征可能共存于同一肝臟內(nèi),并且特定區(qū)域有不同病理程度,影響肝活檢評估肝臟狀態(tài)的可靠性［28］。近年研究聚焦于非侵入性評估手段,現(xiàn)已引入超聲、計算機斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)和質(zhì)子磁波譜等非侵入性成像檢測手段替代活檢,但這些技術(shù)嚴(yán)重依賴于專業(yè)人員和昂貴的設(shè)備［29-30］。因此迫切需要改進用于NAFLD疾病診斷分期的非侵入性微創(chuàng)工具。研究表明,外泌體miRNA參與NAFLD發(fā)展的病理生理過程,具有較高的特異性和敏感性、微創(chuàng)性、測量成本低、易量化等特點,在NAFLD疾病分期中具有巨大的診斷應(yīng)用潛力。

4.2外泌體miRNA在NAFLD疾病分期中的診斷價值:NAFLD嚴(yán)重程度的無創(chuàng)診斷手段有限。有研究根據(jù)NAFLD患者的炎性反應(yīng)、脂肪變性、腫脹評分和NAFLD活動評分(NAS),分析外泌體miRNAs譜、臨床及生化指標(biāo)與mRNA表達的相關(guān)性,證實血清外泌體miRNAs可用于評估NAFLD疾病分期,這有助于確定NAFLD治療的潛在靶點［31］。血清外泌體的相關(guān)指標(biāo)可評價NAFLD和肝癌患者的嚴(yán)重程度,外泌體miRNA可用于診斷和預(yù)后評估［32-33］。miR-34a、miR-122和miR-21在肝細(xì)胞中豐度高,能反映肝臟毒性,是調(diào)控NAFLD發(fā)生發(fā)展的分子途徑中研究廣泛的miRNA。NAFLD患者肝臟miR-34a的表達水平隨著疾病進展而不斷升高,通過增加線粒體連接蛋白p66Shc的表達來增加肝細(xì)胞凋亡,將氧化應(yīng)激信號傳遞到凋亡,同時,miR-34a/SIRT1/p53信號通路也在肝細(xì)胞中特異性激活,參與肝細(xì)胞凋亡和HSC活化,肝細(xì)胞分泌的miR-34a促使NAFLD發(fā)展到NASH階段［34-35］。miR-122是人原代細(xì)胞高水平的肝臟特異性miRNA,由脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞分泌,在NAFLD早期脂肪肝階段中,肝臟miR-122高水平存在,促進脂肪肝的形成,隨著NASH的進展和纖維化的進展逐漸降低［36］。miR-21的表達水平隨著NAFLD的進展而升高,在脂質(zhì)堆積階段受STAT3調(diào)控,靶向PPARα促進脂肪變性,還通過抑制肝細(xì)胞核因子4α(HNF4α)、PTEN和LDL受體相關(guān)蛋白6(LRP6)等基因表達,活化肝星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)誘導(dǎo)纖維化,促進NAFLD向NASH發(fā)展,并在肝硬化和肝癌中保持高水平［36］。目前大部分外泌體miRNA的細(xì)胞來源不明確,但在體液中穩(wěn)定存在,分泌到血液循環(huán)外泌體miRNA已被證明可作為特定人類疾病的生物標(biāo)志物。血液miRNA譜分析證實外泌體miRNA具有改善NAFLD/NASH診斷的潛力,miR-122、miR-34a和miR-192的升高有助于區(qū)分NASH和NAFL,miR-122和miR-34a可區(qū)分NAFLD和健康對照狀態(tài)以及NASH和NAFL,診斷準(zhǔn)確性較高,miR-34a、miR-122和miR-99a這類miRNA 作為總的血清學(xué)生物標(biāo)志物對NAFLD疾病分期具有較好的診斷效果,miRNA對NASH的診斷效果優(yōu)于NAFLD,在區(qū)分NASH和NAFL方面具有很高的準(zhǔn)確性［37-38］。

5 小結(jié)

NAFLD發(fā)病機制的復(fù)雜性仍是開發(fā)高效診斷工具和有效治療方法的重大挑戰(zhàn),近年許多研究揭示不同細(xì)胞來源外泌體miRNA在人類NAFLD發(fā)病中的串?dāng)_,是該疾病演變機制的關(guān)鍵,外泌體miRNA作為NAFLD疾病分期的生物標(biāo)志物和作為延緩或阻止疾病進展的治療靶標(biāo)均表現(xiàn)出巨大的前景,但作為一項新的診斷治療工具還處在早期研究階段,許多機制研究尚未明晰,深入研究外泌體miRNA在NAFLD進展中的作用機制,將有助于診斷工具開發(fā)和臨床治療。