Nrf2-ARE信號通路影響糖尿病心肌梗死氧化應激的機制研究

劉平方,蔡承哲,馮小倩,葉賢區(qū),許卓帆

(廣州市第十二人民醫(yī)院,廣東 廣州 510620)

冠心病(CHD)病發(fā)的重要危險因素之一即為糖尿病(DM),其在心血管疾病的整個發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用［1］。近年調查顯示,CHD的發(fā)病率已呈現(xiàn)下降趨勢,但合并DM者卻日益增多［2］。而DM合并CHD患者死亡風險相對更高,可促使心肌發(fā)生惡化,對患者預后生活質量產生嚴重的影響［3］。有研究顯示,氧化應激損傷可加重DM患者心肌梗死的程度,而Nrf2-ARE信號通路是一種內源性抗氧化應答的機制,在氧化應激調控領域地位顯著［4］。一方面,氧化應激可致使Keap1-Nrf2復合體發(fā)生解離,增加游離Nrf2的比例,而細胞質中的Nrf2可以通過核膜進入細胞核中,對下游的二相解毒酶基因和抗氧化蛋白具有上調作用,進而產生氧化應激抑制作用［5-6］。氧化應激還可促進Nrf2蛋白的合成。相關研究顯示,HO-1等對Nrf2-ARE信號通路產生保護作用的內源性基因［7］。故本文探討Nrf2-ARE信號通路對糖尿病心肌梗死大鼠氧化應激的影響,并對其作用機制進行研究,為糖尿病心肌梗死患者的臨床診治提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物:60只清潔級別SD雄性大鼠,體重(156.87±12.28)kg,均購于南京斯科瑞生物科技有限公司。鏈脲佐菌素(STZ)上海金畔生物科技有限公司。本次試驗經過本院醫(yī)學倫理委員會同意。

1.2造模與分組［8-9］:采用高熱量飲食+STZ 注射方法制備2型糖尿病模型40只,隨機分為糖尿病組(DM組)和糖尿病合并心肌梗死組(DMI組)兩組,各20只。其中DMI組再通過結扎前降支的方式制備心肌梗死模型,另取20只健康大鼠作為空白組。其中糖尿病大鼠建模方法:采用STA注射+高熱量飲食的方式制備糖尿病大鼠模型,高脂飼料喂養(yǎng)6 w以后,按照30 mg/kg STZ的量一次性腹腔注射,之后對尾血血糖水平采用血糖儀(G086型;湖南達優(yōu)醫(yī)療科技有限公司)進行測定,明顯多尿且血糖值不小于16.7 mmol/L即為建模成功。心肌梗死建模方法:在呼吸機輔助下,左側2～3肋骨間進行開胸手術,于肺動脈圓錐和左心耳交界位置下方2 mm處進行前降支結扎處理。當近心尖的左室前壁變?yōu)榘祷疑?收縮力消失或者降低時;心電圖出現(xiàn)Q波以及ST段弓背向上抬高,即為建模成功。

1.3活性氧(ROS)、活性氮(RON) :各組大鼠均喂養(yǎng)1 w后,取心肌組織,采用連續(xù)緩沖液進行洗滌處理,取出適量心肌組織,再向其中加入適量的磷酸鉀緩沖液以配成10%勻漿液,離心分離,取上清。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)對心肌組織ROS、RON水平進行測定,試劑盒購于艾美捷科技有限公司。

1.4Nrf2-ARE信號通路相關因子的表達［10-11］:通過Western印跡法對HO-1、Nrf蛋白進行檢測,取0.1 mg保存的心肌組織,采用裂解液500 μl進行裂解處理,冰浴后離心10 min,取部分上清,心肌組織HO-1、Nrf蛋白采用BCA蛋白測試試劑盒進行測定。采用上樣緩沖液對剩余上清進行封閉處理,10 min沸水浴后,-70℃保存。各個樣品進行凝膠電泳上樣,之后轉移至聚偏氟乙烯微孔膜,脫脂奶粉進行60 min的封存,在4℃條件下進行一抗封閉處理,PBST進行3次洗膜,15 min/次,二抗(1∶4 000)處理,常溫條件下進行60 min孵育,PBST漂洗,采用凝膠系統(tǒng)對上述進行成像,目的條帶灰度值通過Labwork4.6進行分析,其中HO-1采用β-actin校正,Nrf2采用H1校正。

1.5Ⅱ相解毒酶表達:取1.3中所述心肌組織上清液,通過氧化酶活性,采用分光光度法對心肌組織過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)水平進行測定,試劑盒購于上海研謹生物科技有限公司。

2 結果

2.1各組大鼠心肌組織Nrf2-ARE信號通路相關因子的表達:與空白組相比,DM組和DMI組大鼠心肌組織HO-1、Nrf表達水平逐漸降低,且DMI組降低更為顯著,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1和圖1。

a、b、c分別表示DMI組、DM組、空白組

表1 各組大鼠心肌組織Nrf2-ARE信號通路相關因子的表達

2.2各組大鼠心肌組織ROS、RON水平表達:與空白組相比,DM組和DMI組大鼠心肌組織ROS、RON表達水平逐漸升高,且DMI組升高更為顯著,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠心肌組織ROS、RON水平表達

2.3糖尿病心肌梗死大鼠氧化應激與Nrf2-ARE信號通路的相關性:經Pearson相關性分析顯示,糖尿病心肌梗死大鼠心肌組織ROS表達水平與HO-1、Nrf表達水平呈負相關,心肌組織RON表達水平與HO-1、Nrf表達水平呈負相關,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 糖尿病心肌梗死大鼠氧化應激與Nrf2-ARE信號通路的相關性

2.4各組大鼠心肌組織CAT、SOD的表達水平比較:與空白組相比,DM組和DMI組大鼠心肌組織CAT、SOD表達水平逐漸升高,且DMI組升高更為顯著,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組心肌組織大鼠CAT、SOD的表達水平比較

3 討論

研究顯示,DM的病發(fā)與內分泌失調、氧化應激、環(huán)境、感染等因素關系密切,其中MI是重要的一種并發(fā)癥［12］。氧化應激是機體在受到相關外界刺激時,體內產生的ROS和RON高活性分子過多,超出機體清除能力,會致使機體氧化還原系統(tǒng)失調,進而引發(fā)細胞內蛋白質等氧化性損傷,最終造成組織器官損傷和細胞凋亡［13］。為維持機體氧化還原平衡,機體會對多余的自由基進行清除。而Nrf2-ARE信號通路是近年抗氧化研究的熱點,其介導的多種基因表達被認為是抗氧化的重要機制［14］。Nrf2-ARE信號通路的激活可以有效降低ROS和RON的產生,同時還可改善機體胰島素抵抗狀況,糾正患者生化功能紊亂,從而發(fā)揮抗氧化應激的功能,在DM合并心肌梗死的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用［15］。

Nrf2-ARE通路的核心分子是Nrf2-和HO-1。有研究顯示,其在解毒、免疫調節(jié)、抗組織損傷抗炎、抗氧化等過程均具有重要作用,通過調節(jié)此通路可以發(fā)揮抗心臟、抗動脈粥樣硬化等作用［16］。而氧化應激產生的ROS和RON會對細胞內大分子生物的生理功能產生間接或直接的影響,是引發(fā)糖尿病心肌梗死患者的重要病理基礎［17］。文中相關性分析顯示,糖尿病心肌梗死大鼠Nrf2-ARE通路與氧化應激反應呈現(xiàn)負相關,這可能是由于機體在受到氧化應激損傷時,會形成一種復雜的抗氧化應激系統(tǒng)。近年研究顯示,Nrf2-ARE通路在抵抗外源性有毒物質和氧化應激損傷中作用顯著,是目前最重要的一種內源性抗氧化通路［18］。有研究顯示,對敲除Nrf2基因的小鼠,誘導性和基礎性基因的表達顯著降低,而小鼠ROS和RON生成量大大增加,氧化應激損傷程度增加,這也說明了Nrf2-ARE通路在小鼠氧化應激調控過程中作用顯著［19］。本文結果顯示,糖尿病心肌梗死組大鼠心肌組織CAT、SOD表達水平更高,故Nrf2-ARE通路可能是通過對CAT、SOD的表達進行調控,進而實現(xiàn)抗氧化應激的作用。這主要是由于CAT、SOD是Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的代表物質,可以有效地對機體系統(tǒng)內的自由基進行有效清除,從而對ROS和RON的產生具有較好的預防作用。SOD是以超氧化物陰離子自由基為主要底物,可以對體內歧化作用生成過氧化氫產生催化作用,是機體氧自由基重要的清除劑［20］。另外,在外界化學物質或者自由基的刺激下,Nrf2可以被快速磷酸化,從而解離Keap1,兩者均被活化,被活化的Nrf2在進入細胞核以后,會與ARE相互結合,進而對下游的蛋白酶體/分子伴侶、Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶等基因表達和轉錄基因產生啟動作用,促使CAT、SOD等分子的大量表達,起抵抗外界有害刺激的功效［21］。而HO-1等氧化還原基因還是一種重要的內源性保護基因。上述蛋白相互之間會產生一種抗氧化的協(xié)同作用,對過量的ROS和RON等分子產生清除效果,具有較好的細胞氧化應激對抗和氧化還原狀態(tài)維持作用［22］。

綜上所述,糖尿病心肌梗死大鼠Nrf2-ARE信號通路可能通過CAT、SOD分子對其氧化應激反應進行調控,進而避免細胞和組織免受損傷,具有一定的臨床應用價值。